ऊतक और सेल संस्कृतियों से अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण
- प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटिओमिक्स में एक आवश्यक नमूना तैयारी कदम है।
- प्रोटीन को पौधे और जानवरों के ऊतकों, खमीर और सूक्ष्मजीवों से निकाला जा सकता है।
- सोनिकेशन एक विश्वसनीय, कुशल प्रोटीन निष्कर्षण विधि है जो कम निष्कर्षण समय के भीतर उच्च प्रोटीन पैदावार देती है।
ऊतकों और कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण
ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण एक आवश्यक नमूना तैयारी कदम है जो एलिसा, पेज, वेस्टर्न ब्लॉटिंग, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, या प्रोटीन शुद्धि जैसे कई जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों के दौरान किया जाता है। अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान, लसीका और निष्कर्षण प्रोटीन की उच्च पैदावार सुनिश्चित करने के लिए एक सटीक नियंत्रणीय, गैर-थर्मल तकनीक है।
के साथ कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण अल्ट्रासोनिक जांच UP200St
- शीघ्र
- उच्च पैदावार
- अत्यधिक कुशल
- मापदंडों पर सटीक नियंत्रण
- प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम
- रैखिक मापनीयता
अल्ट्रासोनिक Lysis और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सामान्य निर्देश
- तापमान नियंत्रण: थर्मल विकृतीकरण के बिना एक उच्च प्रोटीन उपज सुनिश्चित करने के लिए, निष्कर्षण के दौरान तापमान नियंत्रित किया जाना चाहिए. Hielscher के अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिक homogenizers – अल्ट्रासोनिक विघटनकर्ता या अल्ट्रासोनिफायर भी कहा जाता है – ठीक नियंत्रणीय हैं। वे एक प्लग करने योग्य तापमान सेंसर के साथ आते हैं। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र के सेटिंग विकल्पों में, अधिकतम तापमान सेट किया जा सकता है। जब यह तापमान अधिकतम तक पहुंच जाता है, तो अल्ट्रासोनिकेटर स्वचालित रूप से बंद हो जाता है जब तक कि नमूना ठंडा नहीं हो जाता।
- बफ़र: एक उपयुक्त बफर की चॉइस और बफर की सही मात्रा ऊतक से ऊतक में भिन्न होती है और परीक्षण-और-त्रुटि परीक्षण द्वारा इसका पता लगाया जाना चाहिए।
- अलगाव/शुद्धिकरण: प्रोटीन lysates में डीएनए या कार्बोहाइड्रेट जैसे बायोमोलेक्यूल्स की अधिकता हो सकती है, जिसे प्रोटीन वर्षा (डीऑक्सीकोलेट-ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड) या बफर एक्सचेंज द्वारा हटाया जा सकता है।
चित्तपालो और नूमहोर्म (2009) ने अपने अध्ययन में बताया कि सोनिकेशन का उपयोग करके प्रोटीन उपज में वृद्धि हुई है और अल्ट्रासोनिक ऊतक समरूपता और लसीका प्रक्रिया मौजूदा निष्कर्षण प्रक्रियाओं को काफी बढ़ा सकती है – नए वाणिज्यिक निष्कर्षण अवसरों के लिए सक्षम करना।
अल्ट्रासोनिक CupHorn प्रोटीन अलगाव और डीएनए विखंडन के लिए एक ही शर्तों के तहत कई नमूनों के एक साथ, अत्यधिक प्रभावोत्पादक नमूना प्रस्तुत करने के लिए।
पशु ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण
पूरे आकार के ऊतक (जैसे गुर्दे, हृदय, फेफड़े, मांसपेशियों आदि) की तैयारी के लिए, ऊतक को साफ उपकरणों के साथ बहुत छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया जाना चाहिए, अधिमानतः बर्फ पर, और जितनी जल्दी हो सके प्रोटीज द्वारा गिरावट को रोकने के लिए (जैसे लाइसिस बफर जैसे आरआईपीए या हाइपोटोनिक लाइसिस बफर जिसमें प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल होता है)। विदारक करने के बाद, नमूना स्नैप फ्रीज के लिए तरल नाइट्रोजन में डूब जाता है। नमूना बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या तत्काल समरूपता के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है। अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण से तुरंत पहले, बर्फ ठंडा लाइसिस बफर (प्रोटीज इनहिबिटर डीटीटी, ल्यूपेप्टिन और एप्रोटिनिन के साथ) तेजी से नमूना ट्यूब में जोड़ा जाता है (प्रति ~ 10 मिलीग्राम ऊतक लगभग ~ 600 माइक्रोन बफर की सिफारिश की जाती है)। नमूना ट्यूब प्रति ऊतक के लगभग 20-60mg की सिफारिश की जाती है।
अल्ट्रासोनिक homogenization, lysis और निष्कर्षण इस तरह के UP100H या UP200Ht के रूप में एक अल्ट्रासोनिक homogenizer के साथ किया जाता है, एक माइक्रो-टिप sonotrode के साथ सुसज्जित। सोनिकेशन अवधि 15 सेकंड सोनिकेशन और 10 सेकंड आराम के समय के अल्ट्रासोनिक चक्र मोड में 60-90 सेकंड है। नमूना हर समय बर्फ में रखा जाना चाहिए।
निष्कर्षण के बाद, लाइसेट लगभग 20 मिनट के लिए 27,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र है। बाद में सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है, ताकि प्रोटीन एकाग्रता को प्रोटीन परख जैसे पियर्स प्रोटीन परख बीसीए द्वारा निर्धारित किया जा सके।
रक्त सीरम से प्रोटीन निष्कर्षण
सीरम और फॉस्फेट बफर के एक सजातीय मिश्रण के लिए, नमूना अल्ट्रासोनिक सेल लाइसिस से पहले पहले भंवर है। अल्ट्रासोनिक lysis के लिए, नमूना एक अल्ट्रासोनिक प्रयोगशाला homogenizer के साथ sonicated है जैसे UP100H 20% आयाम पर 8 चक्रों के लिए, प्रत्येक 5 सेकंड के चक्र के लिए और 15 सेकंड बंद। प्रोटीन निष्कर्षण चक्र (धड़कन मोड) में sonicating द्वारा किया जाता है और बर्फ पर नमूना रखकर इतना है कि एक अति ताप और नमूना थर्मल गिरावट से बचा जाता है. चूंकि सीरम में बड़ी मात्रा में उच्च आणविक भार प्रोटीन (जैसे एल्ब्यूमिन, α1-एंटीट्रिप्सिन, ट्रांसफरिन, हैप्टोग्लोबुलिन, इम्युनोग्लोबुलिन जी और इम्युनोग्लोबुलिन ए) होते हैं, जो आईईएफ के दौरान कम आणविक भार प्रोटीन के पृथक्करण में हस्तक्षेप करते हैं, इसलिए उन्हें कमी कॉलम का उपयोग करके सीरम से समाप्त करने की सिफारिश की जाती है।
पौधे के ऊतकों से प्रोटीन निष्कर्षण
ताजा, नरम पौधे ऊतक, जैसे काई आदि, आसानी से सोनिकेशन के लिए लाइसिस बफर में कटा हुआ नमूना सामग्री रखकर बाधित किया जा सकता है। सख्त, लाइजेनस पौधे के ऊतक, जैसे कि बीज, देवदार की सुई आदि, जमीन सूखी होनी चाहिए। कुछ कठोर, वुडी पौधों की सामग्री को सोनिकेशन द्वारा निकाले जाने से पहले तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और जमीन पर होना चाहिए। प्लांट सेल कल्चर सस्पेंशन के लिए, एक lysis बफर में 30 से 150 सेकंड के बीच एक अल्ट्रासोनिक उपचार ज्यादातर पर्याप्त होता है। कद्दू के बीज जैसी कठिन सामग्री को नीचे वर्णित अनुसार अधिक तीव्र सोनिकेशन की आवश्यकता होती है।
