पश्चिमी सोख्ता के लिए अल्ट्रासोनिक Lysis
- पश्चिमी धब्बा ऊतक समरूप या सेल निकालने के नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया है।
- पश्चिमी धब्बा चलाने के लिए या एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए, कई परखों को सेल में फंसे सामग्री (जैसे प्रोटीन, डीएनए, उपकोशिकीय टुकड़े) तक पहुंच की आवश्यकता होती है।
- सोनिकेशन नियंत्रित सेल व्यवधान और लसीका के लिए एक विश्वसनीय और आसान-से-संभाल विधि है।
अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान
ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण कई जैविक, जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों (पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, आदि) या प्रोटीन शुद्धि के लिए पहला कदम है। उच्च प्रोटीन उपज प्राप्त करने के लिए, सेल सामग्री और ऊतक को कुशलता से बाधित? चाहे पौधे कोशिका हो या पशु ऊतक, सोनिकेशन आपके सेल लाइसेट को आसान और तेज़ तैयार करने की विधि है।
सोनिकेशन के लाभ
- तेज & कार्य-कुशल
- आसान कामकाज
- उच्च प्रोटीन उपज
- प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य/दोहराने योग्य
- ठीक से नियंत्रित
- स्केलेबल
VialTweeter sonicator अल्ट्रासोनिक नमूना प्रस्तुत करने के लिए जैसे सेल व्यवधान और प्रोटीन अलगाव
पश्चिमी इम्यूनोब्लोटिंग के लिए इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रोटोकॉल
A. अभिकर्मक
समाधान की तैयारी के लिए, शुद्ध पानी जैसे मिल्ली-क्यू का उपयोग करें।
- 1X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
- 1X सेल लाइसिस बफर: 20 एमएम ट्रिस (पीएच 7.5), 150 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम ईजीटीए, 1% ट्राइटन एक्स-100, 2.5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 1 एमएम एनए3वीओ4, 1 माइक्रोग्राम/एमएल ल्यूपेप्टिन
महत्वपूर्ण: तुरंत उपयोग करने से पहले 1 मिमी PMSF जोड़ें. - 15 μl प्रोटीन ए + 15 μl प्रोटीन जी आईपी के लिए पर्याप्त है, लेकिन यह आपके प्राथमिक एंटीबॉडी और नमूना मात्रा पर निर्भर हो सकता है। आप पूर्व-मिश्रित प्रोटीन ए? जी एगारोज का भी उपयोग कर सकते हैं (उदाहरण के लिए खरगोश आईजीजी पुल डाउन के लिए प्रोटीन ए और माउस आईजीजी पुल डाउन के लिए प्रोटीन जी)
- 3X एसडीएस नमूना बफर: 187.5 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8 25 डिग्री सेल्सियस पर), 6% डब्ल्यू? वी एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 150 एमएम डीटीटी, 0.03% डब्ल्यू? वी ब्रोमोफेनॉल नीला
B. सेल Lysates की तैयारी
- कोशिकाओं की कटाई करें। nondenaturing शर्तों के तहत कोशिकाओं फसल के लिए, मीडिया को हटाने और बर्फ ठंड पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला.
- पीबीएस निकालें और प्रत्येक थाली (10 सेमी) के लिए 0.5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा 1X सेल lysis बफर जोड़ने के लिए और 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्लेटों सेते हैं.
- प्लेटों से कोशिकाओं को खुरचें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखें।
- बर्फ-ठंडे इम्यूनोप्रिपिटेशन बफर (आईपी बफर: 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल [पीएच 7.4], 150 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 0.1% एनपी -40 और प्रोटीज इनहिबिटर मिक्स) में 10 सेकंड के लिए दो बार सोनिकेट करें। sonication के लिए, वायलट्वीटर या एक जांच अल्ट्रासोनिकेटर जैसे यूपी100एच नहीं तो यूपी200एचटी सबसे उपयुक्त हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 ग्राम पर lysates अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण. (यदि आवश्यक हो, तो लाइसेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- सतह पर तैरनेवाला करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सतह पर तैरनेवाला प्रकाश आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन है। प्राथमिक एंटीबॉडी आमतौर पर पश्चिमी सोख्ता के लिए उपयोग की जाने वाली राशि से 10x अधिक केंद्रित मात्रा में जोड़ा जाता है। (आप 1μg प्रति 100μL से शुरू कर सकते हैं।
- सतह पर तैरनेवाला तो एक और 1 घंटे के लिए प्रोटीन एक agarose (Invitrogen) और प्रोटीन जी agarose की समान मात्रा के मिश्रण के साथ आगे ऊष्मायन है.
