ई। कोली के अल्ट्रासोनिक lysis

  • ई कोलाई बैक्टीरिया सूक्ष्म जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में सबसे अधिक इस्तेमाल किया बैक्टीरिया होते हैं।
  • अल्ट्रासोनिक सेल disruptors ई कोलाई के lysis के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने।
  • तीव्र अभी तक ठीक नियंत्रणीय गुहिकायन और कतरनी बलों पूरा विघटन और उच्च निष्कर्षण पैदावार (जैसे प्रोटीन, डीएनए) में परिणाम।

ई कोलाई का अल्ट्रासोनिक सेल विघटन पसंदीदा विधि क्यों है?

अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र या प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर ई कोलाई लाइसिस के लिए कई फायदे प्रदान करते हैं क्योंकि तीव्र अल्ट्रासाउंड कुशलता से सेल की दीवारों और झिल्ली को बाधित करता है। प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर का व्यापक रूप से निम्नलिखित कारणों से ई कोलाई लाइसिस के लिए उपयोग किया जाता है:

  • सेल की दीवारों का कुशल विघटन: ई कोलाई में पेप्टिडोग्लाइकन से बनी एक अर्ध-कठोर कोशिका भित्ति होती है, जिसे पारंपरिक लाइसिस विधियों का उपयोग करके तोड़ना मुश्किल हो सकता है। एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर तीव्र अल्ट्रासोनिक तरंगें उत्पन्न करता है जो कोशिकाओं के आसपास तरल में गुहिकायन बुलबुले बनाते हैं। जब ये बुलबुले ढह जाते हैं, तो वे उच्च गति वाले तरल जेट और शॉक तरंगें उत्पन्न करते हैं जिसके परिणामस्वरूप सेल की दीवारों का यांत्रिक विघटन होता है, प्रभावी रूप से बायोमोलेक्यूल्स जैसी सेलुलर सामग्री जारी होती है।
  • बढ़ी हुई पैठ: सोनोट्रोड द्वारा उत्पन्न अल्ट्रासोनिक तरंगें नमूने में गहराई से प्रवेश कर सकती हैं, बड़ी संख्या में ई कोलाई कोशिकाओं तक पहुंच सकती हैं और उन्हें समान रूप से इलाज कर सकती हैं। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि पूरे नमूने में लाइसिस अधिक समान है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सेल व्यवधान दक्षता होती है।
  • कम प्रसंस्करण समय: प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर द्वारा वितरित ऊर्जा अत्यधिक केंद्रित और स्थानीयकृत है, जिससे तेजी से और कुशल सेल लाइसिस होता है। मोती की धड़कन या एंजाइमेटिक लाइसिस जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, सोनिकेशन मिनटों या सेकंड के भीतर ई कोलाई लाइसिस प्राप्त कर सकता है। जबकि फ्रीज-पिघलना जैसी कई वैकल्पिक तकनीकों को उपचार के कई दौर की आवश्यकता होती है, अल्ट्रासोनिक लाइसिस एक ही प्रक्रिया चरण में कोशिकाओं को खोलता है।
  • तापमान नियंत्रण: अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिकेटर तापमान सेंसर और स्मार्ट सॉफ्टवेयर से लैस हैं, जो अधिकतम प्रक्रिया तापमान निर्धारित करने की अनुमति देता है। तापमान सीमा तक पहुंचने पर अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से रुक जाता है और एक निर्धारित तापमान बिंदु तक पहुंचने पर सोनिकेशन प्रक्रिया शुरू करता है। बर्फ स्नान में नमूनों को ठंडा करना नमूना तापमान को कम रखने और गर्मी से प्रेरित नमूना गिरावट को रोकने के लिए एक सरल तरीका है।
  • मापनीयता: प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर विभिन्न आकारों में उपलब्ध हैं, हैंडहेल्ड उपकरणों से लेकर बड़े पैमाने पर औद्योगिक मॉडल तक। यह उन्हें प्रयोगशाला में छोटी मात्रा को संसाधित करने या बड़े बायोप्रोसेसिंग अनुप्रयोगों के लिए स्केलिंग करने के लिए उपयुक्त बनाता है, जैसे वैक्सीन उत्पादन या अणुओं का जैव-संश्लेषण।
  • बहुमुखी प्रतिभा: अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग सेल लाइसिस से परे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि डीएनए कतरन, प्रोटीन निष्कर्षण, ऊतक समरूपीकरण, नैनोपार्टिकल फैलाव और पायसीकरण। इसलिए, एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर में निवेश अनुसंधान या औद्योगिक सेटिंग्स में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है।
  • यूपी 200 एसटी जैसे प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर विश्वसनीय ऊतक होमोजेनाइज़र और सेल क्रशर हैं, इसलिए आनुवंशिकी में नमूना तैयार करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, ई.कोलाई लाइसिस के लिए

