पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए अल्ट्रासोनिक लसीज़

• वेस्टर्न ब्लॉट ऊतक homogenate या सेल निकालने का एक नमूना में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया है।
• एक पश्चिमी धब्बा चलाने के लिए या एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए, कई assays सामग्री (जैसे प्रोटीन, डीएनए, subcellular टुकड़े) सेल में फँस के लिए उपयोग की आवश्यकता है।
• Sonication नियंत्रित सेल विघटन और lysis के लिए एक विश्वसनीय और आसानी से संभाल तरीका है।

अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान

ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण कई जैविक जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों (पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, आदि) या प्रोटीन शोधन के लिए पहला कदम है। एक उच्च प्रोटीन उपज प्राप्त करने के लिए, सेल सामग्री और ऊतक कुशलता से बाधित किया जाना चाहिए / lysed। संयंत्र सेल या जानवरों के ऊतकों हैं, sonication के अपने सेल lysate आसान और तेजी से तैयार करने के लिए तरीका है।

Sonication के लाभ

• उपवास & कुशल
• आसान कामकाज
• उच्च प्रोटीन उपज
• प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य / repeatable
• ठीक नियंत्रित
• स्केलेबल

प्रतिरक्षक अवक्षेपण प्रोटोकॉल पश्चिमी immunoblotting के लिए

ए अभिकर्मकों

समाधान की तैयारी के लिए, ऐसे मिल्ली क्यू के रूप में शुद्ध पानी का उपयोग करें।

• 1X फास्फेट बफर खारा (पीबीएस)
• 1X सेल Lysis बफर: 20 मिमी Tris (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1% ट्राइटन X-100, 2.5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 मिमी β-glycerophosphate, 1 मिमी Na3VO4, 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर leupeptin
  महत्वपूर्ण: जोड़े 1 मिमी PMSF तुरंत उपयोग करने से पहले।
• 15 μl प्रोटीन ए + 15 μl प्रोटीन जी आईपी के लिए पर्याप्त है, लेकिन यह अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी और नमूना मात्रा पर निर्भर हो सकता। तुम भी पूर्व मिश्रित प्रोटीन ए / जी agarose उपयोग कर सकते हैं (जैसे प्रोटीन एक खरगोश के लिए आईजीजी नीचे खींच और माउस आईजीजी के लिए प्रोटीन जी नीचे खींच)
• 3X एसडीएस नमूना बफर: 187.5 मिमी Tris-एचसीएल (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 6.8), 6% w / v एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 150 मिमी डीटीटी, डब्ल्यू 0.03% / v bromophenol नीले

सेल lysates बी तैयारी

• कोशिकाओं जल को संचित करें। nondenaturing शर्तों के तहत कोशिकाओं फसल के लिए, मीडिया को हटा दें और ठंडा पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला।
• पीबीएस निकालें और प्रत्येक प्लेट (10 सेमी) के लिए 0.5 मिलीलीटर ठंडा 1X सेल बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्लेटें सेते हैं।
• प्लेटों बंद कोशिकाओं को स्क्रैप और microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण। बर्फ पर रखें।
• Sonicate दो बार ठंडा प्रतिरक्षक अवक्षेपण बफर में 10 सेकंड के लिए (आईपी बफर: 50 मिमी Tris-एचसीएल [7.4 पीएच], 150 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 0.1% एनपी 40 और प्रोटीज अवरोध करनेवाला मिश्रण)। sonication के लिए, VialTweeter या एक जांच ultrasonicator के रूप में इस तरह के UP100H या UP200Ht सबसे उपयुक्त हैं।
• 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 ग्राम पर lysates अपकेंद्रित्र।
• एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। (यदि आवश्यक हो, lysate -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता।)
• सतह पर तैरनेवाला के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सतह पर तैरनेवाला प्रकाश आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट है। प्राथमिक एंटीबॉडी आम तौर पर एक राशि 10x से पश्चिमी सोख्ता के लिए प्रयोग किया जाता है अधिक केंद्रित में जोड़ा जाता है। (आप 100μL प्रति 1μg के साथ शुरू कर सकते हैं।)
• सतह पर तैरनेवाला तो प्रोटीन ए-agarose (Invitrogen) और एक अन्य 1 घंटे के लिए प्रोटीन जी agarose की बराबर मात्रा के मिश्रण के साथ आगे इनक्यूबेट है।
• agarose छर्रों आईपी बफर के साथ तीन बार धोएं। बाद में, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से एसडीएस-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर के साथ बाध्य प्रोटीन निकालने।

