ऊतक और कोशिका संवर्धनों से अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण
- प्रोटिओमिक्स में प्रोटीन निष्कर्षण नमूना तैयार करने का एक आवश्यक चरण है।
- पादप और जंतु ऊतक, यीस्ट तथा सूक्ष्मजीवों से प्रोटीन निकाले जा सकते हैं।
- सोनिकेशन प्रोटीन निष्कर्षण की एक विश्वसनीय, कुशल विधि है, जो कम निष्कर्षण समय में उच्च प्रोटीन प्राप्ति देती है।
ऊतकों और कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण
ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण नमूना तैयार करने का एक आवश्यक चरण है, जिसे ELISA, PAGE, वेस्टर्न ब्लॉटिंग, मास स्पेक्ट्रोमेट्री या प्रोटीन शुद्धिकरण जैसी अनेक जैवरासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों के दौरान किया जाता है। अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन, लायसिस और निष्कर्षण एक सटीक रूप से नियंत्रित की जा सकने वाली, गैर-तापीय तकनीक है, जो प्रोटीन की उच्च प्राप्ति सुनिश्चित करती है।
कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण में उपयोग होने वाला अल्ट्रासोनिक प्रोब UP200St
- तीव्र
- उच्च प्राप्ति
- अत्यधिक कुशल
- प्राचलों पर सटीक नियंत्रण
- पुनरुत्पादनीय परिणाम
- रैखिक रूप से पैमाना बढ़ाने की क्षमता
अल्ट्रासोनिक लायसिस और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सामान्य निर्देश
- तापमान नियंत्रण: तापीय विकृतीकरण के बिना प्रोटीन की उच्च प्राप्ति सुनिश्चित करने के लिए निष्कर्षण के दौरान तापमान को नियंत्रित करना आवश्यक है। Hielscher के अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र – जिन्हें अल्ट्रासोनिक डिसइंटीग्रेटर या अल्ट्रासोनिफायर भी कहा जाता है – सटीक रूप से नियंत्रित किए जा सकते हैं। इनके साथ प्लग से जोड़ा जा सकने वाला तापमान सेंसर आता है। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र के सेटिंग विकल्पों में अधिकतम तापमान निर्धारित किया जा सकता है। इस अधिकतम तापमान तक पहुँचने पर अल्ट्रासोनिकेटर अपने आप रुक जाता है और नमूने के ठंडा होने तक रुका रहता है।
- बफ़र: उपयुक्त बफ़र का चयन और बफ़र की सही मात्रा ऊतक के अनुसार बदलते हैं तथा इन्हें परीक्षण और त्रुटि की विधि से निर्धारित करना आवश्यक है।
- पृथक्करण / शुद्धिकरण: प्रोटीन लाइसेट में DNA या कार्बोहाइड्रेट जैसे जैवअणु अधिक मात्रा में हो सकते हैं, जिन्हें प्रोटीन अवक्षेपण (डीऑक्सीकोलेट-ट्राइक्लोरोएसीटिक अम्ल) या बफ़र विनिमय द्वारा हटाया जा सकता है।
Chittapalo और Noomhorm (2009) ने अपने अध्ययन में बताया कि सोनिकेशन के उपयोग से प्रोटीन की प्राप्ति बढ़ी और अल्ट्रासोनिक ऊतक समांगीकरण तथा लायसिस प्रक्रिया मौजूदा निष्कर्षण प्रक्रियाओं में उल्लेखनीय सुधार कर सकती है – जिससे व्यावसायिक निष्कर्षण के नए अवसर संभव होते हैं।
अल्ट्रासोनिक CupHorn प्रोटीन पृथक्करण और DNA खंडन के लिए समान परिस्थितियों में कई नमूनों को एक साथ अत्यधिक प्रभावी ढंग से तैयार करने के लिए।
जंतु ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण
पूर्ण आकार के ऊतक (जैसे गुर्दा, हृदय, फेफड़ा, मांसपेशी आदि) को तैयार करने के लिए, प्रोटीएज़ द्वारा अपघटन रोकने हेतु ऊतक को साफ़ औज़ारों से बहुत छोटे टुकड़ों में काटना चाहिए, अधिमानतः बर्फ़ पर और जितनी जल्दी हो सके (जैसे RIPA जैसा लायसिस बफ़र या प्रोटीएज़ और फॉस्फेटेज़ अवरोधक मिश्रण वाला हाइपोटोनिक लायसिस बफ़र)। काटने के बाद नमूने को तत्काल जमाने के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबोया जाता है। नमूने को बाद में उपयोग के लिए -80°C पर रखा जा सकता है या तत्काल समांगीकरण के लिए बर्फ़ पर रखा जा सकता है। अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण से ठीक पहले, बर्फ़ जैसा ठंडा लायसिस बफ़र (प्रोटीएज़ अवरोधकों DTT, leupeptin और aprotinin के साथ) तेज़ी से नमूना ट्यूब में डाला जाता है (प्रति ~10 mg ऊतक के लिए लगभग ~600 μL बफ़र की अनुशंसा की जाती है)। प्रति नमूना ट्यूब लगभग 20–60mg ऊतक की अनुशंसा की जाती है।
अल्ट्रासोनिक समांगीकरण, लायसिस और निष्कर्षण माइक्रो-टिप सोनोट्रोड से सुसज्जित UP100H या UP200Ht जैसे अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र से किया जाता है। सोनिकेशन की अवधि 60–90 sec. होती है, जिसमें अल्ट्रासोनिक चक्र मोड के अंतर्गत 15 sec. सोनिकेशन और 10 sec. विश्राम समय होता है। नमूने को पूरे समय बर्फ़ में रखना चाहिए।
अल्ट्रासोनिक समांगीकरण / निष्कर्षण के बाद, लाइसेट को 27,000g पर लगभग 20 min. तक अपकेंद्रित किया जाता है। इसके बाद अधिप्लवी द्रव एकत्र किया जाता है, ताकि Pierce protein assay BCA जैसे प्रोटीन परीक्षण द्वारा प्रोटीन की सांद्रता निर्धारित की जा सके।
रक्त सीरम से प्रोटीन निष्कर्षण
सीरम और फॉस्फेट बफ़र का समांगी मिश्रण प्राप्त करने के लिए, अल्ट्रासोनिक कोशिका लयन से पहले नमूने को वॉर्टेक्स किया जाता है। अल्ट्रासोनिक लयन के लिए, UP100H जैसे अल्ट्रासोनिक प्रयोगशाला होमोजेनाइज़र से नमूने का सोनिकेशन 20% आयाम पर 8 चक्रों में किया जाता है, जिनमें प्रत्येक चक्र में 5 सेकंड चालू और 15 सेकंड बंद रहने की अवधि होती है। प्रोटीन निष्कर्षण चक्रों में सोनिकेशन (स्पंदन मोड) करके और नमूने को बर्फ़ पर रखकर किया जाता है, ताकि नमूने के अत्यधिक गर्म होने और तापीय अपघटन से बचा जा सके। चूँकि सीरम में उच्च आणविक भार वाले प्रोटीनों (जैसे एल्ब्यूमिन, α1-antitrypsin, ट्रांसफ़ेरिन, haptoglobulin, इम्युनोग्लोबुलिन G और इम्युनोग्लोबुलिन A) की बड़ी मात्रा होती है, जो IEF के दौरान कम आणविक भार वाले प्रोटीनों के पृथक्करण में बाधा डालते हैं, इसलिए डिप्लीशन कॉलम का उपयोग करके सीरम से उनकी मात्रा कम करने की अनुशंसा की जाती है।
पादप ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण
ताज़े, मुलायम पादप ऊतक, जैसे मॉस आदि, को आसानी से विघटित किया जा सकता है – इसके लिए कटे हुए नमूना पदार्थ को सोनिकेशन हेतु केवल लयन बफ़र में रखना होता है। बीज, फ़र की सुईनुमा पत्तियों आदि जैसे कठोर, काष्ठीय पादप ऊतकों को सूखी अवस्था में पीसना चाहिए। कुछ कठोर, काष्ठीय पादप पदार्थों को सोनिकेशन द्वारा निष्कर्षण से पहले तरल नाइट्रोजन में जमाना और पीसना आवश्यक है। पादप कोशिका संवर्धन के निलंबनों के लिए, लयन बफ़र में 30 से 150 सेकंड तक अल्ट्रासोनिक उपचार अधिकतर पर्याप्त होता है। कद्दू के बीजों जैसे अधिक कठोर पदार्थों के लिए नीचे वर्णित अनुसार अधिक तीव्र सोनिकेशन आवश्यक होता है।