    ई.कोलाई कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण कुशलतापूर्वक किया जाता है अल्ट्रासोनिक जांच UP200St

    प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर ई कोलाई लाइसिस के लिए कई फायदे प्रदान करता है। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों पर विश्वसनीय और सटीक नियंत्रण वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए पावर, अवधि और नमूना हैंडलिंग जैसे ऑपरेटिंग मापदंडों को अनुकूलित करने की अनुमति देता है।
     

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    यह ट्यूटोरियल बताता है कि आपके नमूना तैयारी कार्यों जैसे लाइसिस, सेल व्यवधान, प्रोटीन अलगाव, प्रयोगशालाओं, विश्लेषण और अनुसंधान में डीएनए और आरएनए विखंडन के लिए किस प्रकार का सोनिकेटर सबसे अच्छा है। अपने आवेदन, नमूना मात्रा, नमूना संख्या और थ्रूपुट के लिए आदर्श सोनिकेटर प्रकार चुनें। Hielscher Ultrasonics आप के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र है!

    विज्ञान और विश्लेषण में सेल व्यवधान और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सही सोनिकेटर कैसे खोजें

    वीडियो थंबनेल

    अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन अक्सर अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) में नमूना तैयारी चरण के रूप में प्रयोग किया जाता है

    कोलाई ईडीएल 933 के जीनोमिक डीएनए का इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण 0 - 15 मिनट अल्ट्रासोनिकेशन के अधीन है। एल डीएनए सीढ़ी को इंगित करता है।
    (अध्ययन और छवि: ©बासलेट एट अल।

    अल्ट्रासोनिक कैविटेशन का उपयोग कर सेल व्यवधान

    अल्ट्रासोनिक प्रोब-टाइप होमोजिनाइज़र लगभग 20,000 चक्र प्रति सेकंड (20 kHz पर) के साथ काम करते हैं और तरल पदार्थ या निलंबन में गुहिकायन का कारण बनते हैं। ध्वनिक गुहिकायन वैक्यूम जैसे दबाव और उच्च तापमान के सूक्ष्म क्षेत्र जो कोशिकाओं को अलग करते हैं। यद्यपि तापमान कई हजार डिग्री सेल्सियस तक पहुंच सकता है, कैविटेशन वॉल्यूम इतने छोटे होते हैं कि वे प्रक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से गर्म नहीं करते हैं। अल्ट्रासाउंड उत्पन्न ध्वनिक गुहिकायन और कतरनी बल ई.कोलाई जैसे जीवाणु कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को छिद्रित या तोड़ते हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों जैसे अल्ट्रासोनिक तीव्रता, आयाम, ऊर्जा इनपुट और तापमान पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देते हैं। जिससे, अल्ट्रासोनिक लाइसिस प्रक्रिया को सेल प्रकार, सेल संस्कृति और प्रक्रिया लक्ष्य के लिए बेहतर रूप से समायोजित किया जा सकता है।
     

    अल्ट्रासोनिक Lysis के लाभ

    • lysis सटीक नियंत्रण (तीव्रता, आयाम, तापमान)
    • विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम
    • विशिष्ट नमूने के लिए इष्टतम रूपांतरण
    • तापमान नियंत्रण
    • बहुत छोटा करने के लिए बहुत बड़ी नमूनों के लिए (μL लीटर तक)
    • विशुद्ध रूप से यांत्रिक उपचार
    • उपयोगकर्ता के अनुकूल, सुरक्षित ऑपरेशन
    • रैखिक उत्पादन के लिए प्रयोगशाला से पैमाने-अप
    अल्ट्रासोनिक डिवाइस VialTweeter एक ही प्रक्रिया शर्तों के तहत 10 शीशियों के साथ-साथ नमूना तैयार करने के लिए अनुमति देता है। (बड़ा करने के लिए क्लिक करें!)

