ई कोलाई के अल्ट्रासोनिक Lysis
- ई कोलाई बैक्टीरिया माइक्रोबायोलॉजी और जैव प्रौद्योगिकी में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला बैक्टीरिया है।
- अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान ई कोलाई के लसीका के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करते हैं।
- तीव्र अभी तक ठीक नियंत्रणीय गुहिकायन और कतरनी बलों के परिणामस्वरूप पूर्ण व्यवधान और उच्च निष्कर्षण पैदावार (जैसे प्रोटीन, डीएनए) होती है।
ई कोलाई का अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान पसंदीदा तरीका क्यों है?
अल्ट्रासोनिक homogenizers या जांच प्रकार ultrasonicators ई कोलाई lysis के लिए कई फायदे प्रदान करते हैं क्योंकि तीव्र अल्ट्रासाउंड कुशलता से सेल की दीवारों और झिल्ली को बाधित करता है। जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है ई कोलाई लसीका निम्नलिखित कारणों से:
E.coli कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण कुशलता से के साथ किया जाता है अल्ट्रासोनिक जांच UP200St
प्रोब-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर ई कोलाई लसीका के लिए कई फायदे प्रदान करता है। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया मापदंडों पर विश्वसनीय और सटीक नियंत्रण वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए बिजली, अवधि और नमूना हैंडलिंग जैसे ऑपरेटिंग मापदंडों को अनुकूलित करने की अनुमति देता है।
ई कोलाई EDL933 के जीनोमिक डीएनए के इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण 0 - 15 मिनट ultrasonication के अधीन। एल डीएनए सीढ़ी को इंगित करता है।
(अध्ययन और छवि: ©बेसलेट एट अल 2008)
अल्ट्रासोनिक Cavitation का उपयोग सेल व्यवधान
अल्ट्रासोनिक जांच-प्रकार के होमोजेनाइज़र लगभग 20,000 चक्र प्रति सेकंड (20kHz पर) के साथ काम करते हैं और तरल पदार्थ या निलंबन में गुहिकायन का कारण बनते हैं। ध्वनिक गुहिकायन वैक्यूम जैसे दबाव और उच्च तापमान के सूक्ष्म क्षेत्र जो कोशिकाओं को अलग करते हैं। हालांकि तापमान कई हजार डिग्री सेल्सियस तक पहुंच सकता है, गुहिकायन की मात्रा इतनी छोटी होती है कि वे प्रक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से गर्म नहीं करते हैं। अल्ट्रासाउंड उत्पन्न ध्वनिक कैविटेशन और कतरनी बल ई.कोलाई जैसे बैक्टीरिया कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को छिद्रित या तोड़ते हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अल्ट्रासोनिक तीव्रता, आयाम, ऊर्जा इनपुट और तापमान जैसे प्रक्रिया मापदंडों पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, अल्ट्रासोनिक लसीका प्रक्रिया को सेल प्रकार, सेल संस्कृति और प्रक्रिया लक्ष्य के लिए बेहतर रूप से समायोजित किया जा सकता है।
- लाइसिस का सटीक नियंत्रण (तीव्रता, आयाम, तापमान)
- विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम
- विशिष्ट नमूनों के लिए इष्टतम अनुकूलन
- तापमान नियंत्रण
- बहुत छोटे से बहुत बड़े नमूनों के लिए (μL से लीटर)
- विशुद्ध रूप से यांत्रिक उपचार
- उपयोगकर्ता के अनुकूल, सुरक्षित संचालन
- प्रयोगशाला से उत्पादन तक रैखिक स्केल-अप
वायलट्वीटर अल्ट्रासोनिक लाइसिस के लिए
अल्ट्रासोनिक Homogenizer बनाम अन्य Lysis तकनीक
जबकि रासायनिक और एंजाइमेटिक लाइसिस समस्याग्रस्त हो सकता है – चूंकि रासायनिक लसीका प्रोटीन संरचनाओं को बदल सकता है और शुद्धि समस्याओं का परिचय दे सकता है और एंजाइमेटिक लसीका को लंबे इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है – अल्ट्रासोनिक व्यवधान एक परिष्कृत, तेज सेल व्यवधान विधि है।
