E. Coli का अल्ट्रासोनिक लयन

E. coli जीवाणु सूक्ष्मजीवविज्ञान और जैवप्रौद्योगिकी में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले जीवाणु हैं।
अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक E. coli के लयन के लिए विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय परिणाम देते हैं।
तीव्र, फिर भी सटीक रूप से नियंत्रित किए जा सकने वाले कैविटेशन और अपरूपण बलों से पूर्ण विघटन होता है और निष्कर्षण की उच्च प्राप्ति मिलती है (जैसे प्रोटीन, DNA)।

E. coli के अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन को पसंदीदा विधि क्यों माना जाता है?

अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र या प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर E. coli के लयन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं, क्योंकि तीव्र अल्ट्रासाउंड कोशिका भित्तियों और झिल्लियों को कुशलतापूर्वक विघटित करता है। निम्नलिखित कारणों से E. coli के लयन के लिए प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है:

कोशिका भित्तियों का कुशल विघटन: E. coli की कोशिका भित्ति अर्धकठोर होती है और पेप्टिडोग्लाइकैन से बनी होती है, जिसे पारंपरिक लयन विधियों से तोड़ना कठिन हो सकता है। प्रोब प्रकार का अल्ट्रासोनिकेटर तीव्र अल्ट्रासोनिक तरंगें उत्पन्न करता है, जो कोशिकाओं के आसपास के द्रव में कैविटेशन बुलबुले बनाती हैं। जब ये बुलबुले ध्वस्त होते हैं, तो वे उच्च गति वाले द्रव जेट और आघात तरंगें उत्पन्न करते हैं, जिनसे कोशिका भित्तियों का यांत्रिक विघटन होता है और जैव-अणुओं जैसे कोशिकीय घटक प्रभावी ढंग से मुक्त हो जाते हैं।

अधिक गहराई तक प्रवेश: प्रोब / सोनोट्रोड द्वारा उत्पन्न अल्ट्रासोनिक तरंगें नमूने में गहराई तक प्रवेश कर सकती हैं, अधिक संख्या में E. coli कोशिकाओं तक पहुँच सकती हैं और उनका समान रूप से उपचार कर सकती हैं। इससे पूरे नमूने में अधिक एकसमान लयन सुनिश्चित करने में मदद मिलती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका विघटन की दक्षता बढ़ती है।

प्रसंस्करण में लगने वाले समय में कमी: प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर द्वारा दी जाने वाली ऊर्जा अत्यधिक केंद्रित और स्थानीयकृत होती है, जिससे कोशिकाओं का तीव्र और कुशल लयन होता है। बीड बीटिंग या एंज़ाइमी लयन जैसी अन्य विधियों की तुलना में, सोनिकेशन से E. coli का लयन कुछ मिनटों या यहाँ तक कि कुछ सेकंड में भी किया जा सकता है। जहाँ जमाने और पिघलाने जैसी कई वैकल्पिक तकनीकों में उपचार के कई चक्रों की आवश्यकता होती है, वहीं अल्ट्रासोनिक लयन एक ही प्रक्रिया चरण में कोशिकाओं को खोल देता है।

तापमान नियंत्रण: अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिकेटर तापमान सेंसर और स्मार्ट सॉफ़्टवेयर से सुसज्जित होते हैं, जिससे प्रक्रिया का अधिकतम तापमान निर्धारित किया जा सकता है। तापमान सीमा तक पहुँचने पर अल्ट्रासोनिकेटर अपने आप रुक जाता है और निर्धारित तापमान बिंदु तक पहुँचने पर सोनिकेशन प्रक्रिया शुरू कर देता है। नमूनों को बर्फ के स्नान में ठंडा करना नमूने का तापमान कम रखने और गर्मी के कारण नमूने का क्षरण रोकने का एक सरल तरीका है।

पैमाना बढ़ाने की क्षमता: प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर हाथ में पकड़े जाने वाले उपकरणों से लेकर बड़े पैमाने के औद्योगिक मॉडलों तक विभिन्न आकारों में उपलब्ध हैं। इससे वे प्रयोगशाला में कम आयतन वाले नमूनों के प्रसंस्करण या टीका उत्पादन अथवा अणुओं के जैवसंश्लेषण जैसे बड़े जैवप्रसंस्करण अनुप्रयोगों के लिए पैमाना बढ़ाने के अनुकूल होते हैं।

बहुउपयोगिता: अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग कोशिका लयन के अलावा DNA अपरूपण, प्रोटीन निष्कर्षण, ऊतक समांगीकरण, नैनोकण परिक्षेपण और पायसीकरण जैसे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। इसलिए, प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर में निवेश करने से अनुसंधान या औद्योगिक परिवेश में बहुउपयोगिता मिलती है।