    VialTweeter अल्ट्रासोनिक lysis के लिए

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    अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र बनाम अन्य लाइसिस तकनीक

    जबकि रासायनिक और एंजाइमेटिक लाइसिस समस्याग्रस्त हो सकता है। – के बाद से रासायनिक lysis प्रोटीन संरचनाओं में परिवर्तन और शुद्धि की समस्याओं और एंजाइमी lysis लागू कर सकते हैं लंबे समय तक ऊष्मायन बार की आवश्यकता है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है – अल्ट्रासोनिक विघटन एक परिष्कृत, तेजी से सेल विघटन विधि है।
    अल्ट्रासोनिक लाइसिस केवल यांत्रिक बलों पर आधारित है। कोई रसायन नहीं जोड़ा जाता है, सोनिकेशन कतरनी बलों द्वारा कोशिका भित्ति को तोड़ देता है। रासायनिक लाइसिस प्रोटीन संरचना को बदल सकता है और शुद्धिकरण समस्याओं को पेश कर सकता है। एंजाइमेटिक व्यवधान के लिए लंबे इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है और यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है। ई.कोलाई बैक्टीरिया कोशिकाओं का अल्ट्रासोनिक सेल विघटन तेज, सरल, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। यही कारण है कि दुनिया भर में जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगशालाओं में Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर्स का उपयोग नमूना तैयार करने, पूर्व-एनालिटिक्स, इन-विट्रो डायगोनस्टिक्स और कई गुना परख के लिए किया जाता है।

    अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए सामान्य सिफारिशें

    Sonication सेल निलंबन की बहुत छोटी, मध्यम और बड़ी मात्रा lysing के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है – 100 एल / घंटा से ऊपर पिको-लीटर से (एक अल्ट्रासोनिक प्रवाह सेल का उपयोग)। कोशिकाओं तरल कतरनी और गुहिकायन द्वारा lysed। डीएनए भी sonication के दौरान sheared है, तो यह सेल निलंबन के DNase जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है।
     

    अल्ट्रासोनिक ई.कोलाई लाइसिस के दौरान तापमान नियंत्रण
    अल्ट्रासोनिक सेल विघटनकर्ता यूपी 100 एच (100 डब्ल्यू) सेल विघटन और पौधे के यौगिकों के निष्कर्षण के लिए।नमूना पूर्व ठंडा और बर्फ पर sonication के दौरान नमूना रखकर, नमूना नमूना के थर्मल गिरावट आसानी से रोका जा सकता है।
    आदर्श रूप से, लाइसिस के दौरान नमूनों को बर्फ-ठंडा रखा जाना चाहिए, लेकिन अधिकांश नमूनों के लिए यह पर्याप्त है यदि तापमान संस्कृति या ऊतक स्रोत के तापमान से ऊपर नहीं बढ़ता है। इसलिए यह अनुशंसा की जाती है, निलंबन को बर्फ पर रखें और 5-10 सेकंड के कई छोटे अल्ट्रासोनिक्स दालों और 10-30 सेकंड के विराम के साथ सोनिकेट करें। विराम के दौरान, कम तापमान को फिर से स्थापित करने के लिए गर्मी फैल सकती है। बड़े सेल नमूनों के लिए, शीतलन जैकेट के साथ विभिन्न प्रवाह सेल रिएक्टर उपलब्ध हैं।
    एक सफल अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए विस्तृत सुझाव और सिफारिश यहां पढ़ें!

    ई कोलाई लाइसेट की अल्ट्रासोनिक तैयारी के लिए प्रोटोकॉल

    शोधकर्ता ई.कोलाई सेल व्यवधान के लिए हाइलशर अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करते हैं। नीचे आप विभिन्न ई कोलाई से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए हाइलशर अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ई-कोलाई लाइसिस के लिए विभिन्न परीक्षण और सिद्ध प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
     

    यह वीडियो क्लिप हिल्सचर अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र यूपी 100 एच दिखाता है, एक अल्ट्रासोनिकेटर जो प्रयोगशालाओं में नमूना तैयार करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

    अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र यूपी 100 एच

    वीडियो थंबनेल

    अल्ट्रासोनिक्स का उपयोग करके ई कोलाई सेल अर्क की सेल ग्रोथ, क्रॉसलिंकिंग और तैयारी

    SeqA और आरएनए पोलीमरेज़ चिप चिप ई कोलाई MG1655 या MG1655 ΔseqA के लिए एक आयुध डिपो के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हो गया था600 फॉर्मल्डेहाइड (37%) प्रति मिलीलीटर माध्यम के 27 μl से पहले 50 मिलीलीटर एलबी (+ 0.2% ग्लूकोज) में लगभग 0.15 (अंतिम एकाग्रता 1%) जोड़ा गया था। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी गति से हिलने (100 आरपीएम) पर क्रॉसलिंकिंग का प्रदर्शन किया गया था, इसके बाद 10 मिलीलीटर 2.5 एम ग्लाइसीन (अंतिम एकाग्रता 0.5 एम) के साथ बुझ गया। गर्मी-सदमे के प्रयोगों के लिए, ई कोलाई एमजी 1655 65 मिलीलीटर एलबी माध्यम में 30 डिग्री सेल्सियस पर ओडी तक उगाया गया था600 लगभग 0.3. इसके बाद 30 मिलीलीटर कल्चर को 43 डिग्री सेल्सियस पर प्री वार्म्ड फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया गया और शेष को 30 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया। क्रॉसलिंकिंग और शमन ऊपर वर्णित के रूप में था, सिवाय इसके कि कमरे के तापमान पर धीमी गति से हिलने से पहले कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 30 या 43 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था और ठंडे टीबीएस (पीएच 7.5) के साथ दो बार धोया गया था। 1 मिलीलीटर लाइसिस बफर (10 एमएम ट्राइस (पीएच 8.0), 20% सुक्रोज, 50 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम ईडीटीए, 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर लाइसोजाइम) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 100% पावर सेटिंग पर हाइलशर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर यूपी 400 एसटी का उपयोग करके बर्फ पर 12 गुना 30 सेकंड और 30 सेकंड ब्रेक के साथ सोनिक किया गया था। 9000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले के 800 μl एलिकोट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। (वाल्डमिनघौस 2010)
     