अल्ट्रासोनिक लसीका केवल यांत्रिक बलों पर आधारित है। कोई रसायन नहीं जोड़ा जाता है, सोनिकेशन कतरनी बलों द्वारा सेल की दीवार को तोड़ता है। रासायनिक लसीका प्रोटीन संरचना को बदल सकता है और शुद्धिकरण समस्याओं का परिचय दे सकता है। एंजाइमी व्यवधान के लिए लंबे इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है और यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है। ई.कोलाई बैक्टीरिया कोशिकाओं का अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान तेज, सरल, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। यही कारण है कि Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग नमूना तैयार करने, पूर्व-एनालिटिक्स, इन-विट्रो डायगोन्स्टिक्स और कई गुना assays के लिए दुनिया भर में जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगशालाओं में किया जाता है।
अल्ट्रासोनिक Lysis के लिए सामान्य सिफारिशें
सोनिकेशन बहुत छोटे, मध्यम और बड़ी मात्रा में सेल सस्पेंशन को लाइसिंग करने के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है – पिको-लीटर से 100L/hr तक (अल्ट्रासोनिक फ्लो सेल का उपयोग करके)। कोशिकाओं को तरल कतरनी और गुहिकायन द्वारा lysed किया जाता है। डीएनए भी sonication के दौरान कतरनी है, तो यह सेल निलंबन के लिए DNase जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है.
अल्ट्रासोनिक E.coli lysis के दौरान तापमान नियंत्रण
नमूना को पूर्व-ठंडा करके और बर्फ पर सोनिकेशन के दौरान नमूना रखकर, नमूना के नमूना थर्मल क्षरण को आसानी से रोका जा सकता है।
आदर्श रूप से, नमूनों को लसीका के दौरान बर्फ-ठंडा रखा जाना चाहिए, लेकिन अधिकांश नमूनों के लिए यह पर्याप्त है यदि तापमान संस्कृति या ऊतक स्रोत के तापमान से ऊपर नहीं बढ़ता है। इसलिए यह सिफारिश की जाती है, बर्फ पर निलंबन रखने के लिए और 5-10 सेकंड के कई छोटे अल्ट्रासोनिक्स दालों और 10-30 सेकंड के ठहराव के साथ sonicate करने के लिए। ठहराव के दौरान, कम तापमान को फिर से स्थापित करने के लिए गर्मी फैल सकती है। बड़े सेल नमूनों के लिए, शीतलन जैकेट के साथ विभिन्न प्रवाह सेल रिएक्टर उपलब्ध हैं।
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ई की अल्ट्रासोनिक तैयारी के लिए प्रोटोकॉल. कोलाई Lysates
शोधकर्ता E.coli सेल व्यवधान के लिए Hielscher अल्ट्रासोनिक homogenizers का उपयोग करते हैं। नीचे आप विभिन्न ई कोलाई से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए Hielscher अल्ट्रासोनिक homogenizers का उपयोग कर E.coli lysis के लिए विभिन्न परीक्षण और सिद्ध प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
सेल ग्रोथ, क्रॉसलिंकिंग और ई की तैयारी Ultrasonics का उपयोग कर कोलाई सेल अर्क
SeqA और RNA पोलीमरेज़ के लिए ChIP-चिप E. coli MG1655 या MG1655 ΔseqA को 37°C से OD में उगाया गया था600 फॉर्मलाडेहाइड (37%) प्रति मिलीलीटर माध्यम के 27 माइक्रोन से पहले 50 मिलीलीटर एलबी (+ 0.2% ग्लूकोज) में लगभग 0.15 जोड़ा गया (अंतिम एकाग्रता 1%)। क्रॉसलिंकिंग 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी झटकों (100 आरपीएम) पर किया गया था, इसके बाद 2.5 एम ग्लाइसिन (अंतिम एकाग्रता 0.5 एम) के 10 मिलीलीटर के साथ शमन किया गया था। हीट-शॉक प्रयोगों के लिए, ई. कोलाई MG1655 को 65 मिलीलीटर एलबी माध्यम में 30 डिग्री सेल्सियस से आयुध डिपो में उगाया गया था600 लगभग 0.3 का। इसके बाद संस्कृति के 30 मिलीलीटर 43 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया गया था और शेष 30 डिग्री सेल्सियस पर रखा. क्रॉसलिंकिंग और शमन ऊपर वर्णित के रूप में था सिवाय इसके कि कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर आगे धीमी गति से मिलाते हुए 5 मिनट के लिए 30 या 43 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया और ठंडे टीबीएस (पीएच 7.5) के साथ दो बार धोया गया। 