कद्दू के बीजों से एल्ब्यूमिन के अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण का प्रोटोकॉल
बारीक पिसे कद्दू के बीजों के पाउडर से एल्ब्यूमिन के अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, 250mL के काँच के बीकर में 10 g वसारहित कद्दू के बीजों का पाउडर और विलायक के रूप में 100 mL विआयनीकृत जल डाला जाता है। प्रोटीन निष्कर्षण में दो चरण होते हैं: पहले, नमूने का सोनिकेशन सोनोट्रोड S24d7 से सुसज्जित प्रोब प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर UP400St (400W, 24kHz) की सहायता से किया जाता है। अल्ट्रासोनिक समांगीकरण के दौरान काँच के बीकर को ठंडे पानी के बाथ में रखा जाता है। अल्ट्रासोनिकेटर UP400St का प्लग से जोड़ा जा सकने वाला तापमान सेंसर और उसकी तापमान नियंत्रण सेटिंग यह सुनिश्चित करते हैं कि नमूने का तापमान हमेशा 30°C से नीचे रखा जाए। सोनिकेशन के दौरान तापमान के सटीक नियंत्रण से एल्ब्यूमिन के विकृतीकरण से बचा जाता है। दूसरे चरण में, निष्कर्षण एक मिक्सर से 200 rpm की गति और 30°C पर किया गया। इसके बाद बीकर को तापस्थैतिक शेकर में स्थानांतरित किया जाता है। आसुत जल के साथ डायलिसिस द्वारा ग्लोब्युलिन हटाया जाता है। ग्लोब्युलिन हटाने के बाद, एल्ब्यूमिन प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए प्रोटीन निष्कर्ष से नमूना लिया जा सकता है और फिर एल्ब्यूमिन के स्कंदन के लिए 0.1 M HCl का उपयोग करके इसे pI=3.0 पर समायोजित किया जाता है। ठोस प्रावस्था को 5000g, 20°C पर अपकेंद्रण द्वारा अलग किया जाता है और विआयनीकृत जल में फिर से घोला जाता है। एल्ब्यूमिन सांद्र में प्रोटीन का अनुपात बढ़ाने के लिए एल्ब्यूमिन का स्कंदन दो बार किया जाता है।
चावल की भूसी से प्रोटीन सांद्र तैयार करने के लिए अल्ट्रासोनिक क्षारीय प्रोटीन निष्कर्षण यह दर्शाता है कि पारंपरिक निष्कर्षण विधियों की तुलना में अल्ट्रासोनिक उपचार से उल्लेखनीय रूप से कम निष्कर्षण समय में अधिक प्रोटीन प्राप्त होता है।
कार्यात्मक iNOS एंज़ाइम के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल
पूरी तरह कार्यात्मक iNOS एंज़ाइम प्राप्त करने के लिए (जैसे औषधि स्क्रीनिंग हेतु), निम्नलिखित प्रोटोकॉल की अनुशंसा की जाती है: कोशिका निलंबन को बर्फ़ पर रखना चाहिए और UP100H से 10µm आयाम पर चक्र मोड में उसका सोनिकेशन किया जाता है, जिसमें 5 sec. सोनिकेशन और बर्फ़ पर 25 sec. विश्राम होता है। इस प्रक्रिया को लगभग 3 बार दोहराना चाहिए। सोनिकेशन चक्रों के बीच का विश्राम समय तापमान में वृद्धि को कम करता है और इसलिए विकृतीकरण का जोखिम कम करेगा।
अल्ट्रासोनिक प्रोटीन विलेयीकरण
सोनिकेशन प्रोटीन विलेयीकरण की प्रक्रिया को तेज़ कर सकता है, जिसमें सामान्यतः कई घंटे लगते हैं। नमूने को अत्यधिक गर्म होने से बचाने और यूरिया युक्त विलयनों में प्रोटीन के अपघटन तथा संशोधनों को रोकने के लिए, अल्ट्रासोनिक स्पंदों की अवधि कुछ सेकंड से अधिक नहीं होनी चाहिए।