UP200St जैसे प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर विश्वसनीय ऊतक होमोजेनाइज़र और कोशिका भंजक हैं, इसलिए आनुवंशिकी में नमूना तैयार करने के लिए इनका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जैसे E.coli के लयन के लिए

E.coli कोशिकाओं से प्रोटीन के कुशल निष्कर्षण के लिए अल्ट्रासोनिक प्रोब UP200St का उपयोग किया जाता है

प्रोब प्रकार का अल्ट्रासोनिकेटर E. coli के लयन के लिए कई लाभ प्रदान करता है। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों पर विश्वसनीय और सटीक नियंत्रण से वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए शक्ति, अवधि और नमूने के प्रबंधन जैसे परिचालन मापदंडों को अनुकूलित किया जा सकता है।

यह मार्गदर्शक बताता है कि प्रयोगशाला, विश्लेषण और अनुसंधान में लयन, कोशिका विघटन, प्रोटीन पृथक्करण तथा DNA और RNA के खंडीकरण जैसे नमूना तैयारी कार्यों के लिए किस प्रकार का सोनिकेटर सबसे उपयुक्त है। अपने अनुप्रयोग, नमूने के आयतन, नमूनों की संख्या और प्रसंस्करण दर के अनुसार आदर्श सोनिकेटर चुनें। Hielscher Ultrasonics के पास आपके लिए आदर्श पराश्रव्य समांगीकारक है!

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) में नमूना तैयार करने के चरण के रूप में अल्ट्रासोनिक DNA खंडीकरण का अक्सर उपयोग किया जाता है

0 – 15 min तक अल्ट्रासोनिकेशन के अधीन रखे गए E. coli EDL933 के जीनोमिक DNA के वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण। L, DNA लैडर को दर्शाता है।
(अध्ययन और चित्र: ©Basselet et al. 2008)

अल्ट्रासोनिक कैविटेशन द्वारा कोशिका विघटन

अल्ट्रासोनिक प्रोब-प्रकार के होमोजेनाइज़र लगभग 20,000 चक्र प्रति सेकंड (20kHz पर) की दर से काम करते हैं और द्रवों या निलंबनों में कैविटेशन उत्पन्न करते हैं। ध्वनिक कैविटेशन निर्वात जैसे दाब और उच्च तापमान वाले सूक्ष्म क्षेत्र उत्पन्न करता है, जो कोशिकाओं को तोड़ देते हैं। यद्यपि तापमान कई हज़ार डिग्री सेल्सियस तक पहुँच सकता है, कैविटेशन क्षेत्रों का आयतन इतना छोटा होता है कि वे प्रक्रिया को उल्लेखनीय रूप से गर्म नहीं करते। अल्ट्रासाउंड से उत्पन्न ध्वनिक कैविटेशन और अपरूपण बल E.coli जैसी जीवाणु कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में छिद्र बनाते हैं या उसे तोड़ देते हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अल्ट्रासोनिक तीव्रता, आयाम, ऊर्जा निवेश और तापमान जैसे प्रक्रिया मापदंडों पर सटीक नियंत्रण की सुविधा देते हैं। इससे अल्ट्रासोनिक लाइसिस प्रक्रिया को कोशिका के प्रकार, कोशिका संवर्धन और प्रक्रिया के लक्ष्य के अनुरूप सर्वोत्तम ढंग से समायोजित किया जा सकता है।

अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लाभ

लाइसिस का सटीक नियंत्रण (तीव्रता, आयाम, तापमान)
विश्वसनीय, पुनरुत्पादनीय परिणाम
विशिष्ट नमूनों के अनुरूप सर्वोत्तम अनुकूलन
तापमान नियंत्रण
बहुत छोटे से लेकर बहुत बड़े नमूनों के लिए (µL से लीटर तक)
पूरी तरह यांत्रिक उपचार
उपयोगकर्ता-अनुकूल, सुरक्षित संचालन
प्रयोगशाला से उत्पादन तक रैखिक रूप से पैमाना बढ़ाना

अल्ट्रासोनिक उपकरण VialTweeter समान प्रक्रिया परिस्थितियों में अधिकतम 10 वायल के नमूनों को एक साथ तैयार करने की सुविधा देता है। (बड़ा करके देखने के लिए क्लिक करें!)