- आईपी बफर के साथ agarose छर्रों तीन बार धो लें. बाद में, एसडीएस पेज लोड हो रहा है बफर के साथ बाध्य प्रोटीन निकालने के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी.
C. इम्यूनोप्रिपिटेशन
- 200 μl सेल लाइसेट लें और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोमल कमाल के साथ सेते हैं.
- या तो प्रोटीन ए या जी एगरोज मोती (50% मनका घोल के 20 माइक्रोन) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घंटे के लिए कोमल कमाल के साथ सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज। 1X सेल lysis बफर के 500 μl के साथ पांच बार गोली धो लें। धोने के दौरान बर्फ पर रखें।
- 20 μl 3X एसडीएस नमूना बफर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। भंवर, फिर 30 सेकंड के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज।
- नमूना को 2-5 मिनट के लिए 95-100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 14,000 X ग्राम पर 1 मिनट के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज करें।
- एसडीएस-पेज जेल (12-15%) पर नमूना (15-30 माइक्रोन) लोड करें।
- पश्चिमी सोख्ता द्वारा नमूना का विश्लेषण.
Sonicator UP50H के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
प्रोब-टाइप सोनिकेटर UP50H का उपयोग करके प्रोटोकॉल का उपयोग क्रिबिस्क एट अल (2011) के अध्ययन में किया गया था:
कुल प्रोटीन को MC3T3-E1 कोशिकाओं से 1,25 (OH) के साथ इलाज किया गया था2D3 (10−8 एम) या वाहन। कोशिकाओं को 50 एमएम ट्रिस एचसीएल, पीएच 8 (सिग्मा-एल्ड्रिच) युक्त बफर के साथ lysed किया गया था; 150 मिमी NaCl (फिशर वैज्ञानिक); 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) (फिशर साइंटिफिक); 1% IGEPAL CA-630 (सिग्मा-एल्ड्रिच) और 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट (मर्क)। सेल lysate चक्र 1 पर 2 × 10 s के लिए sonicated किया गया था और आयाम 80 के साथ UP50H अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर (Hielscher, अल्ट्रासाउंड प्रौद्योगिकी, Teltow, जर्मनी). इसके बाद सामग्री 14,000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए centrifuged था और सतह पर तैरनेवाला पश्चिमी सोख्ता के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रोटीन के पच्चीस μg नमूना बफर और एजेंट (इनविट्रोजन) को कम करने में उबला हुआ था और बाद में एसडीएस-पेज द्वारा 4-12% पॉलीक्रिलामाइड जैल (इनविट्रोजन) का उपयोग करके अलग किया गया था और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (जीई स्वास्थ्य देखभाल) में स्थानांतरित किया गया था। झिल्ली टीबीएस (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल; पीएच 7.6; 150 एमएम एनएसीएल) के साथ 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था जिसमें 1% कैसिइन (सिग्मा-एल्ड्रिच) और 1% ट्रिस (1 एम) था। अवरुद्ध करने के बाद, झिल्ली प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी मानव सीबीएस 1/500, प्रो आर बनर्जी, एन आर्बर, एमआई, यूएसए की प्रयोगशाला में विकसित) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मामूली आंदोलन के साथ ऊष्मायन किया गया था. एक हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचपीआर) -संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (डाको) के साथ इनक्यूबेशन कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए किया गया था। सभी धब्बों को बढ़ाया केमिलुमिनेसेंस (पर्किन एल्मर) द्वारा विकसित किया गया था।
अल्ट्रासोनिक सेल lysis और निष्कर्षण, lysate तैयारी और प्रक्रिया में सुधार के लिए सिफारिशों के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं के बारे में अधिक पढ़ने के लिए यहां क्लिक करें!