अल्ट्रासोनिकेटर UP200Ht छोटे नमूनों के सोनिकेशन के लिए 2mm माइक्रोटिप S26d2 से सुसज्जित।
प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अल्ट्रासोनिक उपकरण
Hielscher Ultrasonics कोशिकाओं, ऊतकों, जीवाणुओं, सूक्ष्मजीवों, यीस्ट और बीजाणुओं के विघटन के लिए अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है।
Hielscher के प्रयोगशाला अल्ट्रासोनिकेटर शक्तिशाली हैं और इन्हें संचालित करना आसान है। 24/7 संचालन के लिए निर्मित ये उपकरण मज़बूत और कुशल प्रयोगशाला तथा बेंच-टॉप उपकरणों के रूप में डिज़ाइन किए गए हैं। सभी उपकरणों में ऊर्जा आउटपुट और आयाम को सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। सहायक उपकरणों की विस्तृत श्रृंखला सेटअप के और भी विकल्प उपलब्ध कराती है। VialTweeter, UP200Ht, UP200St और UP400St जैसे डिजिटल अल्ट्रासोनिकेटर में एकीकृत तापमान नियंत्रण और स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग के लिए अंतर्निर्मित SD कार्ड होता है।
कई नमूनों के अप्रत्यक्ष, परस्पर संदूषण से मुक्त और एकसाथ सोनिकेशन के लिए हम VialTweeter या अल्ट्रासोनिक CupHorn प्रदान करते हैं।
नीचे दी गई तालिका नमूना तैयारी, कोशिका विघटन और निष्कर्षण के लिए हमारे अल्ट्रासोनिकेटर का अवलोकन प्रस्तुत करती है। प्रत्येक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र के बारे में अधिक जानकारी के लिए उपकरण के प्रकार पर क्लिक करें। हमारे सुप्रशिक्षित और लंबे अनुभव वाले तकनीकी कर्मचारी आपकी नमूना तैयारी के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिकेटर चुनने में आपकी सहायता करके प्रसन्न होंगे!
| बैच आयतन | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
|---|---|---|
| 10 वायल या ट्यूब तक | n.a. | VialTweeter |
| मल्टीवेल / माइक्रोटाइटर प्लेटें | n.a. | UIP400MTP |
| कई ट्यूब / पात्र | n.a. | CupHorn |
| 1 से 500mL | 10 से 200mL/min | UP100H |
| 10 से 1000mL | 20 से 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 से 2000mL | 20 से 400mL/min | UP400St |
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Hielscher के डिजिटल अल्ट्रासोनिकेटर में ब्राउज़र के माध्यम से रिमोट नियंत्रण और एकीकृत SD कार्ड पर स्वचालित डेटा अभिलेखन की सुविधाएँ हैं।
VialTweeter अप्रत्यक्ष सोनिकेशन के लिए।
जानने योग्य तथ्य
प्रोटिओमिक्स
प्रोटिओमिक्स वह अनुसंधान क्षेत्र है जिसमें प्रोटीन और प्रोटीओम का अध्ययन किया जाता है। प्रोटीन जीवों के भीतर अनेक प्रकार के जीवनावश्यक कार्य करते हैं। प्रोटीओम किसी निश्चित समय पर किसी जीनोम, कोशिका, ऊतक या जीव द्वारा अभिव्यक्त प्रोटीन का संपूर्ण समूह है। प्रोटीओम समय के साथ और कोशिका या जीव के सामने आने वाली विशिष्ट आवश्यकताओं या तनावों के अनुसार बदलता है। अधिक सटीक रूप से, यह परिभाषित परिस्थितियों में किसी निश्चित समय पर किसी दिए गए प्रकार की कोशिका या जीव में अभिव्यक्त प्रोटीन का समूह है। यह शब्द प्रोटीन और जीनोम शब्दों को मिलाकर बना है। प्रोटिओमिक्स प्रोटीओम का अध्ययन है।