VialTweeter अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए

अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र बनाम अन्य लाइसिस तकनीकें

रासायनिक और एंज़ाइमी लाइसिस समस्यापूर्ण हो सकते हैं – क्योंकि रासायनिक लाइसिस प्रोटीन की संरचनाओं को बदल सकता है और शुद्धिकरण में समस्याएँ पैदा कर सकता है तथा एंज़ाइमी लाइसिस के लिए लंबे ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है और यह पुनरुत्पादनीय नहीं है – जबकि अल्ट्रासोनिक विघटन कोशिका विघटन की एक परिष्कृत, तेज़ विधि है।
अल्ट्रासोनिक लाइसिस केवल यांत्रिक बलों पर आधारित है। कोई रसायन नहीं मिलाए जाते; सोनिकेशन अपरूपण बलों द्वारा कोशिका भित्ति को तोड़ता है। रासायनिक लाइसिस प्रोटीन की संरचना को बदल सकता है और शुद्धिकरण में समस्याएँ पैदा कर सकता है। एंज़ाइमी विघटन के लिए लंबे ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है और यह पुनरुत्पादनीय नहीं है। E.coli जीवाणु कोशिकाओं का अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन तेज़, सरल, विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय है। इसीलिए दुनिया भर की जैविक और जैवरासायनिक प्रयोगशालाओं में नमूना तैयार करने, विश्लेषण-पूर्व कार्यों, इन-विट्रो निदान और विविध परखों के लिए Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग किया जाता है।

अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए सामान्य अनुशंसाएँ

कोशिका निलंबनों की बहुत छोटी, मध्यम और बड़ी मात्राओं के लाइसिस के लिए सोनिकेशन सबसे लोकप्रिय तकनीक है – पिकोलीटर से लेकर 100L/hr तक (अल्ट्रासोनिक प्रवाह सेल का उपयोग करके)। द्रव के अपरूपण और कैविटेशन द्वारा कोशिकाओं का लाइसिस होता है। सोनिकेशन के दौरान DNA का भी अपरूपण होता है, इसलिए कोशिका निलंबन में DNase मिलाना आवश्यक नहीं है।

अल्ट्रासोनिक E.coli लाइसिस के दौरान तापमान नियंत्रण
नमूने को पहले से ठंडा करके और सोनिकेशन के दौरान बर्फ पर रखकर, नमूने के तापीय अपघटन को आसानी से रोका जा सकता है।
आदर्श रूप से, लाइसिस के दौरान नमूनों को बर्फ जितना ठंडा रखना चाहिए, लेकिन अधिकांश नमूनों के लिए इतना पर्याप्त है कि तापमान संवर्धन या उस स्रोत के तापमान से ऊपर न जाए जिससे ऊतक लिया गया है। इसलिए निलंबन को बर्फ पर रखने और 5–10 sec के कई छोटे अल्ट्रासोनिक स्पंदों तथा 10–30 sec के विरामों के साथ सोनिकेशन करने की अनुशंसा की जाती है। विरामों के दौरान ऊष्मा निकल सकती है, जिससे फिर से कम तापमान स्थापित हो सके। बड़े कोशिका नमूनों के लिए शीतलन जैकेट वाले विभिन्न प्रवाह सेल रिएक्टर उपलब्ध हैं।
सफल अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए विस्तृत सुझाव और अनुशंसाएँ यहाँ पढ़ें!

E. Coli लाइसेट की अल्ट्रासोनिक तैयारी के लिए प्रोटोकॉल

शोधकर्ता E.coli कोशिका विघटन के लिए Hielscher अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करते हैं। नीचे आपको E. coli से संबंधित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए Hielscher अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके E.coli लाइसिस करने के विभिन्न परीक्षित और प्रमाणित प्रोटोकॉल मिलेंगे।

अल्ट्रासोनिक्स का उपयोग करके कोशिका वृद्धि, क्रॉसलिंकिंग और E. coli कोशिका अर्क तैयार करना