    अल्ट्रासोनिक जांच के साथ एंजाइमों का अतिउत्पादन और शुद्धिकरण

    Ultrasonicator UP100H एक प्रयोगशाला homogeniser अक्सर सेल संस्कृति प्लेटों के नमूना तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाता है।डेकाहिस्टिडाइन (एचआईएस 10) -टैग किए गए प्रोटीन के अतिउत्पादन के लिए, ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) को पीईटी 19 बी संरचनाओं के साथ बदल दिया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक रात भर की पूर्वसंस्कृति की कटाई की गई थी, और 1% का उपयोग अभिव्यक्ति संस्कृति को टीका लगाने के लिए किया गया था। पीईटी 19 एमजीटीबी ले जाने वाली कोशिकाओं को 22 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था जब तक कि 0.7 के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व नहीं होता है। संस्कृति को 17 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित कर दिया गया था और 100 μM IPTG द्वारा प्रेरित किया गया था। 16 घंटे के बाद, संस्कृति को 7,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर काटा गया था। कोशिकाओं को पीएच 7.4 पर 0.3 एम एनएसीएल के साथ 50 एमएम फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में फिर से निलंबित किया गया और 0.5 के चक्र और 75% के आयाम पर हाइलशर अल्ट्रासोनिकेटर यूपी 200 एसटी पर एस 2 माइक्रो-टिप सोनोट्रोड के साथ अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा बाधित किया गया।
    decahistidine-टैग GtfC के अधिक एक आयुध डिपो में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित किया गया था600 100 माइक्रोन IPTG साथ 0.6 की। कोशिकाओं तो, 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट काटा, और जैसा कि MgtB के लिए ऊपर कहा गया है lysed थे।
    सेल मलबे को तलछट करने के लिए कच्चे सेल अर्क को 15,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। स्पष्ट अर्क को एक डीकेटीएप्राइम प्लस सिस्टम का उपयोग करके 1-मिलीलीटर हिस्ट्रैप एफएफ क्रूड कॉलम पर लोड किया गया था। एंजाइमों को हिस-टैग किए गए प्रोटीन के ग्रेडिएंट क्षालन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार शुद्ध किया गया था। एल्यूटेड प्रोटीन समाधानों को 50 एमएम पीबीएस, पीएच 7.4 के 1,000 संस्करणों के मुकाबले दो बार डायलिसिस किया गया था, जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.3 एम एनएसीएल था। शुद्धिकरण का विश्लेषण 12% एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था। रोटी-क्वांट का उपयोग करके ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित की गई थी। (राबौश एट अल।
     

    ई कोलाई बैक्टीरिया से प्रोटीन का अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण
    ब्याज की एक चारा प्रोटीन (इस मामले में, Arabidopsis थालिअना की MTV1) एक जीएसटी टैग से जुड़े हुए और BL21 कोलाई (ई कोलाई) कोशिकाओं में व्यक्त किया है।

    1. जीएसटी-एमटीवी 1 और जीएसटी (50 मिलीलीटर बैक्टीरियल कल्चर के अनुरूप) का एक पेलेट लें और प्रत्येक को 2.5 एमएल बर्फ ठंडा निष्कर्षण बफर में पुन: निलंबित करें।
    2. जीवाणु कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक अल्ट्रासोनिकेटर यूपी 100 एच (लगभग 2-5 एमएल की छोटी मात्रा के लिए एमएस 3 माइक्रोटिप-सोनोट्रोड से लैस) का उपयोग करें, जो कम अस्पष्टता और बढ़ी हुई चिपचिपाहट से संकेत मिलता है। इसे बर्फ पर किया जाना चाहिए, और अंतराल में सोनिकेट करने की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए 10 सेकंड का सोनिकटिंग और उसके बाद बर्फ पर 10 सेकंड का ठहराव और इसी तरह)। इस बात का ध्यान रखना होगा कि बहुत अधिक तीव्रता के साथ ध्वनि न हो। यदि फोमिंग या एक सफेद अवक्षेप के गठन का पता लगाया जाता है, तो तीव्रता को कम करने की आवश्यकता होती है।
    3. लाइस्ड बैक्टीरिया के घोल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस, 16,000 x g पर 20 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।