1 मिलीलीटर lysis बफर (10 मिमी Tris (पीएच 8.0), 20% सुक्रोज, 50 मिमी NaCl, 10 मिमी EDTA, 10 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 4 मिलीलीटर आईपी बफर के अलावा के बाद में resuspension के बाद, कोशिकाओं 12 बार 30 सेकंड और 30 सेकंड के साथ बर्फ पर sonicated थे 100% बिजली सेटिंग पर Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर UP400St का उपयोग कर। 9000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 800 माइक्रोन एलिकोट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। (वाल्डमिंगहॉस 2010)
एक अल्ट्रासोनिक जांच के साथ एंजाइमों का अतिउत्पादन और शुद्धिकरण
Decahistidine के अधिक उत्पादन के लिए (His10)-टैग प्रोटीन, ई. कोलाई BL21(DE3) pET19b निर्माण के साथ तब्दील किया गया था. एक रातोंरात preculture centrifugation द्वारा काटा गया था, और 1% एक अभिव्यक्ति संस्कृति टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पीईटी 19 एमजीटीबी ले जाने वाली कोशिकाओं को 0.7 के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व तक 22 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। संस्कृति को 17 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित कर दिया गया था और 100 माइक्रोन आईपीटीजी द्वारा प्रेरित किया गया था। 16 घंटे के बाद, संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था। कोशिकाओं को पीएच 7.4 पर 0.3 एम एनसीएल के साथ 50 एमएम फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में फिर से निलंबित कर दिया गया था और 0.5 के चक्र और 75% के आयाम पर हिल्स्चर अल्ट्रासोनिकेटर UP200St में एस 2 माइक्रो-टिप सोनोट्रोड के साथ अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा बाधित किया गया था।
डेकाहिस्टिडाइन-टैग किए गए जीटीएफसी का अतिउत्पादन एक आयुध डिपो में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरित किया गया था600 100 माइक्रोन आईपीटीजी के साथ 0.6 का। कोशिकाओं को तब 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था, काटा गया था, और जैसा कि एमजीटीबी के लिए ऊपर कहा गया है।
क्रूड सेल अर्क सेल मलबे तलछट के लिए 15,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuged थे. स्पष्ट अर्क एक ÄKTAprime प्लस प्रणाली का उपयोग कर 1 मिलीलीटर HisTrap एफएफ क्रूड कॉलम पर लोड किए गए थे. एंजाइमों को उनके टैग किए गए प्रोटीन के ढाल क्षालन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार शुद्ध किया गया था। एल्यूटेड प्रोटीन समाधान 50 मिमी पीबीएस, पीएच 7.4 के 1,000 संस्करणों के खिलाफ दो बार डायलिज़ किए गए थे, जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.3 एम एनसीएल था। शुद्धिकरण का विश्लेषण 12% एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था। प्रोटीन की एकाग्रता ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा रोटी-क्वांट का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। (रबॉश एट अल 2013)
ई कोलाई बैक्टीरिया से प्रोटीन की अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण
ब्याज की एक चारा प्रोटीन (इस मामले में, Arabidopsis Thaaliana के MTV1) एक GST टैग से जुड़ा हुआ है और BL21 Escherichia कोलाई (ई कोलाई) कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है।
- जीएसटी-एमटीवी 1 और जीएसटी (50 मिलीलीटर जीवाणु संस्कृति के अनुरूप) की एक गोली ले लो और 2.5 एमएल बर्फ ठंड निष्कर्षण बफर में प्रत्येक को फिर से निलंबित करें।