SeqA और RNA पॉलिमरेज़ ChIP-Chip के लिए, E. coli MG1655 या MG1655 ΔseqA को 37°C पर OD₆₀₀ का मान लगभग 0.15 होने तक 50 ml LB (+ 0.2% ग्लूकोज़) में संवर्धित किया गया, जिसके बाद प्रति ml माध्यम में 27 μl फ़ॉर्मेल्डिहाइड (37%) मिलाया गया (अंतिम सांद्रता 1%)। कमरे के तापमान पर 20 min तक धीरे-धीरे हिलाते हुए (100 rpm) क्रॉसलिंकिंग की गई, जिसके बाद 10 ml 2.5 M ग्लाइसिन से अभिक्रिया रोकी गई (अंतिम सांद्रता 0.5 M)। तापीय आघात के प्रयोगों के लिए, E. coli MG1655 को 65 ml LB माध्यम में 30°C पर तब तक संवर्धित किया गया, जब तक OD₆₀₀ का मान लगभग 0.3 नहीं हो गया। इसके बाद संवर्धन के 30 ml हिस्से को 43°C पर पहले से गर्म किए गए फ़्लास्क में स्थानांतरित किया गया और शेष हिस्से को 30°C पर रखा गया। क्रॉसलिंकिंग और अभिक्रिया रोकने की प्रक्रिया ऊपर वर्णित विधि के अनुसार की गई, केवल इतना अंतर था कि कमरे के तापमान पर आगे धीरे-धीरे हिलाने से पहले कोशिकाओं को 30 या 43°C पर 5 min तक रखा गया। कोशिकाओं को अपकेंद्रीकरण द्वारा एकत्र किया गया और ठंडे TBS (pH7.5) से दो बार धोया गया। 1 ml लाइसिस बफ़र (10 mM Tris (pH 8.0), 20% सुक्रोज़, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml लाइसोज़ाइम) में पुनः निलंबित करने और 37°C पर 30 min तक ऊष्मायन के बाद 4 ml IP बफ़र मिलाया गया। इसके बाद Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP400St का उपयोग करके 100% शक्ति सेटिंग पर बर्फ़ पर रखी कोशिकाओं का 30 sec के 12 चक्रों में सोनिकेशन किया गया, जिनके बीच 30 sec के विराम रखे गए। 9000 g पर 10 min तक अपकेंद्रीकरण के बाद, अधिप्लवी के 800 μl के अंशों को -20°C पर संग्रहित किया गया। (Waldminghaus 2010)

अल्ट्रासोनिक प्रोब से एंज़ाइमों का अतिउत्पादन और शुद्धिकरण

डेकाहिस्टिडीन (His10)-टैगयुक्त प्रोटीनों के अतिउत्पादन के लिए, E. coli BL21(DE3) को pET19b कंस्ट्रक्टों से रूपांतरित किया गया। रात भर उगाए गए पूर्वसंवर्धन को अपकेंद्रीकरण द्वारा एकत्र किया गया, और उसके 1% हिस्से का उपयोग अभिव्यक्ति संवर्धन के संरोपण के लिए किया गया। pET19mgtB वाली कोशिकाओं को 22°C पर तब तक संवर्धित किया गया, जब तक 600 nm पर प्रकाशीय घनत्व (OD600) का मान 0.7 नहीं हो गया। संवर्धन को 17°C पर स्थानांतरित किया गया और 100 μM IPTG से प्रेरित किया गया। 16 h के बाद, संवर्धन को 4°C पर 7,500 × g पर अपकेंद्रीकरण द्वारा एकत्र किया गया। कोशिकाओं को pH 7.4 पर 0.3 M NaCl युक्त 50 mM फ़ॉस्फ़ेट-बफ़रयुक्त लवण विलयन (PBS) में पुनः निलंबित किया गया और Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर UP200St पर S2 माइक्रो-टिप सोनोट्रोड से 0.5 की चक्र सेटिंग और 75% के आयाम पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा विघटित किया गया।
डेकाहिस्टिडीन-टैगयुक्त GtfC का अतिउत्पादन 37°C पर OD₆₀₀ का मान 0.6 होने पर 100 μM IPTG से प्रेरित किया गया। फिर कोशिकाओं का 4 h तक ऊष्मायन किया गया, उन्हें एकत्र किया गया और MgtB के लिए ऊपर वर्णित विधि के अनुसार उनका लाइसिस किया गया।
कोशिका अवशेषों को तलछट में बैठाने के लिए अशोधित कोशिका अर्कों का 15,000 × g और 4°C पर अपकेंद्रीकरण किया गया। ÄKTAprime Plus प्रणाली का उपयोग करके अवशेषों से मुक्त किए गए अर्कों को 1-ml HisTrap FF Crude कॉलमों पर लोड किया गया। His-टैगयुक्त प्रोटीनों के ग्रेडिएंट एल्यूशन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंज़ाइमों का शुद्धिकरण किया गया। एल्यूशन से प्राप्त प्रोटीन विलयनों का 4°C पर 0.3 M NaCl युक्त 50 mM PBS, pH 7.4, की 1,000 गुना मात्रा के विरुद्ध दो बार डायलिसिस किया गया। शुद्धिकरण का विश्लेषण 12% SDS-PAGE द्वारा किया गया। प्रोटीन की सांद्रता Roti-Quant का उपयोग करके ब्रैडफ़ोर्ड विधि से निर्धारित की गई। (Rabausch et al. 2013)

E. coli जीवाणुओं से प्रोटीन का अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण
अध्ययन के लिए चुने गए बेट प्रोटीन (इस मामले में, Arabidopsis thaliana के MTV1) को GST टैग से जोड़ा जाता है और BL21 Escherichia coli (E. coli) कोशिकाओं में अभिव्यक्त किया जाता है।