नीचे दी गई तालिका आपको हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| अनुशंसित उपकरण | बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96-वेल प्लेट सोनिकेटर | मल्टी-वेल? माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. |
| अल्ट्रासोनिक CupHorn | शीशियों या बीकर के लिए CupHorn | एन.ए. |
| जीडीमिनी2 | अल्ट्रासोनिक माइक्रो-फ्लो रिएक्टर | एन.ए. |
| वायलट्वीटर | 0.5 से 1.5mL | एन.ए. |
| यूपी100एच | 1 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट |
| यूपी200एचटी, यूपी200सेंट | 10 से 1000mL | 20 से 200mL/मिनट |
| UP400St | 10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट |
| अल्ट्रासोनिक चलनी शेकर | एन.ए. | एन.ए. |
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UIP400MTP प्लेट सोनिकेटर 96-अच्छी प्लेटों के उच्च-थ्रूपुट सोनिकेशन के लिए
वेस्टर्न ब्लॉटिंग के बारे में
धब्बे विश्लेषणात्मक प्रक्रियाएं हैं जहां डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को एक वाहक पर स्थानांतरित किया जाता है ताकि वे अलग हो सकें।
दक्षिणी धब्बा का उपयोग डीएनए का पता लगाने के लिए, आरएनए के लिए उत्तरी धब्बा और प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा के लिए किया जाता है।
वेस्टर्न ब्लॉटिंग को प्रोटीन इम्यूनोब्लोटिंग भी कहा जाता है क्योंकि एक एंटीबॉडी का उपयोग विशेष रूप से इसके एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है। नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग सबसे महत्वपूर्ण विश्लेषण विधियों में से एक है। पश्चिमी धब्बा में, मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके उनका पता लगाने के लिए प्रोटीन को झिल्ली पर स्थिर किया जाता है।
एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा देशी प्रोटीन को पॉलीपेप्टाइड की लंबाई से 3-डी संरचना या विकृत प्रोटीन द्वारा अलग किया जाता है। प्रोटीन को तब एक झिल्ली (आमतौर पर नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ) में स्थानांतरित किया जाता है, जहां वे लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग जाते हैं। जेल वैद्युतकणसंचलन कदम एंटीबॉडी की पार प्रतिक्रियाशीलता के मुद्दे को हल करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में शामिल है.
बाद में, अलग प्रोटीन को एक मैट्रिक्स (ज्यादातर नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ झिल्ली पर) पर धब्बा दिया जाता है, जहां वे एंटीबॉडी के साथ दाग जाते हैं। एंटीबॉडी एक जांच के रूप में कार्य करते हैं और विशेष रूप से लक्ष्य प्रोटीन के लिए चुने जाते हैं। विशिष्ट प्रतिक्रिया के स्थान और तीव्रता के विश्लेषण से दिए गए नमूने में लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति विवरण का पता चलता है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग लक्ष्य प्रोटीन का पता लगा सकता है जो जेल वैद्युतकणसंचलन के उच्च रिज़ॉल्यूशन और मजबूत विशिष्टता और इम्यूनोसे की उच्च संवेदनशीलता के कारण 1ng जितना कम है। पश्चिमी धब्बा विधि का उपयोग आणविक जीव विज्ञान, जैव रसायन, इम्यूनोजेनेटिक्स और अन्य आणविक अनुसंधान क्षेत्रों में किया जाता है।
अन्य संबंधित तकनीकों में डॉट ब्लॉट विश्लेषण, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री शामिल हैं जहां एंटीबॉडी का उपयोग इम्यूनोस्टेनिंग और एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) द्वारा ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है।
साहित्य/सन्दर्भ
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.
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