सी Immunoprecipitation

• 200 μl सेल lysate ले लो और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। कोमल 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में कमाल के साथ सेते हैं।
• या तो प्रोटीन एक या जी agarose मोती (50% मनका घोल का 20 μl) जोड़ें। कोमल 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घंटे के लिए कमाल के साथ सेते हैं।
• 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए microcentrifuge। धो 1X सेल बफर के 500 μl के साथ पांच बार गोली। धोने के दौरान बर्फ पर रखें।
• 20 μl 3X एसडीएस नमूना बफर के साथ गोली Resuspend। भंवर, तो 30 सेकंड के लिए microcentrifuge।
• पर 14,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए 2-5 मिनट के लिए 95-100 डिग्री सेल्सियस और microcentrifuge के लिए नमूना गरम करें।
• एसडीएस-पृष्ठ जेल (12-15%) पर नमूना (15-30 μl) लोड करें।
• पश्चिमी सोख्ता द्वारा नमूना विश्लेषण करें।

ultrasonicator UP50H साथ वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण

बाद प्रोटोकॉल Kriebisch एट अल के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। (2011):
कुल प्रोटीन 1,25 के साथ इलाज किया MC3T3-ई 1 कोशिकाओं से अलग किया गया था (OH)₂डी₃ (10^-8 एम) या वाहन। कोशिकाओं एक बफर 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8 (सिग्मा Aldrich) युक्त के साथ lysed थे; 150 मिमी NaCl (फिशर साइंटिफिक); 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) (फिशर साइंटिफिक); 1% IGEPAL CA-630 (सिग्मा Aldrich) और 0.5% सोडियम deoxycholate (मर्क)। सेल lysate चक्र 1 में 2 × 10 एस के लिए sonicated और साथ 80 आयाम था UP50H अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर (Hielscher, अल्ट्रासाउंड प्रौद्योगिकी, Teltow, जर्मनी)। उसके बाद सामग्री को 14,000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए केंद्रित किया गया था और सतह पर तैरनेवाला पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रोटीन के पच्चीस μg प्रोटीन बफर और कम करने वाले एजेंट (Invitrogen) में उबला हुआ था और बाद में 4-12% polyacrylamide जैल (Invitrogen) का उपयोग करके एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और एक नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली (जीई स्वास्थ्य देखभाल) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को टीबीएस (10 एमएम ट्राइस-एचसीएल; पीएच 7.6; 150 मिमी NaCl) के साथ 1 एच के लिए अवरुद्ध कर दिया गया था जिसमें 1% केसिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) और 1% ट्राइस (1 एम) था। अवरुद्ध करने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश एंटी-मानव सीबीएस 1/500, प्रोफेसर आर। बनर्जी, एन आर्बर, एमआई, यूएसए की प्रयोगशाला में विकसित) के साथ झिल्ली को थोड़ी देर रात 4 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। एक हर्सरडिश पेरोक्साइड (एचपीआर) के साथ ऊष्मायन -कंजित द्वितीयक एंटीबॉडी (डको) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए किया गया था। सभी ब्लॉट्स बढ़ाया chemiluminescence (पेर्किन एल्मर) द्वारा विकसित किए गए थे।

साहित्य/संदर्भ