GST-MTV1 और GST का एक-एक पेलेट लें (50 ml जीवाणु संवर्धन के अनुरूप) और प्रत्येक को 2.5 mL बर्फ़ जैसे ठंडे निष्कर्षण बफ़र में पुनः निलंबित करें।
जीवाणु कोशिकाओं को विघटित करने के लिए अल्ट्रासोनिकेटर UP100H (लगभग 2–5mL की छोटी मात्राओं के लिए MS3 माइक्रोटिप-सोनोट्रोड से सुसज्जित) का उपयोग तब तक करें, जब तक उनका लाइसिस न हो जाए, जिसका संकेत अपारदर्शिता में कमी और श्यानता में वृद्धि से मिलता है। यह प्रक्रिया बर्फ़ पर की जानी चाहिए, और अंतरालों में सोनिकेशन करने की अनुशंसा की जाती है (जैसे, 10 sec सोनिकेशन के बाद बर्फ़ पर 10 sec का विराम, और इसी क्रम में आगे)। ध्यान रखें कि सोनिकेशन की तीव्रता बहुत अधिक न हो। यदि झाग या सफ़ेद अवक्षेप बनता दिखाई दे, तो तीव्रता कम करनी होगी।
लाइसिस किए गए जीवाणुओं के विलयन को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ़्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4°C पर 16,000 x g पर 20 min तक अपकेंद्रीकरण करें।

अल्ट्रासोनिक प्रोब कोशिका को विघटित करने और E.coli से अणुओं तथा DNA का निष्कर्षण करने के लिए ध्वनिक कैविटेशन के बलों का उपयोग करते हैं।

UP400St जैसे प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर E.coli के कुशल लाइसिस के लिए ध्वनिक कैविटेशन के कार्य सिद्धांत का उपयोग करते हैं।

सोनिकेशन से पुनःसंयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण और शुद्धिकरण

E. coli के कोशिका पेलेट का Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर UP100H से सोनिकेशन किया गया। इसके लिए कोशिका पेलेट को ठंडे लयन बफ़र (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) में पुनः निलंबित किया गया और बर्फ पर 10 min तक ठंडा किया गया। फिर कोशिका निलंबन का 10 s के 10 छोटे पल्सों से सोनिकेशन किया गया, जिनके बाद ठंडा करने के लिए 30 s का अंतराल रखा गया। अंत में, कोशिका मलबे को 4°C पर 15 min तक 14,000 rpm पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा हटा दिया गया। rPR की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए अधिप्लावी को 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर चलाया गया और SDS-PAGE तथा वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषित किया गया। rPR का शुद्धिकरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ni2+-NTA रेज़िन (Invitrogen, USA) का उपयोग करके किया गया। इस चरण में मूल संरचना बनाए रखने वाली शुद्धिकरण विधि का उपयोग किया गया। शुद्ध किए गए प्रोटीन की शुद्धता का आकलन 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस और उसके बाद कूमैसी ब्लू अभिरंजन द्वारा किया गया। शुद्ध किए गए प्रोटीन की सांद्रता Micro BCA प्रोटीन परीक्षण किट (PIERCE, USA) से मापी गई। (Azarnezhad et al. 2016)

इस वीडियो में प्रयोगशाला के नमूनों के परिक्षेपण, समांगीकरण, निष्कर्षण या उनसे गैस हटाने के लिए 200 वाट का पराश्रव्य कप हॉर्न दिखाया गया है।

E. coli के लयन के लिए अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र

Hielscher Ultrasonics, E. coli बैक्टीरिया और अन्य प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों तथा कोशिका संवर्धों के विश्वसनीय और कुशल लयन के लिए उच्च प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र डिज़ाइन करता है, बनाता है और आपूर्ति करता है।
अल्ट्रासोनिक प्रोब और अप्रत्यक्ष सोनिकेशन प्रणालियों की व्यापक उत्पाद शृंखला हमें आपके कोशिका विघटन और निष्कर्षण अनुप्रयोग के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक ऊतक होमोजेनाइज़र प्रदान करने में सक्षम बनाती है।

डिज़ाइन, निर्माण और परामर्श – जर्मनी में निर्मित गुणवत्ता

Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपनी उच्चतम गुणवत्ता और डिज़ाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। स्मार्ट सॉफ़्टवेयर, सहज मेनू, प्रोग्राम करने योग्य सेटिंग्स और स्वचालित डेटा अभिलेखन Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर की कुछ ही विशेषताएँ हैं। मज़बूती और आसान संचालन हमारे अल्ट्रासोनिकेटर को अनुसंधान और जैव प्रौद्योगिकी सुविधाओं में सुचारु रूप से एकीकृत करना संभव बनाते हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर कठोर परिस्थितियों और चुनौतीपूर्ण परिवेशों में भी आसानी से काम करते हैं।