कद्दू के बीज से एल्ब्यूमिन के अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल
ठीक-जमीन कद्दू के बीज पाउडर से एल्ब्यूमिन के अल्ट्रासोनिक प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, 10 ग्राम वसा रहित कद्दू के बीज पाउडर और विलायक के रूप में 100 एमएल विआयनीकृत पानी को 250 एमएल ग्लास बीकर में जोड़ा जाता है। प्रोटीन निष्कर्षण में दो चरण होते हैं: सबसे पहले, नमूना के साथ sonicated है एक जांच-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर UP400St (400W, 24kHz) सोनोट्रोड S24d7 से लैस है। ग्लास बीकर अल्ट्रासोनिक homogenization के दौरान एक ठंडे पानी के स्नान में रखा गया है। अल्ट्रासोनिकेटर UP400St की प्लग करने योग्य तापमान सेंसर और तापमान नियंत्रण सेटिंग्स सुनिश्चित करती हैं कि नमूना तापमान हमेशा 30 °C से नीचे रखा जाता है। सोनिकेशन के दौरान सटीक तापमान नियंत्रण द्वारा, एल्ब्यूमिन के विकृतीकरण से बचा जाता है। दूसरे, निष्कर्षण 200 आरपीएम गति पर और 30 डिग्री सेल्सियस पर मिक्सर के साथ किया गया था। बाद में बीकर को थर्मास्टाटिक शेकर में स्थानांतरित किया जाता है। ग्लोब्युलिन को आसुत जल के साथ डायलिसिस के माध्यम से हटा दिया जाता है। ग्लोब्युलिन हटाने के बाद, एल्ब्यूमिन प्रोफाइल के निर्धारण के लिए प्रोटीन निकालने का नमूना लिया जा सकता है और बाद में एल्ब्यूमिन जमावट के लिए 0.1 एम एचसीएल का उपयोग करके पीआई = 3.0 में समायोजित किया जाता है। ठोस चरण को 5000 ग्राम, 20 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है और विआयनीकृत पानी में फिर से भंग कर दिया जाता है। एल्ब्यूमिन सांद्रता में प्रोटीन अनुपात बढ़ाने के लिए एल्बुमिन जमावट दो बार की जाती है।
चावल की भूसी से प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने की तैयारी के लिए अल्ट्रासोनिक क्षारीय प्रोटीन निष्कर्षण से पता चलता है कि अल्ट्रासोनिक उपचार के परिणामस्वरूप काफी कम निष्कर्षण समय में उच्च प्रोटीन उपज होती है – पारंपरिक निष्कर्षण विधियों की तुलना में।
कार्यात्मक iNOS एंजाइम के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल
पूरी तरह कार्यात्मक आईएनओएस एंजाइम (जैसे दवा स्क्रीनिंग के लिए) प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है: सेल निलंबन बर्फ पर रखा जाना चाहिए और 5 सेकंड के चक्र मोड पर 10μm आयाम पर एक UP100H के साथ sonicated है। प्रक्रिया को लगभग 3 बार दोहराया जाना चाहिए। सोनिकेशन चक्रों के बीच आराम का समय तापमान वृद्धि को कम करता है और इसलिए विकृतीकरण के जोखिम को कम करेगा।
अल्ट्रासोनिक प्रोटीन घुलनशीलता
सोनिकेशन प्रोटीन घुलनशीलता प्रक्रिया को तेज कर सकता है, जिसके लिए आमतौर पर कई घंटों की आवश्यकता होती है। नमूने को ज़्यादा गरम न करने और यूरिया युक्त समाधानों में प्रोटीन क्षरण और संशोधनों को रोकने के लिए, अल्ट्रासोनिक फटने से कुछ सेकंड से अधिक समय तक नहीं रहना चाहिए।