     

    अल्ट्रासोनिक जांच सेल को बाधित करने और ई.कोलाई से अणुओं और डीएनए को निकालने के लिए ध्वनिक गुहिकायन के बलों का उपयोग करती है।

    यूपी 400 एसटी जैसे प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर ई.कोलाई के कुशल लाइसिस के लिए ध्वनिक गुहिकायन के कार्य सिद्धांत का उपयोग करें।

    सोनिकेशन का उपयोग करके पुनः संयोजक प्रोटीन का अभिव्यक्ति विश्लेषण और शुद्धिकरण

    ई कोलाई गोली को Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर UP100H के साथ मिलाया गया था। इस उद्देश्य के लिए, सेल पेलेट को ठंडा लाइसिस बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच = 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम डीटीटी, 1 एमएम पीएमएसएफ) में फिर से निलंबित किया गया और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया गया। फिर, सेल सस्पेंशन को 10 सेकंड के 10 छोटे विस्फोटों के साथ सोनिक किया गया था, जिसके बाद शीतलन के लिए 30 सेकंड का अंतराल था। अंत में, सेल मलबे को 14000 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया गया था। आरपीआर अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए, सुपरनैटेंट को 12% पॉलीक्रिलामाइड जेल पर चलाया गया था और एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया था। निर्माता गाइड के अनुसार आरपीआर का शुद्धिकरण एनआई 2 + -एनटीए राल (इनविट्रोजेन, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। इस चरण में, देशी शुद्धिकरण विधि का उपयोग किया गया था। शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता का मूल्यांकन 12% पॉलीक्रिलामाइड जेल पर वैद्युतकणसंचलन और बाद में कूमासी ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके किया गया था। शुद्ध प्रोटीन एकाग्रता को माइक्रो बीसीए प्रोटीन परख किट (पीआईएआरसीई, यूएसए) द्वारा मापा गया था। (अजारनेज़ाद एट अल।
     

    इस वीडियो में 200 वाट अल्ट्रासोनिक cuphorn dispersing, homogenizing, निकालने या प्रयोगशाला के नमूनों के degassing के लिए दिखाता है.

    अल्ट्रासोनिक कचहरी (200 वाट)

    वीडियो थंबनेल

    ई कोलाई लाइसिस के लिए अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र

    Hielscher Ultrasonics ई कोलाई बैक्टीरिया और अन्य सेल प्रकारों, ऊतकों और सेल संस्कृतियों के विश्वसनीय और कुशल लाइसिस के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र डिजाइन, निर्माण और आपूर्ति करता है।
    अल्ट्रासोनिक जांच के साथ-साथ अप्रत्यक्ष सोनिकेशन सिस्टम का व्यापक पोर्टफोलियो हमें आपको आपके सेल व्यवधान और निष्कर्षण अनुप्रयोग के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक ऊतक होमोजेनाइज़र प्रदान करने की अनुमति देता है।

    डिजाइन, विनिर्माण और परामर्श – गुणवत्ता जर्मनी में निर्मित

    Hielscher ultrasonicators ब्राउज़र नियंत्रण के माध्यम से दूरस्थ रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। Sonication पैरामीटर की निगरानी की जा सकती है और प्रक्रिया आवश्यकताओं के लिए ठीक से समायोजित किया जा सकता है।Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपने उच्चतम गुणवत्ता और डिजाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। स्मार्ट सॉफ्टवेयर, सहज ज्ञान युक्त मेनू, प्रोग्राम करने योग्य सेटिंग्स और स्वचालित डेटा प्रोटोकॉलिंग Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर की कुछ विशेषताएं हैं। मजबूती और आसान संचालन अनुसंधान और बायोटेक सुविधाओं में हमारे अल्ट्रासोनिकेटर के सुचारू एकीकरण की अनुमति देता है। यहां तक कि उबड़-खाबड़ परिस्थितियों और मांग वाले वातावरण को आसानी से Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

    Hielscher Ultrasonics एक आईएसओ प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक तकनीक और उपयोगकर्ता-मित्रता की विशेषता वाले उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष जोर देती है। बेशक, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर सीई अनुपालन हैं और यूएल, सीएसए और आरओएच की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।