Hielscher Ultrasonics एक ISO प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक तकनीक तथा उपयोग में सरलता वाले उच्च प्रदर्शन के अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष ज़ोर देती है। निस्संदेह, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर CE के अनुरूप हैं और UL, CSA तथा RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।

नीचे दी गई तालिका हमारे अल्ट्रासोनिकेटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:

बैच आयतन	प्रवाह दर	अनुशंसित उपकरण
मल्टी-वेल / माइक्रोटाइटर प्लेटें	n.a.	UIP400MTP
वायल या बीकर के लिए CupHorn	n.a.	अल्ट्रासोनिक CupHorn
अल्ट्रासोनिक सूक्ष्म-प्रवाह रिएक्टर	n.a.	GDmini2
0.5 से 1.5mL आयतन वाले अधिकतम 10 वायल	n.a.	VialTweeter
0.5 से 1.5mL	n.a.	VialTweeter
1 से 500mL	10 से 200mL/min	UP100H
10 से 2000mL	20 से 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1 से 20L	0.2 से 4L/min	UIP2000hdT
10 से 100L	2 से 10L/min	UIP4000
n.a.	10 से 100L/min	UIP16000
n.a.	अधिक	उपकरणों का समूह: UIP16000

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अल्ट्रासोनिक ऊतक होमोजेनाइज़र और कोशिका विघटक, लाइसिस के अनुप्रयोगों और कीमतों के बारे में अतिरिक्त जानकारी का अनुरोध करने के लिए कृपया नीचे दिए गए फ़ॉर्म का उपयोग करें। हमें आपके साथ आपकी प्रक्रिया पर चर्चा करने और आपकी आवश्यकताओं को पूरा करने वाला अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र प्रदान करने में प्रसन्नता होगी!

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इस वीडियो में पराश्रव्य नमूना तैयारी प्रणाली UIP400MTP दिखाई गई है, जो उच्च तीव्रता वाले पराश्रव्य से किसी भी मानक मल्टी-वेल प्लेट में नमूनों की विश्वसनीय तैयारी संभव बनाती है। UIP400MTP के सामान्य अनुप्रयोगों में कोशिका लयन, DNA, RNA और क्रोमैटिन का कर्तन तथा प्रोटीन निष्कर्षण शामिल हैं।

E. coli के अल्ट्रासोनिक लयन के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल

अल्ट्रासोनिक VialTweeter का उपयोग करके E. coli में एलिसिन-संशोधित प्रोटीन

5,5′-डाइथियोबिस(2-नाइट्रोबेंज़ोइक अम्ल) (DTNB) परीक्षण द्वारा सल्फहाइड्रिल की मात्रा का निर्धारण
MOPS न्यूनतम माध्यम को इनोकुलेट करने के लिए रात भर उगाए गए E. coli MG1655 संवर्ध का उपयोग किया गया (1:100)। संवर्ध को वायवीय परिस्थितियों में तब तक उगाया गया जब तक A600 का मान 0.4 नहीं हो गया। तनाव उपचार के लिए संवर्ध को 15-ml के तीन संवर्धों में विभाजित किया गया। एक अनुपचारित संवर्ध ने ऋणात्मक नियंत्रण का काम किया। शेष दो संवर्धों में से एक में 0.79 mM एलिसिन (128 μg ml-1) और दूसरे में 1 mM डायमाइड मिलाया गया। संवर्धों को 15 min तक इनक्यूबेट किया गया। प्रत्येक संवर्ध के 5 ml से अपकेंद्रीकरण (8,525 × g, 4°C, 10 min) द्वारा कोशिकाएँ एकत्र की गईं। कोशिकाओं को 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, उपयोग से पहले अवायवीय परिस्थितियों में संग्रहित) से दो बार धोया गया और अपकेंद्रित किया गया (13,000 × g, 4°C, 10 min)। 4°C पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा विघटन से पहले कोशिकाओं को लयन बफ़र (6 mM गुआनिडिनियम HCl वाला PBS, pH 7.4) में पुनः निलंबित किया गया (VialTweeter अल्ट्रासोनिकेटर, Hielscher GmbH, जर्मनी) (3 × 1 min)। अपकेंद्रीकरण (13,000 × g, 4 °C, 15 min) द्वारा कोशिकीय मलबे का पेलेट बनाया गया। अधिप्लावी को चुंबकीय विलोडन छड़ वाली 3.5-ml QS-macro क्यूवेट (10 mm) में स्थानांतरित किया गया और 1 ml लाइसिस बफर के साथ मिलाया गया। कमरे के तापमान पर PSC-718 तापमान-नियंत्रित सेल होल्डर से सुसज्जित Jasco V-650 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से 412 nm पर नमूनों के अवशोषण की निगरानी की गई। 3 mM डाइथियोबिस(2-नाइट्रोबेंजोइक अम्ल) विलयन का 100μl मिलाया गया। संतृप्ति तक पहुँचने तक अवशोषण की निगरानी की गई। थायोल सांद्रता की गणना निम्न अवशोषण गुणांक का उपयोग करके की गई: ϵ₄₁₂ = 13,700 M^-1 cm^-1 थायो-2-नाइट्रोबेंज़ोइक अम्ल (TNB) के लिए। कोशिकीय थायोल सांद्रताओं की गणना E. coli कोशिकाओं के 6.7 × 10^-15 लीटर आयतन और A600 = 0.5 के कोशिका घनत्व (जो 1 × 10⁸ कोशिकाएँ ml^-1 कल्चर के समतुल्य है) के आधार पर की गई। (Müller et al. 2016)

अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक का उपयोग करके इन विवो ग्लूटाथियोन का निर्धारण

E.coli MG1655 को MOPS न्यूनतम माध्यम में कुल 200ml आयतन में तब तक संवर्धित किया गया, जब तक A600 का मान 0.5 तक नहीं पहुँच गया। तनाव उपचार के लिए कल्चर को 50-ml कल्चरों में विभाजित किया गया। 0.79 mM एलिसिन, 1 mM डायमाइड, या डाइमिथाइल सल्फॉक्साइड (नियंत्रण) के साथ 15 min ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 4,000g पर 4°C पर 10 min अपकेंद्रीकरण करके एकत्र किया गया। पेलेटों को 700µl KPE बफर में पुनः निलंबित करने से पहले कोशिकाओं को KPE बफर से दो बार धोया गया। प्रोटीन हटाने के लिए, अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा कोशिका विघटन से पहले 10% (w/v) सल्फोसैलिसिलिक अम्ल का 300l मिलाया गया (3 x 1 min; VialTweeter अल्ट्रासोनिकेटर)। अपकेंद्रीकरण (30 min, 13,000g, 4°C) के बाद अधिप्लावी एकत्र किए गए। KPE बफर के 3 आयतन मिलाकर सल्फोसैलिसिलिक अम्ल की सांद्रताओं को घटाकर 1% किया गया। कुल ग्लूटाथियोन और GSSG के मापन ऊपर वर्णित विधि से किए गए। कोशिकीय ग्लूटाथियोन सांद्रताओं की गणना E. coli कोशिकाओं के 6.7×10^-15 लीटर आयतन और A600 0.5 के कोशिका घनत्व (जो 1×10⁸ कोशिकाएँ ml^-1 कल्चर के समतुल्य है) के आधार पर की गई। GSH सांद्रताओं की गणना कुल ग्लूटाथियोन में से 2[GSSG] घटाकर की गई। (Müller et al. 2016)

अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके E. coli में मानव mAspAT की अभिव्यक्ति

अभिव्यक्ति वेक्टर युक्त E. coli BL21 (DE3) की एकल कॉलोनी को 100μg/mL एम्पिसिलिन युक्त 30 mL Luria-Bertani (LB) माध्यम में रखा गया और फिर 37ºC पर तब तक संवर्धित किया गया, जब तक प्रकाशीय घनत्व (OD₆₀₀) 0.6 तक नहीं पहुँच गया। कोशिकाओं को 4,000 × g पर 10 min अपकेंद्रीकरण करके एकत्र किया गया और 100μg/mL एम्पिसिलिन युक्त 3L ताज़े LB माध्यम में पुनः निलंबित किया गया।
इसके बाद, 16ºC पर 20 h के लिए 1 mM आइसोप्रोपिल β-ᴅ-1-थायोगैलेक्टोपाइरैनोसाइड (IPTG) से प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित की गई। कोशिकाओं को 8,000 × g पर 15 min अपकेंद्रीकरण करके एकत्र किया गया और बफर A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) से धोया गया। 3 L कल्चर से लगभग 45g (गीला भार) कोशिकाएँ प्राप्त हुईं। अपकेंद्रीकरण के बाद, कोशिका पेलेटों को 40 mL (1 L कल्चर के लिए) बर्फ जैसे ठंडे निष्कर्षण बफर A में पुनः निलंबित किया गया और Hielscher अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक UP400St का उपयोग करके बर्फ जैसे ठंडे तापमान पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा उनका लाइसिस किया गया। घुलनशील (अधिप्लावी) और अवक्षेपित (पेलेट) अंशों को अलग करने के लिए कोशिका लाइसेट को 12,000 rpm पर 15 min अपकेंद्रित किया गया। (Jiang et al. 2015)