- बैक्टीरियल कोशिकाओं को तब तक बाधित करने के लिए एक अल्ट्रासोनिकेटर UP100H (लगभग 2-5mL की छोटी मात्रा के लिए MS3 माइक्रोटिप-सोनोट्रोड से लैस) का उपयोग करें, जब तक कि वे lysed न हों, जो कम अस्पष्टता और बढ़ी हुई चिपचिपाहट द्वारा इंगित किया जाता है। यह बर्फ पर बाहर किया जाना है, और यह अंतराल में sonicate करने के लिए सिफारिश की है (उदाहरण के लिए 10 सेकंड sonicating बर्फ और इतने पर पर 10 सेकंड ठहराव के बाद पीछा किया). बहुत अधिक तीव्रता के साथ सोनीकेट न करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। यदि झाग या सफेद अवक्षेप के गठन का पता लगाया जाता है, तो तीव्रता को कम करने की आवश्यकता होती है।
- लाइस्ड बैक्टीरिया समाधान को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, 20 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम में स्थानांतरित करें।
जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर जैसे UP400St ई.कोलाई के कुशल लसीका के लिए ध्वनिक गुहिकायन के कार्य सिद्धांत का उपयोग करें।
अभिव्यक्ति विश्लेषण और Sonication का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि
कोलाई गोली Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर UP100H के साथ sonicated था। इस प्रयोजन के लिए, सेल गोली ठंडा lysis बफर (50 मिमी Tris-HCl पीएच = 7.5, 100 मिमी NaCl, 5 मिमी डीटीटी, 1 मिमी PMSF) में resuspended किया गया था और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा. फिर, सेल निलंबन को ठंडा करने के लिए 30 एस के अंतराल के बाद 10 एस के 10 छोटे फटने के साथ सोनिकेट किया गया था। अंत में, सेल मलबे को 14000 आरपीएम पर 15 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया गया था। आरपीआर अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए, सतह पर तैरनेवाला 12% पॉलीक्रिलामाइड जेल पर चलाया गया था और एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया था। निर्माता गाइड के अनुसार पीआर का शुद्धिकरण Ni2+-NTA राल (इनविट्रोजन, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। इस चरण में, देशी शुद्धिकरण विधि का उपयोग किया गया था। शुद्ध प्रोटीन की शुद्धता का मूल्यांकन 12% पॉलीक्रिलामाइड जेल और बाद में कूमासी ब्लू धुंधला पर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके किया गया था। शुद्ध प्रोटीन एकाग्रता माइक्रो बीसीए प्रोटीन परख किट (पियर्स, यूएसए) द्वारा मापा गया था। (अजरनेझाद एवं अन्य 2016)
ई के लिए अल्ट्रासोनिक Homogenizers कोलाई Lysis
Hielscher Ultrasonics डिजाइन, निर्माण और ई कोलाई बैक्टीरिया और अन्य सेल प्रकार, ऊतकों और सेल संस्कृतियों के विश्वसनीय और कुशल lysis के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers की आपूर्ति।
अल्ट्रासोनिक जांच के साथ-साथ अप्रत्यक्ष सोनीशन सिस्टम का व्यापक पोर्टफोलियो हमें आपके सेल व्यवधान और निष्कर्षण अनुप्रयोग के लिए आदर्श अल्ट्रासोनिक ऊतक होमोजेनाइज़र प्रदान करने की अनुमति देता है।
डिजाइन, विनिर्माण और परामर्श – गुणवत्ता जर्मनी में निर्मित
Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपने उच्चतम गुणवत्ता और डिजाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। स्मार्ट सॉफ्टवेयर, सहज मेनू, प्रोग्राम करने योग्य सेटिंग्स और स्वचालित डेटा प्रोटोकॉल Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर की कुछ विशेषताएं हैं। मजबूती और आसान संचालन अनुसंधान और बायोटेक सुविधाओं में हमारे अल्ट्रासोनिकेटर के सुचारू एकीकरण की अनुमति देता है। यहां तक कि किसी न किसी परिस्थितियों और मांग वातावरण आसानी से Hielscher ultrasonicators द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं।