    नीचे दी गई तालिका आपको हमारे अल्ट्रासोनिकटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:

    बैच वॉल्यूम प्रवाह की दर अनुशंसित उपकरणों
    मल्टी-वेल / माइक्रोटिटर प्लेटें एन.ए. यूआईपी400एमटीपी
    शीशियों या बीकर के लिए CupHorn एन.ए. अल्ट्रासोनिक cuphorn
    अल्ट्रासोनिक माइक्रो-फ्लो रिएक्टर एन.ए. GDmini2
    0.5 से 1.5 एमएल के साथ 10 शीशियों तक एन.ए. VialTweeter
    0.5 से 1.5 एमएल एन.ए. VialTweeter
    1 से 500 एमएल 10 से 200 मील / मिनट UP100H
    10 से 2000 मील 20 से 400 एमएल / मिनट UP200Ht, UP400St
    0.1 से 20 एल 0.2 से 4 एल / मिनट UIP2000hdT
    10 से 100 एल 2 से 10 एल / मिनट UIP4000
    एन.ए. 10 से 100 एल / मिनट UIP16000
    एन.ए. बड़ा के समूह UIP16000

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    अल्ट्रासोनिक ऊतक होमोजेनाइज़र और सेल क्रशर, लाइसिस अनुप्रयोगों और कीमतों के बारे में अतिरिक्त जानकारी का अनुरोध करने के लिए कृपया नीचे दिए गए फ़ॉर्म का उपयोग करें। हमें आपके साथ आपकी प्रक्रिया पर चर्चा करने और आपको अपनी आवश्यकताओं को पूरा करने वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र की पेशकश करने में खुशी होगी!









    कृपया ध्यान दें हमारे गोपनीयता नीति


    वीडियो अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी प्रणाली UIP400MTP, जो उच्च तीव्रता अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर किसी भी मानक बहु अच्छी तरह से प्लेटों के विश्वसनीय नमूना तैयारी के लिए अनुमति देता है से पता चलता है। UIP400MTP के विशिष्ट अनुप्रयोगों में सेल लाइसिस, डीएनए, आरएनए और क्रोमैटिन कर्तन के साथ-साथ प्रोटीन निष्कर्षण भी शामिल है।

    मल्टी-वेल प्लेट सोनीशन के लिए अल्ट्रासोनिकेटर UIP400MTP

    वीडियो थंबनेल

    अल्ट्रासोनिक ई कोलाई लाइसिस के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल

    अल्ट्रासोनिक वायल्वेटर का उपयोग करके ई कोलाई में एलिसिन-संशोधित प्रोटीन

    अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP200ST पर VialTweeter5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic एसिड) (DTNB) परख द्वारा Sulfhydryl सामग्री का निर्धारण
    ई कोलाई एमजी 1655 रातोंरात कल्चर का उपयोग एमओपीएस न्यूनतम माध्यम (1: 100) को टीका लगाने के लिए किया गया था। संस्कृति को एरोबिक रूप से विकसित किया गया था जब तक कि 0.4 का ए 600 नहीं पहुंच गया था। तनाव उपचार के लिए संस्कृति को तीन 15-मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। एक अनुपचारित संस्कृति ने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। शेष दो संस्कृतियों में से एक में 0.79 एमएम एलिसिन (128 μg ml-1) या 1 mM डायमाइड जोड़ा गया था। प्रत्येक संस्कृति के 5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूजेशन (8,525 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) द्वारा काटा गया था। कोशिकाओं को पीबीएस के 1 मिलीलीटर (137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 10 एमएम एनए 2 एचपीओ 4, 2 एमएम केएच 2 पीओ 4, पीएच 7.4, उपयोग से पहले अवायवीय रूप से संग्रहीत) और सेंट्रीफ्यूज (13,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) के साथ दो बार धोया गया था। अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर व्यवधान से पहले कोशिकाओं को लाइसिस बफर (6 एमएम गुआनिडिनियम एचसीएल, पीएच 7.4 के साथ पीबीएस) में फिर से निलंबित किया गया था।VialTweeter अल्ट्रासोनिकेटर, Hielscher GmbH, जर्मनी) (3 × 1 मिनट)। सेल मलबे को सेंट्रीफ्यूजेशन (13,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) द्वारा पेलेट किया गया था। सतह पर तैरने वाले को चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ 3.5-मिलीलीटर क्यूएस-मैक्रो क्यूवेट (10 मिमी) में स्थानांतरित किया गया था और 1 मिलीलीटर लाइसिस बफर के साथ मिलाया गया था। नमूनों के विलुप्त होने की निगरानी 412 एनएम पर की गई थी, जिसमें कमरे के तापमान पर पीएससी -718 तापमान-नियंत्रित सेल धारक से लैस जसको वी -650 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर था। 3 एमएम डिथियोबिस (2-नाइट्रोबेंज़ोइक एसिड) समाधान के 100 μl को जोड़ा गया था। विलुप्त होने की निगरानी तब तक की गई जब तक कि यह संतृप्ति तक नहीं पहुंच गया। थिओल एकाग्रता की गणना विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके की गई थी ε412 = 13,700 एम-1 से.मी-1 thio-2-nitrobenzoic एसिड (TNB) के लिए। सेलुलर thiol सांद्रता 6.7 × 10 के ई कोलाई कोशिकाओं की एक मात्रा के आधार पर गणना की गई-15 लीटर और A600 का एक सेल घनत्व = 0.5 (1 × 10 के बराबर)8 कोशिकाओं मिलीलीटर-1 संस्कृति)। (मुलर एट अल। 2016)
     