जानने योग्य तथ्य

E.coli

Escherichia coli (E. coli), Escherichia वंश का एक ग्राम-नेगेटिव, वैकल्पिक रूप से अवायवीय, छड़ के आकार का कोलीफॉर्म जीवाणु है, जो आमतौर पर गर्म रक्त वाले जीवों (अंतःतापी जीवों) की निचली आंत में पाया जाता है। E. coli के विविध विशेषताओं वाले अनेक प्रभेद (या उपप्रकार) हैं। अधिकांश E. coli प्रभेद मनुष्यों के लिए हानिरहित हैं, जैसे B और K-12 प्रभेद, जिनका प्रयोगशालाओं में अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाता है। हालांकि, कुछ प्रभेद हानिकारक हैं और गंभीर बीमारी पैदा कर सकते हैं।
E. coli आधुनिक जैव अभियांत्रिकी और औद्योगिक सूक्ष्मजीवविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि इस जीवाणु में बदलाव करना आसान है। प्रयोगशाला के सामान्य अनुप्रयोगों में अक्सर E. coli का उपयोग किया जाता है, जैसे पुनःसंयोजक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक अम्ल (DNA) बनाने के लिए या एक मॉडल जीव के रूप में।
E. coli विषमजातीय प्रोटीनों के उत्पादन के लिए एक अत्यंत बहुमुखी परपोषी है, और E. coli में पुनःसंयोजक प्रोटीनों के उत्पादन के लिए अनेक प्रकार की प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियां उपलब्ध हैं। प्रोटीन की उच्च स्तर की अभिव्यक्ति की अनुमति देने वाले प्लास्मिडों का उपयोग करके जीवाणुओं में जीन प्रविष्ट किए जा सकते हैं, जिससे औद्योगिक किण्वन प्रक्रियाओं में ऐसे प्रोटीनों का बड़ी मात्रा में उत्पादन संभव होता है।
E.coli का उपयोग इंसुलिन के उत्पादन के लिए कोशिकीय कारखानों के रूप में किया जाता है। अन्य अनुप्रयोगों में टीकों और स्थिरीकृत एंजाइमों के विकास और उत्पादन, जैव ईंधनों के उत्पादन तथा जैवोपचार के लिए संशोधित E. coli कोशिकाओं का उपयोग शामिल है।
K-12 प्रभेद E. coli का एक उत्परिवर्ती रूप है, जो क्षारीय फॉस्फेटेज (ALP) एंजाइम की अतिअभिव्यक्ति करता है। यह उत्परिवर्तन उस जीन में दोष के कारण होता है, जो लगातार इस एंजाइम को कूटबद्ध करता है। यदि कोई जीन बिना किसी अवरोध के कोई उत्पाद बनाता है, तो इसे सतत सक्रियता कहा जाता है। इस विशिष्ट उत्परिवर्ती रूप का उपयोग ALP एंजाइम के पृथक्करण और शुद्धिकरण के लिए किया जाता है।
E. coli जीवाणुओं का कोशिकीय कारखानों के रूप में भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। अभियांत्रिकीकृत सूक्ष्मजीवों (जैसे जीवाणुओं) और पादप कोशिकाओं का उपयोग तथाकथित कोशिकीय कारखानों के रूप में किया जा सकता है। ये आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं अणु, रसायन, बहुलक, प्रोटीन और अन्य पदार्थ बनाती हैं, जिनका उपयोग, उदाहरण के लिए, औषधि, खाद्य और रसायन उद्योगों में किया जाता है। ऐसी जैव अभियांत्रिकीकृत कोशिकाओं के भीतर बने अणुओं को मुक्त करने के लिए, अल्ट्रासोनिक लयन कोशिका भित्तियों को तोड़ने और लक्षित पदार्थों को आसपास के तरल में स्थानांतरित करने की एक सामान्य विधि है। जैव अभियांत्रिकीकृत कोशिकाओं के लयन के बारे में और पढ़ें!

अल्ट्रासोनिक DNA अपरूपण

अल्ट्रासोनिक अपरूपण बलों का उपयोग कोशिका के भीतर से अणुओं, कोशिकांगों और प्रोटीनों को मुक्त करने के साथ-साथ DNA रज्जुओं को टुकड़ों में तोड़ने के लिए आमतौर पर किया जाता है। ध्वनिक कैविटेशन कोशिकाओं से DNA निकालने और लगभग 600 – 800 bp लंबाई के खंड बनाने के लिए कोशिका भित्तियों और झिल्लियों को तोड़ता है; यह लंबाई विश्लेषण के लिए आदर्श है।
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साहित्य / संदर्भ

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

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