Hielscher Ultrasonics एक आईएसओ प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता-मित्रता की विशेषता वाले उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष जोर देती है। बेशक, Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर सीई के अनुरूप हैं और उल, सीएसए और RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको हमारे अल्ट्रासोनिकेटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
|---|---|---|
| मल्टी-वेल / माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. | UIP400MTP |
| शीशियों या बीकर के लिए CupHorn | एन.ए. | अल्ट्रासोनिक CupHorn |
| अल्ट्रासोनिक माइक्रो-फ्लो रिएक्टर | एन.ए. | जीडीमिनी2 |
| 0.5 से 1.5mL के साथ 10 शीशियों तक | एन.ए. | वायलट्वीटर |
| 0.5 से 1.5mL | एन.ए. | वायलट्वीटर |
| 1 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट | यूपी100एच |
| 10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट | यूपी200एचटी, UP400St |
| 0.1 से 20L | 0.2 से 4L/मिनट | यूआईपी2000एचडीटी |
| 10 से 100L | 2 से 10 लीटर/मिनट | UIP4000 |
| एन.ए. | 10 से 100 लीटर/मिनट | UIP16000 |
| एन.ए. | बड़ा | का क्लस्टर UIP16000 |
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अल्ट्रासोनिक ई कोलाई Lysis के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल
E. कोलाई में एलिसिन-संशोधित प्रोटीन एक अल्ट्रासोनिक VialTweeter का उपयोग कर
5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic एसिड) (DTNB) परख द्वारा Sulfhydryl सामग्री का निर्धारण
एक ई कोलाई MG1655 रातोंरात संस्कृति MOPS न्यूनतम माध्यम (1:100) टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 0.4 के A600 तक पहुंचने तक संस्कृति एरोबिक रूप से उगाई गई थी। तनाव उपचार के लिए संस्कृति को तीन 15-मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। एक अनुपचारित संस्कृति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है। 0.79 मिमी एलिसिन (128 माइक्रोग्राम एमएल -1) या 1 एमएम डायमाइड को शेष दो संस्कृतियों में से प्रत्येक में जोड़ा गया था। संस्कृतियों 15 मिनट के लिए ऊष्मायन थे प्रत्येक संस्कृति के 5 मिलीलीटर centrifugation (8,525 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) द्वारा काटा गया. कोशिकाओं पीबीएस के 1 मिलीलीटर (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी Na2HPO4, 2 मिमी KH2PO4, पीएच 7.4, उपयोग करने से पहले anaerobically संग्रहीत) और centrifuged (13,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) के साथ दो बार धोया गया. कोशिकाओं को अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर व्यवधान से पहले लाइसिस बफर (6 एमएम गुआनिडिनियम एचसीएल, पीएच 7.4 के साथ पीबीएस) में फिर से निलंबित कर दिया गया था (वायलट्वीटर अल्ट्रासोनिकेटर , Hielscher GmbH, जर्मनी) (3 × 1 मिनट)। सेल मलबे centrifugation (13,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) द्वारा गोली मार दी गई थी. सतह पर तैरनेवाला एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक 3.5 मिलीलीटर क्यूएस मैक्रो क्युवेट (10 मिमी) के लिए स्थानांतरित किया गया था और lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मिश्रित. नमूनों के विलुप्त होने की निगरानी 412 एनएम पर की गई थी, जिसमें कमरे के तापमान पर पीएससी-650 तापमान-नियंत्रित सेल धारक से लैस जैस्को वी -718 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर था। 3 एमएम डाइथियोबिस (2-नाइट्रोबेंजोइक एसिड) समाधान के 100μl जोड़े गए थे। विलुप्त होने की निगरानी तब तक की गई जब तक कि यह संतृप्ति तक नहीं पहुंच गया। थिओल एकाग्रता की गणना विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके की गई थी ε412 = 13,700 मीटर-1 सेंटीमीटर-1 थियो-2-नाइट्रोबेंजोइक एसिड (टीएनबी) के लिए। सेलुलर थियोल सांद्रता की गणना ई की मात्रा के आधार पर की गई थी कोलाई कोशिकाओं 6.7 × 10-15 लीटर और ए 600 = 0.5 (1 × 10 के बराबर सेल घनत्व8 सेल एमएल-1 संस्कृति)। (मुलर एट अल 2016)