    अल्ट्रासोनिक सेल क्रशर का उपयोग करके विवो ग्लूटाथियोन निर्धारण में

    ई.कोलाई एमजी 1655 को एमओपीएस न्यूनतम माध्यम में 200 मिलीलीटर की कुल मात्रा में उगाया गया था जब तक कि 0.5 के ए 600 तक नहीं पहुंच गया था। तनाव उपचार के लिए संस्कृति को 50-मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। 0.79 mM एलिसिन, 1 mM डायमाइड, या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (नियंत्रण) के साथ 15 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 ग्राम पर काटा गया था। केपीई बफर के 700 डिग्री में छर्रों के पुन: निलंबन से पहले कोशिकाओं को केपीई बफर के साथ दो बार धोया गया था। डीप्रोटीनेशन के लिए, अल्ट्रासोनिकेशन (3 x 1 मिनट) द्वारा कोशिकाओं के विघटन से पहले 10% (डब्ल्यू / वी) सल्फोसिलिसिलिक एसिड के 300 एल को जोड़ा गया था; VialTweeter ultrasonicator)। Supernatants (30 मिनट, 13,000g, 4 डिग्री सेल्सियस) centrifugation के बाद एकत्र किए गए थे। Sulfosalicylic एसिड सांद्रता KPE बफर के 3 संस्करणों के अलावा द्वारा 1% तक की कमी कर रहे थे। कुल ग्लूटेथिओन और GSSG की माप जैसा कि ऊपर वर्णित प्रदर्शन किया गया। सेलुलर ग्लूटेथिओन सांद्रता ई की मात्रा के आधार पर गणना की गई 6.7 की कोशिकाओं कोलाई×10-15 लीटर और A600 0.5 का सेल घनत्व (1 के बराबर)×108 कोशिकाओं मिलीलीटर-1 संस्कृति)। GSH सांद्रता के 2 [GSSG] कुल ग्लूटेथिओन से घटाव द्वारा गणना की गई। (मुलर एट अल। 2016)

    अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ई कोलाई में मानव एमएएसपीएटी की अभिव्यक्ति

    अल्ट्रासोनिक सेल disruptor UP400St (400W) intracellular बात की निकासी के लिए (जैसे प्रोटीन, अंगों, डीएनए, आरएनए आदि)ई कोलाई BL21 के एकल कॉलोनी (DE3) Luria-Bertani (पौंड) मध्यम युक्त 100μg / एमएल एम्पीसिलीन के 30 एमएल में अभिव्यक्ति वेक्टर को शरण देने, और फिर ऑप्टिकल घनत्व तक 37 º सी में खेती (ओवर ड्राफ्ट600) 0.6 पर पहुंच गया। कोशिकाओं 10 मिनट के लिए कम से 4,000 × छ centrifugation द्वारा काटा, और 100μg / एमएल एम्पीसिलीन युक्त 3 एल ताजा पौंड मध्यम में resuspended थे।
    इसके बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति को 16 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए 1 एमएम आइसोप्रोपिल β-1-थियोगलैक्टोपीरानोसाइड (आईपीटीजी) के साथ प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 8,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था और बफर ए (20 एमएम एनएएच 2 पीओ 4, 0.5 एम एनएसीएल, पीएच 7.4) के साथ धोया गया था। अनुमानित 45 ग्राम (गीला वजन) कोशिकाओं को 3 एल संस्कृति से प्राप्त किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल छर्रों को 40 एमएल (1 एल कल्चर के लिए) बर्फ-ठंडा निष्कर्षण बफर ए में फिर से निलंबित किया गया था, और हाइलशर अल्ट्रासोनिक सेल क्रशर यूपी 400 एसटी का उपयोग करके बर्फ-ठंडे तापमान पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा लाइस किया गया था। सेल लाइसिस को घुलनशील (सतह पर तैरने वाला) और अवक्षेपित (गोली) अंशों को अलग करने के लिए 15 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। (जियांग एट अल।
     



