ई। कोली के अल्ट्रासोनिक lysis

• ई कोलाई बैक्टीरिया सूक्ष्म जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में सबसे अधिक इस्तेमाल किया बैक्टीरिया होते हैं।
• अल्ट्रासोनिक सेल disruptors ई कोलाई के lysis के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने।
• तीव्र अभी तक ठीक नियंत्रणीय गुहिकायन और कतरनी बलों पूरा विघटन और उच्च निष्कर्षण पैदावार (जैसे प्रोटीन, डीएनए) में परिणाम।

Cavitation द्वारा सेल व्यवधान

अल्ट्रासोनिक जांच-प्रकार homogenizers लगभग साथ कार्य करते हैं। (20kHz में) प्रति सेकंड 20,000 चक्र और तरल पदार्थ या supsensions में गुहिकायन का कारण है। निर्वात की तरह दबाव और उच्च तापमान है कि कोशिकाओं के अलावा आंसू की ध्वनिक गुहिकायन सूक्ष्म क्षेत्रों। हालांकि तापमान कई हजार डिग्री सेल्सियस तक पहुंच सकता है, गुहिकायन संस्करणों इतना छोटा है कि वे इस प्रक्रिया में काफी गर्मी नहीं है। अल्ट्रासाउंड ध्वनिक गुहिकायन उत्पन्न और कतरनी बलों आर-पार जाना या कोलाई की कोशिका झिल्ली को तोड़ने – अल्ट्रासोनिक homogenizer की डिवाइस सेटिंग के आधार पर।

अल्ट्रासोनिक Lysis के लाभ

• lysis सटीक नियंत्रण (तीव्रता, आयाम, तापमान)
• विशिष्ट नमूने के लिए इष्टतम रूपांतरण
• तापमान नियंत्रण
• बहुत छोटा करने के लिए बहुत बड़ी नमूनों के लिए (μL लीटर तक)
• शुद्ध यांत्रिक उपचार
• रैखिक उत्पादन के लिए प्रयोगशाला से पैमाने-अप

जबकि रासायनिक और enzymtic lysis समस्या हो सकती है – के बाद से रासायनिक lysis प्रोटीन संरचनाओं में परिवर्तन और शुद्धि की समस्याओं और एंजाइमी lysis लागू कर सकते हैं लंबे समय तक ऊष्मायन बार की आवश्यकता है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है – अल्ट्रासोनिक विघटन एक परिष्कृत, तेजी से सेल विघटन विधि है।
अल्ट्रासोनिक लाइसिस केवल यांत्रिक बलों पर आधारित है। कोई रसायन नहीं जोड़ा जाता है, सोनिकेशन कतरनी बलों द्वारा सेल की दीवार को तोड़ता है। रासायनिक लाइसिस प्रोटीन संरचना को बदल सकता है और शुद्धिकरण समस्याओं का परिचय देता है। एंजाइमेटिक व्यवधान के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है और यह प्रजनन योग्य नहीं है। ई.कोलाई बैक्टीरिया कोशिकाओं का अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान तेज, सरल, विश्वसनीय और प्रजनन योग्य है। यही कारण है कि हिल्स्चर अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग नमूना तैयार करने, प्री-एनालिटिक्स, इन-विट्रो डियागॉन्स्टिक्स और कई गुना परख के लिए दुनिया भर की जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगशालाओं में किया जाता है।

जनरल सिफारिशें

Sonication सेल निलंबन की बहुत छोटी, मध्यम और बड़ी मात्रा lysing के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है – 100 एल / घंटा से ऊपर पिको-लीटर से (एक अल्ट्रासोनिक प्रवाह सेल का उपयोग)। कोशिकाओं तरल कतरनी और गुहिकायन द्वारा lysed। डीएनए भी sonication के दौरान sheared है, तो यह सेल निलंबन के DNase जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है।
तापमान नियंत्रण:
नमूना पूर्व ठंडा और बर्फ पर sonication के दौरान नमूना रखकर, नमूना नमूना के थर्मल गिरावट आसानी से रोका जा सकता है।
आदर्श रूप में, नमूने lysis के दौरान बर्फ ठंडा रखा जाना चाहिए, लेकिन सबसे अधिक नमूनों के लिए यह पर्याप्त अगर तापमान संस्कृति या ऊतक स्रोत के तापमान से ऊपर नहीं वृद्धि करता है. इसलिए यह सिफारिश की है, बर्फ पर निलंबन रखने के लिए और 5-10 सेकंड के कई छोटे ultrasonics दालों के साथ sonicate और 10-30 सेकंड के ठहराव. विराम के दौरान, गर्मी एक कम तापमान फिर से स्थापित करने के क्रम में नष्ट कर सकते हैं। बड़े सेल के नमूने के लिए, ठंडा जैकेट के साथ विभिन्न प्रवाह सेल रिएक्टरों उपलब्ध हैं.