विवो ग्लूटाथियोन निर्धारण में एक अल्ट्रासोनिक सेल कोल्हू का उपयोग करना
E.coli MG1655 को MOPS न्यूनतम माध्यम में 200ml की कुल मात्रा में उगाया गया था जब तक कि 0.5 का A600 नहीं पहुंच गया था। तनाव उपचार के लिए संस्कृति को 50 मिलीलीटर संस्कृतियों में विभाजित किया गया था। 0.79 एमएम एलिसिन, 1 एमएम डायमाइड, या डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (नियंत्रण) के साथ इनक्यूबेशन के 15 मिनट के बाद, कोशिकाओं को 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 ग्राम पर काटा गया। कोशिकाओं KPE बफर के 700μl में छर्रों के निलंबन से पहले KPE बफर के साथ दो बार धोया गया. डिप्रोटीन के लिए, अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं के विघटन से पहले 10% (डब्ल्यू / वी) सल्फोसैलिसिलिक एसिड के 300 एल जोड़े गए थे (3 x 1 मिनट; वायलट्वीटर अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग करें)। सुपरनेटेंट सेंट्रीफ्यूजेशन (30 मिनट, 13,000 ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस) के बाद एकत्र किए गए थे। सल्फोसैलिसिलिक एसिड सांद्रता केपीई बफर के 3 संस्करणों के अलावा 1% तक कम हो गई थी। कुल ग्लूटाथियोन और जीएसएसजी के माप ऊपर वर्णित के रूप में किए गए थे। सेलुलर ग्लूटाथियोन सांद्रता की गणना ई की मात्रा के आधार पर की गई थी कोलाई कोशिकाओं की 6.7×10-15 लीटर और ए 600 0.5 का सेल घनत्व (1 के बराबर)×108 सेल एमएल-1 संस्कृति)। जीएसएच सांद्रता की गणना कुल ग्लूटाथियोन से 2 [जीएसएसजी] के घटाव द्वारा की गई थी। (मुलर एट अल 2016)
ई में मानव mAspAT की अभिव्यक्ति एक अल्ट्रासोनिक Homogenizer का उपयोग कर कोलाई
ई. कोलाई BL21 (DE3) की एकल कॉलोनी 100μg/mL एम्पीसिलीन युक्त Luria-Bertani (LB) माध्यम के 30 एमएल में अभिव्यक्ति वेक्टर को परेशान करती है, और फिर ऑप्टिकल घनत्व (OD600) 0.6 तक पहुंच गया। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था, और 100μg/mL एम्पीसिलीन युक्त 3L ताजा LB माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया गया था।
इसके बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति 16ºC पर 20 घंटे के लिए 1 मिमी आइसोप्रोपिल β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 8,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया और बफर ए (20 एमएम एनएएच2पीओ4, 0.5 एम एनएसीएल, पीएच 7.4) से धोया गया। अनुमानित 45 ग्राम (गीला वजन) कोशिकाओं को 3 एल संस्कृति से प्राप्त किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल छर्रों को 40 एमएल (1 एल संस्कृति के लिए) बर्फ-ठंड निष्कर्षण बफर ए में फिर से निलंबित कर दिया गया था, और हिल्स्चर अल्ट्रासोनिक सेल कोल्हू UP400St का उपयोग करके बर्फ-ठंडे तापमान पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा lysed किया गया था। सेल लसीका घुलनशील (सतह पर तैरनेवाला) और अवक्षेपित (गोली) अंशों को अलग करने के लिए 15 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र किया गया था। (जियांग एट अल 2015)
जानने के योग्य तथ्य
ई.कोलाई
एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) जीनस एस्चेरिचिया का एक ग्राम-नकारात्मक, संकाय रूप से एनारोबिक, रॉड के आकार का, कोलीफॉर्म जीवाणु है जो आमतौर पर गर्म रक्त वाले जीवों (एंडोथर्म) की निचली आंत में पाया जाता है। विविध विशेषताओं के साथ बड़ी संख्या में ई कोलाई उपभेद (या उपप्रकार) हैं। अधिकांश ई कोलाई उपभेद मनुष्यों के लिए हानिरहित हैं, जैसे बी और के -12 उपभेद जो आमतौर पर प्रयोगशालाओं में अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, कुछ उपभेद हानिकारक हैं और गंभीर बीमारी का कारण बन सकते हैं।
ई कोलाई आधुनिक जैविक इंजीनियरिंग और औद्योगिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि बैक्टीरिया में हेरफेर करना आसान है। सामान्य प्रयोगशाला अनुप्रयोग जिनमें अक्सर ई कोलाई का उपयोग शामिल होता है, उदाहरण के लिए पुनः संयोजक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) बनाने या एक मॉडल जीव के रूप में कार्य करने के लिए।
कोलाई विषम प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक बहुत ही बहुमुखी मेजबान है, और ई कोलाई में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए कई गुना प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली उपलब्ध है। प्लास्मिड का उपयोग करना जो प्रोटीन की उच्च स्तरीय अभिव्यक्ति की अनुमति देता है, जीन को बैक्टीरिया में पेश किया जा सकता है, जो औद्योगिक किण्वन प्रक्रियाओं में उच्च मात्रा में ऐसे प्रोटीन का उत्पादन करने में सक्षम बनाता है।
ई.कोलाई का उपयोग इंसुलिन का उत्पादन करने के लिए सेल कारखानों के रूप में किया जाता है। इसके अलावा अनुप्रयोगों में जैव ईंधन का उत्पादन करने के साथ-साथ बायोरेमेडिएशन के लिए टीकों और स्थिर एंजाइमों को विकसित करने और उत्पादन करने के लिए संशोधित ई कोलाई कोशिकाओं का उपयोग शामिल है।
तनाव K-12 ई कोलाई का एक उत्परिवर्ती रूप है जो एंजाइम क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) को अधिक व्यक्त करता है। यह उत्परिवर्तन जीन में एक दोष के कारण होता है जो एंजाइम के लिए लगातार कोड करता है। यदि कोई जीन बिना किसी अवरोध के उत्पाद का उत्पादन करता है तो इसे संवैधानिक गतिविधि के रूप में जाना जाता है। इस विशिष्ट उत्परिवर्ती रूप का उपयोग एएलपी एंजाइम को अलग करने और शुद्ध करने के लिए किया जाता है।
ई कोलाई बैक्टीरिया भी व्यापक रूप से सेल कारखानों के रूप में उपयोग किया जाता है। इंजीनियर रोगाणुओं (जैसे, बैक्टीरिया) और पौधों की कोशिकाओं को तथाकथित सेल कारखानों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं अणुओं, रसायनों, पॉलिमर, प्रोटीन और अन्य पदार्थों का उत्पादन करती हैं, जिनका उपयोग दवा, खाद्य और रासायनिक उद्योग में उदाहरण के लिए किया जाता है। ऐसी बायोइंजीनियर कोशिकाओं के इंटीरियर में उत्पादित अणुओं को छोड़ने के लिए, अल्ट्रासोनिक लसीका सेल की दीवारों को बाधित करने और लक्ष्य पदार्थों को आसपास के तरल में स्थानांतरित करने का एक सामान्य तरीका है। बायोइंजीनियर कोशिकाओं के लसीका के बारे में और पढ़ें!
अल्ट्रासोनिक डीएनए बाल काटना
अल्ट्रासोनिक कतरनी बल सेल इंटीरियर से अणुओं, जीवों और प्रोटीन को छोड़ने के साथ-साथ डीएनए स्ट्रैंड को टुकड़ों में तोड़ने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। ध्वनिक गुहिकायन कोशिकाओं से डीएनए निकालने और लगभग 600 के टुकड़े उत्पन्न करने के लिए कोशिका की दीवारों और झिल्ली को तोड़ता है – लंबाई में 800 बीपी, जो विश्लेषण के लिए आदर्श है।
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साहित्य/सन्दर्भ
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Hielscher Ultrasonics से उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers बनाती है प्रयोगशाला तक औद्योगिक आकार।