अल्ट्रासोनिकेटर UP200Ht छोटे नमूनों के sonication के लिए 2mm microtip S26d2 के साथ।
प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अल्ट्रासोनिक उपकरण
Hielscher Ultrasonics कोशिकाओं, ऊतकों, बैक्टीरिया, सूक्ष्मजीवों, खमीर, और बीजाणुओं के विघटन के लिए अल्ट्रासोनिक homogenizers की एक विस्तृत श्रृंखला की पेशकश।
Hielscher प्रयोगशाला अल्ट्रासोनिकेटर शक्तिशाली और संचालित करने में आसान हैं। 24/7 ऑपरेशन के लिए निर्मित, वे मजबूत और कुशल प्रयोगशाला और बेंच-टॉप उपकरणों के रूप में डिज़ाइन किए गए हैं। सभी उपकरणों के लिए, ऊर्जा उत्पादन और आयाम को ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है। सहायक उपकरण की विस्तृत श्रृंखला आगे सेटअप विकल्प खोलती है। VialTweeter, UP200Ht, UP200St, और UP400St जैसे डिजिटल अल्ट्रासोनिकेटर में एक एकीकृत तापमान नियंत्रण और स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग के लिए एक अंतर्निहित एसडी कार्ड है।
कई नमूनों के अप्रत्यक्ष, क्रॉस-संदूषण मुक्त और एक साथ sonication के लिए, हम VialTweeter या अल्ट्रासोनिक CupHorn प्रदान करते हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको नमूना तैयार करने, सेल व्यवधान और निष्कर्षण के लिए हमारे अल्ट्रासोनिकेटर पर एक सिंहावलोकन देती है। प्रत्येक अल्ट्रासोनिक homogenizer के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए डिवाइस प्रकार पर क्लिक करें। हमारे अच्छी तरह से प्रशिक्षित और लंबे समय के अनुभव तकनीकी कर्मचारी आपके नमूना तैयार करने के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिकेटर चुनने में आपकी मदद करने में प्रसन्न होंगे!
| बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
|---|---|---|
| 10 शीशियों या ट्यूबों तक | एन.ए. | वायलट्वीटर |
| मल्टीवेल / माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. | UIP400MTP |
| एकाधिक ट्यूब / | एन.ए. | कपहॉर्न |
| 1 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट | यूपी100एच |
| 10 से 1000mL | 20 से 200mL/मिनट | यूपी200एचटी, यूपी200सेंट |
| 10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट | UP400St |
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वायलट्वीटर अप्रत्यक्ष sonication के लिए।
जानने के योग्य तथ्य
प्रोटिओमिक्स
प्रोटिओमिक्स अनुसंधान क्षेत्र है जो प्रोटीन और प्रोटिओम की जांच करता है। प्रोटीन जीवों के भीतर महत्वपूर्ण कार्यों की एक विशाल सरणी को पूरा करते हैं। प्रोटिओम एक निश्चित समय में एक जीनोम, कोशिका, ऊतक या जीव द्वारा व्यक्त प्रोटीन का पूरा सेट है। प्रोटिओम समय और विशिष्ट आवश्यकताओं के साथ बदलता रहता है, या तनाव होता है, जो एक कोशिका या जीव से गुजरता है। अधिक विशेष रूप से, यह किसी दिए गए प्रकार के सेल या जीव में व्यक्त प्रोटीन का सेट है, एक निश्चित समय पर, परिभाषित परिस्थितियों में। यह शब्द प्रोटीन और जीनोम का मिश्रण है। प्रोटिओमिक्स प्रोटिओम का अध्ययन है।
प्रोटीन