प्रोटीन
प्रोटीन बड़े जैव-अणु होते हैं, जिन्हें बृहदणु कहा जाता है – ये अमीनो अम्ल अवशेषों की एक या अधिक लंबी शृंखलाओं से बने होते हैं। प्रोटीन पादप और जंतु, दोनों मूल के सभी जीवों में मौजूद होते हैं और अधिकांश जैविक कार्यों के लिए अत्यंत आवश्यक होते हैं। चूँकि प्रोटीन में बहुत-सी जैविक जानकारी होती है, इसलिए उन्हें विश्लेषणात्मक उद्देश्यों, जैसे प्रोटिओमिक अनुसंधान के लिए निष्कर्षित किया जाता है। प्रोटीन द्वारा किए जाने वाले सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में चयापचयी अभिक्रियाओं का उत्प्रेरण, DNA प्रतिकृति निर्माण, उद्दीपनों के प्रति प्रतिक्रिया और अणुओं का एक स्थान से दूसरे स्थान तक परिवहन शामिल हैं। प्रोटीन मुख्यतः अपने अमीनो अम्लों के अनुक्रम में एक-दूसरे से भिन्न होते हैं। यह अनुक्रम उनके जीनों के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है और आमतौर पर इसके परिणामस्वरूप प्रोटीन मुड़कर एक विशिष्ट त्रिविमीय संरचना बनाता है, जो उसकी सक्रियता निर्धारित करती है। पेप्टाइड के साथ-साथ प्रोटीन भी भोजन के प्रमुख घटकों में से एक हैं। इसलिए प्रक्रियाओं, खाद्य सुरक्षा और पोषण मूल्यांकन को अनुकूलित करने के लिए प्रोटिओमिक्स खाद्य विज्ञान में एक शक्तिशाली साधन है।
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction विश्लेष्यों को अलग करने और पूर्व-सांद्रित करने की एक विश्लेषण-पूर्व प्रक्रिया है। अल्ट्रासोनिकेशन के साथ संयोजन में क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण को तीव्र किया जा सकता है, जिससे प्रक्रिया अधिक कुशल, तेज़ और अधिक पर्यावरण-अनुकूल बनती है। अल्ट्रासोनिकेशन के साथ क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण विश्लेष्य तैयार करने की एक काफी अधिक कुशल विधि है। अल्ट्रासोनिक सहायता से क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण के बारे में और पढ़ें!
जेल वैद्युतकणसंचलन
जेल वैद्युतकणसंचलन DNA, RNA और प्रोटीन जैसे वृहदणुओं तथा उनके खंडों को उनके आकार और आवेश के आधार पर अलग करने और उनका विश्लेषण करने की प्रमुख विधि है। इसका उपयोग नैदानिक रसायन विज्ञान में प्रोटीनों को आवेश और/या आकार के आधार पर अलग करने के लिए (IEF एगारोज़, मूलतः आकार से स्वतंत्र) तथा जैव रसायन विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान और प्रोटिओमिक्स में DNA और RNA खंडों के मिश्रित समूह को लंबाई के आधार पर अलग करने, DNA और RNA खंडों के आकार का अनुमान लगाने या प्रोटीनों को आवेश के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है।
कोशिका संवर्धन