ई कोलाई lysates की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल

अभिव्यक्ति विश्लेषण और पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि

ई कोलाई गोली एक अल्ट्रासोनिक प्रणाली के साथ sonicated था UP100H (Hielscher)। इस उद्देश्य के लिए, सेल गोली को ठंडा एलिसिस बफर (50 मिमी ट्राइस-एचसीएल पीएच = 7.5, 100 मिमी NaCl, 5 मिमी डीटीटी, 1 एमएम पीएमएसएफ) में दोबारा लगाया गया था और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया गया था। फिर, सेल निलंबन को 10 एस के 10 छोटे विस्फोटों के साथ sonicated किया गया था और ठंडा करने के लिए 30 एस के अंतराल के बाद। अंत में, 14000 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासेन्ट्रिफुगेशन द्वारा सेल मलबे को हटा दिया गया था। आरपीआर अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए, सतह पर तैरनेवाला 12% polyacrylamide जेल पर चलाया गया था और एसडीएस-पेज और पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया था। आरपीआर का शुद्धीकरण नी का उपयोग करके किया गया था^{2 +}-NTA राल (Invitrogen, संयुक्त राज्य अमरीका) निर्माता की मार्गदर्शिका के अनुसार। इस चरण में, देशी शोधन विधि का इस्तेमाल किया गया था। शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता 12% पॉलीएक्रिलमाइड जेल और बाद Coomassie नीले रंग धुंधला पर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर का आकलन किया गया था। शुद्ध प्रोटीन एकाग्रता माइक्रो बीसीए प्रोटीन परख किट (पियर्स, यूएसए) द्वारा मापा गया था। (Azarnezhad एट अल। 2016)

सेल ग्रोथ, Crosslinking और ई कोलाई सेल अर्क की तैयारी

SeqA और आरएनए पोलीमरेज़ चिप चिप ई कोलाई MG1655 या MG1655 ΔseqA के लिए एक आयुध डिपो के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हो गया था₆₀₀ फॉर्मल्डेहाइड (37%) प्रति मिलीलीटर माध्यम के 27 μl से पहले 50 मिलीलीटर एलबी (+ 0.2% ग्लूकोज) में लगभग 0.15 (अंतिम एकाग्रता 1%) जोड़ा गया था। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी गति से हिलने (100 आरपीएम) पर क्रॉसलिंकिंग का प्रदर्शन किया गया था, इसके बाद 10 मिलीलीटर 2.5 एम ग्लाइसीन (अंतिम एकाग्रता 0.5 एम) के साथ बुझ गया। गर्मी-सदमे के प्रयोगों के लिए, ई कोलाई एमजी 1655 65 मिलीलीटर एलबी माध्यम में 30 डिग्री सेल्सियस पर ओडी तक उगाया गया था₆₀₀ लगभग 0.3 में से। इसके बाद 30 मिलीलीटर संस्कृति को 43 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया गया और शेष 30 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया। क्रॉसलिंकिंग और क्वेंचिंग जैसा ऊपर वर्णित किया गया था, सिवाय इसके कि कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर धीमी गति से धीमा होने से पहले 5 मिनट के लिए 30 या 43 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्र किया गया था और ठंड टीबीएस (पीएच 7.5) के साथ दो बार धोया गया था। 1 मिलीलीटर लीस बफर (10 एमएम ट्राइस (पीएच 8.0), 20% sucrose, 50 मिमी NaCl, 10 मिमी ईडीटीए, 10 मिलीग्राम / एमएल lysozyme) में resuspension के बाद और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद 4 मिलीलीटर आईपी बफर, कोशिकाओं को 12 बार 30 सेकंड और 30 सेकंड ब्रेक के साथ बर्फ पर sonicated किया गया था UP400St अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर 100% शक्ति के साथ (Hielscher Ultrasonics GmbH)। 9000 ग्राम से कम 10 मिनट के लिए centrifugation के बाद, 800 सतह पर तैरनेवाला के μl aliquotes -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। (Waldminghaus 2010)