प्रोटीन बड़े बायोमोलेक्यूल्स हैं, तथाकथित मैक्रोमोलेक्यूल्स – जो अमीनो एसिड अवशेषों की एक या अधिक लंबी श्रृंखलाओं से बने होते हैं। प्रोटीन वनस्पति और पशु मूल दोनों के सभी जीवों में मौजूद हैं और वे अधिकांश जैविक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। चूंकि प्रोटीन में बहुत सारी जैविक जानकारी होती है, इसलिए उन्हें विश्लेषणात्मक उद्देश्य के लिए निकाला जाता है, उदाहरण के लिए प्रोटिओमिक अनुसंधान के लिए। प्रोटीन द्वारा किए गए सबसे महत्वपूर्ण कार्य में चयापचय प्रतिक्रियाओं का उत्प्रेरण, डीएनए प्रतिकृति, उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया और एक स्थान से दूसरे स्थान पर अणुओं का परिवहन शामिल है। प्रोटीन मुख्य रूप से अमीनो एसिड के अनुक्रम में एक दूसरे से भिन्न होते हैं, जो उनके जीन के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है, और जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर प्रोटीन एक विशिष्ट त्रि-आयामी संरचना में बदल जाता है जो इसकी गतिविधि को निर्धारित करता है। प्रोटीन हैं – पेप्टाइड्स के अलावा – भोजन के प्रमुख घटकों में से एक। इसलिए, प्रोटिओमिक्स खाद्य विज्ञान में प्रक्रियाओं, खाद्य सुरक्षा और पोषण संबंधी मूल्यांकन को अनुकूलित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction विश्लेषणों को अलग करने और पूर्व-संक्षिप्त करने के लिए एक पूर्व-विश्लेषणात्मक प्रक्रिया है। अल्ट्रासोनिकेशन के संयोजन में, क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण को प्रक्रिया को अधिक कुशल, तेज और पर्यावरण-अनुकूल बनाने के लिए तेज किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिकेशन के साथ, क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण विश्लेषण तैयारी का एक और अधिक कुशल तरीका है। अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त क्लाउड पॉइंट निष्कर्षण के बारे में और पढ़ें!जेल वैद्युतकणसंचलन
जेल वैद्युतकणसंचलन उनके आकार और चार्ज के आधार पर डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के साथ-साथ उनके टुकड़ों जैसे मैक्रोमोलेक्यूल्स के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए प्रमुख विधि है। इसका उपयोग नैदानिक रसायन विज्ञान में प्रोटीन को चार्ज और/या आकार (आईईएफ एगरोज़, अनिवार्य रूप से आकार स्वतंत्र) द्वारा अलग करने के लिए और जैव रसायन, आणविक जीव विज्ञान और प्रोटिओमिक्स में डीएनए और आरएनए टुकड़ों की मिश्रित आबादी को लंबाई से अलग करने के लिए, डीएनए और आरएनए टुकड़ों के आकार का अनुमान लगाने के लिए या चार्ज द्वारा प्रोटीन को अलग करने के लिए किया जाता है।
सेल संस्कृतियों
सेल कल्चर नियंत्रित बढ़ती प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाओं को नियंत्रित परिस्थितियों में खेती की जाती है। सेल संस्कृति की स्थिति प्रत्येक सेल प्रकार के लिए भिन्न होती है। सामान्य तौर पर, सेल कल्चर के वातावरण में सब्सट्रेट या माध्यम के साथ एक उपयुक्त पोत (जैसे पेट्री डिश) होता है जो आवश्यक पोषक तत्वों (अमीनो एसिड, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन, खनिज), विकास कारक, हार्मोन और गैसों (सीओ2, ओ2), और भौतिक-रासायनिक वातावरण (पीएच बफर, आसमाटिक दबाव, तापमान) को नियंत्रित करता है। अधिकांश कोशिकाओं को सतह या कृत्रिम सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य सेल संस्कृतियों को संस्कृति माध्यम (निलंबन संस्कृति, सेल निलंबन) में मुक्त फ्लोटिंग की खेती की जा सकती है।