    जानने के योग्य तथ्य

    ई कोलाई

    एस्चेरीचिया कोलाई (ई कोलाई) एक ग्राम-नकारात्मक, संकायत्मक एनारोबिक, रॉड-आकार, एस्चेरीचिया जीन के कोलिफोर्म बैक्टीरिया है जो आमतौर पर गर्म रक्त वाले जीवों (एंडोथर्म) की निचली आंत में पाया जाता है। विविध विशेषताओं के साथ बड़ी संख्या में ई कोलाई उपभेद (या उपप्रकार) हैं। अधिकांश ई कोलाई उपभेद मनुष्यों के लिए हानिकारक होते हैं, उदाहरण के लिए बी और के -12 उपभेद जो आमतौर पर प्रयोगशालाओं में अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, कुछ उपभेद हानिकारक हैं और गंभीर बीमारी का कारण बन सकते हैं।
    ई कोलाई आधुनिक जैव इंजीनियरिंग और औद्योगिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता के बाद से बैक्टीरिया में हेरफेर करने के लिए आसान है। आम प्रयोगशाला अनुप्रयोगों जो अक्सर ई कोलाई, उदा के इस्तेमाल को शामिल पुनः संयोजक डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) बनाने के लिए या एक मॉडल जीव के रूप में कार्य करने के लिए।
    ई कोलाई heterologous प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक बहुत बहुमुखी मेजबान है, और कई गुना प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली ई कोलाई में पुनः संयोजक प्रोटीन के निर्माण करने के लिए उपलब्ध हैं। प्लास्मिड जो प्रोटीन का उच्च स्तर अभिव्यक्ति की अनुमति का उपयोग करना, जीन बैक्टीरिया है, जो औद्योगिक किण्वन प्रक्रियाओं में उच्च मात्रा में प्रोटीन का निर्माण करने के लिए सक्षम बनाता है में पेश किया जा सकता है।
    ई.कोलाई का उपयोग इंसुलिन का उत्पादन करने के लिए सेल कारखानों के रूप में किया जाता है। आगे के अनुप्रयोगों में जैव ईंधन का उत्पादन करने के साथ-साथ बायोरेमेडिएशन के लिए टीकों और स्थिर एंजाइमों को विकसित करने और उत्पादन करने के लिए संशोधित ई कोलाई कोशिकाओं का उपयोग शामिल है।
    तनाव के -12 ई की एक उत्परिवर्ती फार्म कोलाई कि एंजाइम क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) ओवर-द व्यक्त करता है। इस उत्परिवर्तन जीन है कि लगातार एंजाइम के लिए कोड में एक दोष के कारण होता है। एक जीन किसी भी निषेध के बिना एक उत्पाद का उत्पादन यदि यह संघटित गतिविधि के रूप में जाना जाता है। यह विशिष्ट उत्परिवर्ती फार्म अलगाव और शुद्धि एएलपी एंजाइम के लिए प्रयोग किया जाता है।
    ई कोलाई बैक्टीरिया का व्यापक रूप से सेल कारखानों के रूप में भी उपयोग किया जाता है। इंजीनियर रोगाणुओं (जैसे, बैक्टीरिया) और पौधों की कोशिकाओं को तथाकथित सेल कारखानों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं अणुओं, रसायनों, पॉलिमर, प्रोटीन और अन्य पदार्थों का उत्पादन करती हैं, जिनका उपयोग उदाहरण के लिए दवा, खाद्य और रासायनिक उद्योग में किया जाता है। इस तरह के bioengineered कोशिकाओं के इंटीरियर में उत्पादित अणुओं को जारी करने के लिए, अल्ट्रासोनिक lysis सेल की दीवारों को बाधित करने और आसपास के तरल में लक्ष्य पदार्थों को स्थानांतरित करने के लिए एक आम विधि है। Bioengineered कोशिकाओं के lysis के बारे में और अधिक पढ़ें!

    अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना

    अल्ट्रासोनिक कतरनी बल सेल इंटीरियर से अणुओं, ऑर्गेनेल और प्रोटीन को छोड़ने के साथ-साथ डीएनए स्ट्रैंड को टुकड़ों में तोड़ने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। ध्वनिक गुहिकायन कोशिकाओं से डीएनए निकालने के लिए कोशिका की दीवारों और झिल्ली को तोड़ता है और लगभग 600 के टुकड़े उत्पन्न करता है। – लंबाई में 800 बीपी, जो विश्लेषण के लिए आदर्श है।
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    साहित्य/संदर्भ


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