अधिक उत्पादन और एंजाइम की शुद्धि।

decahistidine (His10) -tagged प्रोटीन की अधिक उत्पादन के लिए, ई कोलाई BL21 (DE3) pET19b निर्माण के साथ बदल गया था। एक रात preculture centrifugation द्वारा काटा गया था, और 1% एक अभिव्यक्ति संस्कृति टीका करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। pET19mgtB ले जाने कोशिकाओं (ओवर ड्राफ्ट 600 एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व जब तक 22 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे₆₀₀) 0.7 की। संस्कृति 17 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित किया गया और 100 माइक्रोन IPTG द्वारा प्रेरित किया गया था। 16 घंटे के बाद, संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर पर 7500 × छ centrifugation द्वारा काटा गया था। कोशिकाओं में एक एस 2 सूक्ष्म टिप sonotrode साथ पीएच 7.4 से कम 50 मिमी फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 0.3 एम सोडियम क्लोराइड के साथ में resuspended और ultrasonication द्वारा प्रभावित हुआ UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, जर्मनी) 0.5 का एक चक्र और 75% की एक आयाम पर।
decahistidine-टैग GtfC के अधिक एक आयुध डिपो में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित किया गया था₆₀₀ 100 माइक्रोन IPTG साथ 0.6 की। कोशिकाओं तो, 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट काटा, और जैसा कि MgtB के लिए ऊपर कहा गया है lysed थे।
क्रूड सेल अर्क 15,000 × छ और 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuged थे सेल मलबे तलछट के लिए। स्पष्ट किया अर्क 1 मिलीलीटर HisTrap एफएफ क्रूड कॉलम एक ÄKTAprime प्लस प्रणाली (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग करने पर भेजा गया। एंजाइमों उनके द्वारा टैग किए गए प्रोटीन की ढाल क्षालन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार शुद्ध किया गया। Eluted प्रोटीन समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिमी पीबीएस, पीएच 7.4, 0.3 एम सोडियम क्लोराइड के साथ 1,000 संस्करणों के खिलाफ दो बार dialyzed थे। शुद्धि 12% एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था। प्रोटीन की एकाग्रता रोटी-क्वांट (कार्ल रोथ जीएमबीएच, कार्लज़ूए, जर्मनी) का उपयोग कर ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा निर्धारित किया गया था। (Rabausch एट अल। 2013)

ई कोलाई बैक्टीरिया से प्रोटीन का निष्कर्षण
ब्याज की एक चारा प्रोटीन (इस मामले में, Arabidopsis थालिअना की MTV1) एक जीएसटी टैग से जुड़े हुए और BL21 कोलाई (ई कोलाई) कोशिकाओं में व्यक्त किया है।
1. जीएसटी-MTV1 और जीएसटी में से एक गोली ले लो (50 मिलीलीटर के लिए इसी बैक्टीरियल संस्कृति) और 2.5 एमएल बर्फ ठंड निष्कर्षण बफर में प्रत्येक resuspend।
2. एक ultrasonicator का उपयोग करें UP100H जब तक वे, lysed रहे हैं जो कम अस्पष्टता और वृद्धि की चिपचिपाहट से निर्देशित होता है बैक्टीरियल कोशिकाओं को बाधित करने के ((2-5mL) छोटी मात्रा के लिए MS3 microtip-sonotrode से लैस)। यह बर्फ पर बाहर ले जाया गया है, और यह (जैसे 10 सेकंड sonicating बर्फ पर 10 सेकंड और इतने पर के बाद) के अंतराल में sonicate के लिए सिफारिश की है। देखभाल बहुत अधिक तीव्रता के साथ sonicate के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। अगर झाग या एक सफेद तलछट के गठन का पता चला है, तीव्रता को कम कर दिया जाना चाहिए।
3. 4 डिग्री सेल्सियस, 16,000 x 20 मिनट के लिए जी पर 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब को lysed बैक्टीरिया समाधान और अपकेंद्रित्र स्थानांतरित करें।