पशु कोशिका लाइनों के बड़े पैमाने पर संस्कृतियों का उपयोग वायरल टीकों और अन्य जैव प्रौद्योगिकी रूप से व्युत्पन्न उत्पादों के औद्योगिक उत्पादन में किया जाता है। मानव स्टेम कोशिकाओं को कोशिकाओं की संख्या का विस्तार करने और प्रत्यारोपण उद्देश्यों के लिए कोशिकाओं को विभिन्न दैहिक सेल प्रकारों में अलग करने के लिए सुसंस्कृत किया जाता है।
ऊतक के नमूने
ऊतक शब्द एक सेलुलर मध्यवर्ती का वर्णन करता है, जहां कोशिका सामग्री कोशिकाओं और एक पूर्ण अंग के बीच एक संगठनात्मक स्तर पर होती है। ऊतक में, समान कोशिकाएं, एक ही मूल से जो एक साथ एक विशिष्ट कार्य करती हैं, इकट्ठी होती हैं। कई ऊतकों के कार्यात्मक समूहीकरण से, अंगों की जटिल संरचनाएं बनती हैं।
ऊतक का नमूना जीव विज्ञान, ऊतक विज्ञान/हिस्टोपैथोलॉजी, पैरासाइटोलॉजी, बायोकेमिस्ट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में अनुसंधान के साथ-साथ डीएनए की खेती और निकालने के लिए लिया जाता है। इसे पशु (उपखंड: स्तनपायी ऊतक) और पौधे के ऊतकों के बीच प्रतिष्ठित किया जा सकता है। जानवरों के ऊतकों को चार बुनियादी प्रकार के संयोजी, मांसपेशियों, तंत्रिका और उपकला ऊतक में बांटा जाता है। पौधे के ऊतकों को निम्नलिखित तीन ऊतक प्रणालियों में विभाजित किया गया है: एपिडर्मिस, जमीन ऊतक और संवहनी ऊतक।
ऊतक के नमूने जानवरों या पौधों के हिस्सों, जैसे हड्डी, मांसपेशियों, पत्तियों आदि से तैयार किए जा सकते हैं।
शरीर के तरल पदार्थ
रक्त, सीरम, प्लाज्मा, मस्तिष्कमेरु द्रव, लार और श्लेष द्रव शरीर के तरल पदार्थ हैं, जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक जानकारी का एक बड़ा स्रोत प्रदान करते हैं। इसलिए, विश्लेषण के लिए शरीर के तरल पदार्थ के नमूनों की एक परिष्कृत तैयारी महत्वपूर्ण है। पहली कठिनाई शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद घटकों की व्यापक गतिशील रेंज से जुड़ी है।
प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण
ब्रैडफोर्ड परख, लोरी परख और बाइसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) परख प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए आम परख हैं। बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन मानक में से एक है।
lysis बफर
लाइसिस बफर को सेल सामग्री या ऊतक (ऊतक संस्कृति, पौधे, बैक्टीरिया, कवक, आदि) के अनुसार चुना जाना चाहिए, और क्या कोशिकाएं संरचना और संरचना के प्रकार में हैं। प्रोटीन, झिल्ली और जीवों के निष्कर्षण के लिए लसीका बफर की एक विस्तृत श्रृंखला एक या अधिक डिटर्जेंट के साथ तैयार की जाती है। डिटर्जेंट को आमतौर पर परीक्षण-और-त्रुटि परीक्षणों के माध्यम से चुना जाता है या – यदि उपलब्ध हो – एक मौजूदा प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल के अनुसार। डिटर्जेंट ऊतक स्रोत और प्रोटीन के साथ संगत होना चाहिए। सामान्य तौर पर, सबसे हल्का डिटर्जेंट जो एक