कोशिका संवर्धन वृद्धि की एक नियंत्रित प्रक्रिया है, जिसमें कोशिकाओं को नियंत्रित परिस्थितियों में उगाया जाता है। कोशिका संवर्धन की परिस्थितियाँ प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अलग होती हैं। सामान्यतः, कोशिका संवर्धन का परिवेश एक उपयुक्त पात्र (जैसे पेट्री डिश) से मिलकर बना होता है, जिसमें ऐसा सब्सट्रेट या माध्यम होता है जो आवश्यक पोषक तत्वों (अमीनो अम्ल, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन, खनिज), वृद्धि कारकों, हार्मोनों और गैसों (CO2, O2) की आपूर्ति करता है और भौतिक-रासायनिक परिवेश (pH बफर, परासरण दाब, तापमान) को नियंत्रित करता है। अधिकांश कोशिकाओं को एक सतह या कृत्रिम सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य कोशिका संवर्धनों को संवर्धन माध्यम में स्वतंत्र रूप से तैरती अवस्था में उगाया जा सकता है (निलंबन संवर्धन, कोशिका निलंबन)।
जंतु कोशिका लाइनों के बड़े पैमाने पर संवर्धनों का उपयोग विषाणु टीकों और जैव प्रौद्योगिकी से प्राप्त अन्य उत्पादों के औद्योगिक उत्पादन में किया जाता है। मानव स्टेम कोशिकाओं का संवर्धन कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने और प्रत्यारोपण के उद्देश्यों के लिए उन्हें विभिन्न प्रकार की कायिक कोशिकाओं में विभेदित करने के लिए किया जाता है।
ऊतक के नमूने
ऊतक शब्द एक कोशिकीय मध्यवर्ती संरचना को दर्शाता है, जिसमें कोशिकीय सामग्री संगठन के स्तर पर कोशिकाओं और एक पूर्ण अंग के बीच होती है। ऊतक में समान उत्पत्ति वाली समान कोशिकाएँ एकत्रित होती हैं, जो मिलकर एक विशिष्ट कार्य करती हैं। अनेक ऊतकों के कार्यात्मक समूहन से अंगों की जटिल संरचनाएँ बनती हैं।
जीव विज्ञान, ऊतक विज्ञान/ऊतक विकृति विज्ञान, परजीवी विज्ञान, जैव रसायन विज्ञान और प्रतिरक्षा ऊतक रसायन विज्ञान में अनुसंधान के साथ-साथ ऊतक संवर्धन और DNA निष्कर्षण के लिए ऊतक के नमूने लिए जाते हैं। जंतु ऊतक (उपविभाग: स्तनधारी ऊतक) और पादप ऊतक के बीच अंतर किया जा सकता है। जंतु ऊतकों को चार मूल प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: संयोजी, पेशीय, तंत्रिका और उपकला ऊतक। पादप ऊतक को निम्नलिखित तीन ऊतक तंत्रों में विभाजित किया जाता है: बाह्यत्वचा, भरण ऊतक और संवहनी ऊतक।
ऊतक के नमूने जंतुओं या पौधों के भागों, जैसे हड्डी, मांसपेशी, पत्तियों आदि से तैयार किए जा सकते हैं।
शरीर के तरल पदार्थ
रक्त, सीरम, प्लाज़्मा, मस्तिष्कमेरु द्रव, लार और साइनोवियल द्रव शरीर के तरल पदार्थ हैं, जो निदान की दृष्टि से प्रासंगिक जानकारी का एक उत्कृष्ट स्रोत प्रदान करते हैं। इसलिए, विश्लेषण के लिए शरीर के तरल पदार्थों के नमूनों की परिष्कृत तैयारी महत्वपूर्ण है। पहली कठिनाई शरीर के तरल पदार्थों में उपस्थित घटकों की व्यापक गतिशील परास से जुड़ी होती है।
प्रोटीन की सांद्रता का निर्धारण
Bradford परख, Lowry परख और बाइसिनकोनिनिक अम्ल (BCA) परख प्रोटीनों की सांद्रता निर्धारित करने के लिए प्रचलित परखें हैं। बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन मानकों में से एक है।
लाइसिस बफर