ई कोलाई में एलीसिन संशोधित प्रोटीन

5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic एसिड) (DTNB) परख द्वारा Sulfhydryl सामग्री का निर्धारण
एक ई कोलाई MG1655 रातोंरात संस्कृति MOPS न्यूनतम मध्यम (: 100 1) टीका करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। संस्कृति aerobically हो गया था जब तक 0.4 का एक A600 पहुँच गया था। संस्कृति तनाव के इलाज के लिए तीन 15 मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। एक अनुपचारित संस्कृति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। 0.79 मिमी allicin (128 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर^-1) या 1 मिमी diamide शेष दो संस्कृतियों प्रत्येक से एक के लिए जोड़ा गया है। संस्कृतियों 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट रहे थे। प्रत्येक संस्कृति के 5 मिलीलीटर centrifugation (8525 × छ, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) से काटा गया था। कोशिकाओं पीबीएस (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 1 मिलीलीटर के साथ दो बार बह गए₂एचपीओ₄, 2 मिमी के.एच.₂पीओ₄, पीएच 7.4, उपयोग से पहले anaerobically संग्रहीत) और centrifuged (13,000 × जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर व्यवधान से पहले कोशिकाओं को लीस बफर (6 एमएम गुआनिडिनियम एचसीएल, पीएच 7.4 के साथ पीबीएस) में दोबारा लगाया गया था (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher जीएमबीएच, जर्मनी) (3 × 1 मिनट)। सेल मलबे centrifugation (13,000 × छ, 4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) से pelleted किया गया था। सतह पर तैरनेवाला एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक 3.5 मिलीलीटर क्यूएस-मैक्रो क्युवेट (10 मिमी) को हस्तांतरित और lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मिश्रित किया गया था। नमूनों की विलुप्त होने एक Jasco वी 650 PSC-718 तापमान नियंत्रित सेल धारक (Jasco) कमरे के तापमान पर के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 412 एनएम पर नजर रखी गई थी। एक 3 मिमी dithiobis (2-nitrobenzoic एसिड) समाधान के 100μl जोड़ा गया था। विलुप्त होने से नजर रखी गई थी जब तक यह संतृप्ति पर पहुंच गया। thiol एकाग्रता की गणना विलुप्त होने गुणांक ε का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था₄₁₂ = 13,700 एम^-1 से.मी^-1 thio-2-nitrobenzoic एसिड (TNB) के लिए। सेलुलर thiol सांद्रता 6.7 × 10 के ई कोलाई कोशिकाओं की एक मात्रा के आधार पर गणना की गई^-15 लीटर और एक के एक सेल घनत्व₆₀₀ = 0.5 (समकक्ष 1 × 10⁸ कोशिकाओं मिलीलीटर^-1 संस्कृति)। (मुलर एट अल। 2016)

विवो Glutathione निर्धारण में

कोलाई MG1655 एक ए जब तक 200 की कुल मात्रा में MOPS न्यूनतम मध्यम में हो गया था₆₀₀ 0.5 का पहुंचा था। तनाव तनाव के लिए संस्कृति को 50 मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। 0.7 9 एमएम एलिसिन, 1 एमएम हीरा, या डिमेथिल सल्फोक्साइड (नियंत्रण) के साथ 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 4,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कटाई की जाती थी। केपीई बफर के 700μl में छर्रों के पुनर्वसन से पहले केपीई बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोया गया था। Deproteination के लिए, ultrasonication द्वारा कोशिकाओं के व्यवधान से पहले 10% (डब्ल्यू / वी) sulfosalicylic एसिड के 300l जोड़ा गया था (3 एक्स 1 मिनट; VialTweeter ultrasonicator)। Supernatants (30 मिनट, 13,000g, 4 डिग्री सेल्सियस) centrifugation के बाद एकत्र किए गए थे। Sulfosalicylic एसिड सांद्रता KPE बफर के 3 संस्करणों के अलावा द्वारा 1% तक की कमी कर रहे थे। कुल ग्लूटेथिओन और GSSG की माप जैसा कि ऊपर वर्णित प्रदर्शन किया गया। सेलुलर ग्लूटेथिओन सांद्रता ई की मात्रा के आधार पर गणना की गई 6.7 की कोशिकाओं कोलाई×10^-15 लीटर और एक के एक सेल घनत्व₆₀₀ 0.5 (1 के बराबर×10⁸ कोशिकाओं मिलीलीटर^-1 संस्कृति)। GSH सांद्रता के 2 [GSSG] कुल ग्लूटेथिओन से घटाव द्वारा गणना की गई। (मुलर एट अल। 2016)