विशिष्ट ऊतक / प्रोटीन के लिए काम करता है, निकालने की अधिकतम कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए चुना जाता है। इसके अलावा, झिल्ली और ऑर्गेनेल के निष्कर्षण के मामले में, एक हल्का डिटर्जेंट झिल्ली को बरकरार रखता है। लाइसिस बफ़र्स में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले डिटर्जेंट ज्यादातर नॉनऑनिक या ज़्विटेरियोनिक होते हैं, जैसे सीएचएपीएस, डीऑक्सीकोलेट, ट्राइटन™ एक्स-100, एनपी40 और ट्वीन 20।
उदाहरण के लिए, मस्तिष्क, यकृत, आंत, गुर्दे, प्लीहा आदि जैसे ऊतकों को आरआईपीए के साथ बफर किया जा सकता है – हालांकि, प्रोटीज इनहिबिटर और डीटीटी (जैसे जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए) को शामिल किया जाना चाहिए।
कंकाल की मांसपेशी ऊतक (बर्फ ठंड) के लिए लाइसिस बफर: 20 एमएम ट्रिस (पीएच 7.8), 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2, 1% ट्राइटन एक्स-100, 10% (डब्ल्यू / वी) ग्लिसरॉल, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम डिथियोथ्रेइटोल प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक
सामान्य बफ़र्स की तालिका और उनकी पीएच रेंज। सामान्य तौर पर, इन बफ़र्स का उपयोग आमतौर पर 20-50 मिमी की सांद्रता में किया जाता है।
| बफ़र | पीएच रेंज |
|---|---|
| साइट्रिक एसिड – नाओह | 2.2 – 6.5 |
| सोडियम साइट्रेट – साइट्रिक एसिड | 3.0 – 6.2 |
| सोडियम एसीटेट – एसीटिक अम्ल | 3.6 – 5.6 |
| कैकोडाइलिक एसिड सोडियम नमक – एचसीएल | 5.0 – 7.4 |
| एमईएस – नाओह | 5.6 – 6.8 |
| सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट – डिसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट | 5.8 – 8.0 |
| इमिडाज़ोल – एचसीएल | 6.2 – 7.8 |
| एमओपीएस – कोह | 6.6 – 7.8 |
| ट्राइथेनॉलमाइन हाइड्रोक्लोराइड – नाओह | 6.8 – 8.8 |
| ट्रिस – एचसीएल | 7.0 – 9.0 |
| हेप्स – नाओह | 7.2 – 8.2 |
| ट्रिसीन – नाओह | 7.6 – 8.6 |
| सोडियम टेट्राबोरेट – बोरिक एसिड | 7.6 – 9.2 |
| बिसीन – नाओह | 7.7 – 8.9 |
| ग्लाइसिन – नाओह | 8.6 – 10.6 |
अधिकांश बफ़र्स तापमान के साथ पीएच-निर्भरता दिखाते हैं। यह ट्रिस बफ़र्स के लिए विशेष रूप से सच है। पीकेए 8.06 से 25 डिग्री सेल्सियस पर 8.85 डिग्री सेल्सियस पर 0 डिग्री सेल्सियस में बदल जाता है।
(एक बफर का पीएच और पीकेए: पीएच एक जलीय घोल में हाइड्रोजन आयनों की एकाग्रता को मापता है। पीकेए (= एसिड पृथक्करण स्थिरांक) एक संबंधित, लेकिन अधिक विशिष्ट उपाय है, जिसमें यह भविष्यवाणी करने में मदद करता है कि एक अणु एक विशिष्ट पीएच मान पर कैसे कार्य करेगा।
ट्राइज़ोल
ट्राइज़ोल एक रासायनिक समाधान है जिसका उपयोग गुआनिडिनियम थायोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के दौरान आरएनए/डीएनए/प्रोटीन निकालने के लिए किया जाता है। अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त ट्राइज़ोल निष्कर्षण के उपयोग से एक ही नमूने से उच्च डीएनए, आरएनए और प्रोटीन पैदावार होती है और अन्य निष्कर्षण विधियों में उत्कृष्टता प्राप्त होती है।
साहित्य/संदर्भ
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.