लाइसिस बफ़र का चयन कोशिकीय सामग्री या ऊतक (ऊतक संवर्धन, पौधे, जीवाणु, कवक आदि), कोशिकाएँ किसी संरचना में हैं या नहीं, और संरचना के प्रकार के अनुसार किया जाना चाहिए। प्रोटीन, झिल्लियों और कोशिकांगों के निष्कर्षण के लिए विभिन्न प्रकार के लाइसिस बफ़र एक या अधिक डिटर्जेंट से तैयार किए जाते हैं। डिटर्जेंट का चयन आमतौर पर परीक्षण और त्रुटि विधि से या – यदि उपलब्ध हो – किसी मौजूदा प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है। डिटर्जेंट ऊतक स्रोत और प्रोटीन के अनुकूल होना चाहिए। सामान्यतः, किसी विशिष्ट ऊतक / प्रोटीन के लिए प्रभावी सबसे सौम्य डिटर्जेंट चुना जाता है, ताकि निष्कर्ष की अधिकतम कार्यक्षमता बनी रहे। इसके अलावा, झिल्लियों और कोशिकांगों के निष्कर्षण के दौरान सौम्य डिटर्जेंट झिल्ली को अक्षुण्ण रखता है। लाइसिस बफ़र में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले डिटर्जेंट अधिकतर गैर-आयनिक या उभयायनिक होते हैं, जैसे CHAPS, डीऑक्सीकोलेट, Triton™ X-100, NP40 और Tween 20।
उदाहरण के लिए, मस्तिष्क, यकृत, आँत, वृक्क, प्लीहा आदि के ऊतकों को केवल RIPA से बफ़र किया जा सकता है – हालाँकि, प्रोटीएज़ अवरोधक और DTT (जैसे जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए) शामिल किए जाने चाहिए।
कंकालीय मांसपेशी ऊतक के लिए लाइसिस बफ़र (बर्फ जैसा ठंडा): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) ग्लिसरॉल, 1 mM EDTA, 1 mM डाइथायोथ्राइटॉल, जिसमें प्रोटीएज़ और फ़ॉस्फ़ेटेज़ अवरोधकों का मिश्रण मिलाया गया हो
सामान्य बफ़र और उनकी pH सीमा की तालिका। सामान्यतः, इन बफ़र का उपयोग आमतौर पर 20–50 mM की सांद्रता पर किया जाता है।
| बफ़र | pH सीमा |
|---|---|
| साइट्रिक अम्ल – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| सोडियम साइट्रेट – साइट्रिक अम्ल | 3.0 – 6.2 |
| सोडियम एसीटेट – एसीटिक अम्ल | 3.6 – 5.6 |
| कैकॉडिलिक अम्ल का सोडियम लवण – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| सोडियम डाइहाइड्रोजन फ़ॉस्फ़ेट – डाइसोडियम हाइड्रोजन फ़ॉस्फ़ेट | 5.8 – 8.0 |
| इमिडाज़ोल – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| ट्राइएथेनॉलअमीन हाइड्रोक्लोराइड – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| ट्राइसिन – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| सोडियम टेट्राबोरेट – बोरिक अम्ल | 7.6 – 9.2 |
| बाइसिन – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| ग्लाइसिन – NaOH | 8.6 – 10.6 |
अधिकांश बफ़र का pH तापमान पर निर्भर करता है। यह विशेष रूप से Tris बफ़र के लिए सत्य है। pKa का मान 25°C पर 8.06 से बदलकर 0°C पर 8.85 हो जाता है।
(बफ़र का pH और pKa: pH जलीय विलयन में हाइड्रोजन आयनों की सांद्रता मापता है। pKa (= अम्ल वियोजन स्थिरांक) एक संबंधित, लेकिन अधिक विशिष्ट माप है, क्योंकि यह अनुमान लगाने में मदद करता है कि कोई अणु किसी विशिष्ट pH मान पर कैसा व्यवहार करेगा।)
TRIzol
TRIzol एक रासायनिक विलयन है जिसका उपयोग ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट-फ़ीनॉल-क्लोरोफ़ॉर्म निष्कर्षण के दौरान RNA/DNA/प्रोटीन निकालने के लिए किया जाता है। अल्ट्रासोनिक सहायता से TRIzol निष्कर्षण का उपयोग एक ही नमूने से DNA, RNA और प्रोटीन की उच्च प्राप्ति देता है और इस प्रकार अन्य निष्कर्षण विधियों से बेहतर प्रदर्शन करता है।
साहित्य/संदर्भ
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.