वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए अल्ट्रासोनिक लिसिस

• वेस्टर्न ब्लॉट ऊतक होमोजेनेट या कोशिका अर्क के नमूने में विशिष्ट प्रोटीनों का पता लगाने की एक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया है।
• वेस्टर्न ब्लॉट करने या एंज़ाइम गतिविधि मापने के लिए, कई परीक्षणों में कोशिका के भीतर फँसे पदार्थों (जैसे प्रोटीन, DNA, उपकोशिकीय खंड) तक पहुँच आवश्यक होती है।
• सोनिकेशन नियंत्रित कोशिका विघटन और लिसिस के लिए एक विश्वसनीय और उपयोग में आसान विधि है।

अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन

ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण कई जैविक, जैवरासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों (PAGE, वेस्टर्न ब्लॉटिंग, ELISA, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आदि) या प्रोटीन शुद्धीकरण का पहला चरण है। प्रोटीन की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए, कोशिकीय सामग्री और ऊतक का कुशलतापूर्वक विघटन/लिसिस करना आवश्यक है। चाहे पादप कोशिका हो या जंतु ऊतक, सोनिकेशन आपके कोशिका लाइसेट को आसानी से और तेज़ी से तैयार करने की विधि है।

सोनिकेशन के लाभ

• तेज़ और कुशल
• आसान संचालन
• प्रोटीन की उच्च उपज
• पुनरुत्पादनीय/पुनरावर्तनीय
• सटीक रूप से नियंत्रित
• बड़े पैमाने पर लागू करने योग्य

वेस्टर्न इम्यूनोब्लॉटिंग के लिए इम्यूनोप्रेसिपिटेशन प्रोटोकॉल

A. अभिकर्मक

विलयन तैयार करने के लिए Milli-Q जैसे शुद्ध जल का उपयोग करें।

• 1X फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (PBS)
• 1X कोशिका लिसिस बफर: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 mM β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml ल्यूपेप्टिन
  महत्वपूर्ण: उपयोग से ठीक पहले 1 mM PMSF मिलाएँ।
• 15 μl प्रोटीन A+15 μl प्रोटीन G, IP के लिए पर्याप्त है, लेकिन यह आपकी प्राथमिक एंटीबॉडी और नमूने के आयतन पर निर्भर हो सकता है। आप पहले से मिश्रित प्रोटीन A/ G एगरोज़ का भी उपयोग कर सकते हैं (जैसे खरगोश IgG पुल-डाउन के लिए प्रोटीन A और चूहे IgG पुल-डाउन के लिए प्रोटीन G)
• 3X SDS नमूना बफर: 187.5 mM Tris-HCl (25°C पर pH 6.8), 6% w/v SDS, 30% ग्लिसरॉल, 150 mM DTT, 0.03% w/v ब्रोमोफेनॉल ब्लू

B. कोशिका लाइसेट तैयार करना

• कोशिकाएँ एकत्र करें। प्रोटीनों को विकृत किए बिना कोशिकाएँ एकत्र करने के लिए, संवर्धन माध्यम हटाएँ और बर्फ जैसे ठंडे PBS से कोशिकाओं को एक बार धोएँ।
• PBS हटाएँ और प्रत्येक प्लेट (10 cm) में 0.5 ml बर्फ जैसा ठंडा 1X कोशिका लिसिस बफर मिलाएँ तथा प्लेटों को बर्फ पर 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
• प्लेटों से कोशिकाओं को खुरचकर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखें।
• बर्फ जैसे ठंडे इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर में दो बार, प्रत्येक बार 10 सेकंड तक सोनिकेशन करें (IP बफर: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 और प्रोटीएज़ अवरोधक मिश्रण)। सोनिकेशन के लिए, VialTweeter या कोई प्रोब अल्ट्रासोनिकेटर जैसे UP100H या UP200Ht सबसे उपयुक्त हैं।
• लाइसेट को 4°C पर 15,000 g पर 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें।
• अधिप्लावी को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। (आवश्यकता होने पर लाइसेट को –80°C पर भंडारित किया जा सकता है।)
• अधिप्लावी में प्राथमिक एंटीबॉडी मिलाएँ। प्राथमिक एंटीबॉडी वाले अधिप्लावी को हल्के से हिलाते हुए 4°C पर 1 h तक इनक्यूबेट किया जाता है। प्राथमिक एंटीबॉडी आमतौर पर वेस्टर्न ब्लॉटिंग में उपयोग की जाने वाली सांद्रता से 10x अधिक सांद्रता में मिलाई जाती है। (आप प्रति 100μL में 1μg से शुरुआत कर सकते हैं।)
• इसके बाद अधिप्लावी को प्रोटीन A-एगरोज़ (Invitrogen) और प्रोटीन G एगरोज़ की समान मात्राओं के मिश्रण के साथ अतिरिक्त 1 h तक इनक्यूबेट किया जाता है।
• एगरोज़ पेलेटों को IP बफर से तीन बार धोएँ। इसके बाद SDS-PAGE लोडिंग बफर के साथ 95°C पर 5 मिनट तक गर्म करके बंधे हुए प्रोटीनों का निष्कर्षण करें।

C. इम्यूनोप्रेसिपिटेशन

• 200 μl कोशिका लाइसेट लें और प्राथमिक एंटीबॉडी मिलाएँ। धीरे-धीरे आगे-पीछे झुलाते हुए 4°C पर रात भर इनक्यूबेट करें।
• प्रोटीन A या G एगरोज़ बीड्स मिलाएँ (50% बीड स्लरी के 20 μl)। धीरे-धीरे आगे-पीछे झुलाते हुए 4°C पर 1–3 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
• 4°C पर 30 सेकंड तक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज करें। पेलेट को 1X कोशिका लिसिस बफर के 500 µl से पाँच बार धोएँ। धोने के दौरान बर्फ पर रखें।
• पेलेट को 20 μl 3X SDS नमूना बफर में पुनः निलंबित करें। वॉर्टेक्स करें, फिर 30 सेकंड तक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज करें।
• नमूने को 95–100°C पर 2–5 मिनट तक गर्म करें और 14,000 X g पर 1 मिनट तक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज करें।
• नमूने (15–30 μl) को SDS-PAGE जेल (12–15%) पर लोड करें।
• वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा नमूने का विश्लेषण करें।

सोनिकेटर UP50H के साथ वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

प्रोब-प्रकार के सोनिकेटर UP50H का उपयोग करने वाला निम्नलिखित प्रोटोकॉल Kriebisch और सहकर्मियों (2011) के अध्ययन में उपयोग किया गया था:
कुल प्रोटीन MC3T3-E1 कोशिकाओं से पृथक किया गया, जिन्हें 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) या वाहक से उपचारित किया गया था। कोशिकाओं का लिसिस ऐसे बफर से किया गया जिसमें 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) और 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट (Merck) थे। कोशिका लाइसेट का चक्र 1 और आयाम 80 पर 2 × 10 s तक सोनिकेशन करने के लिए UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany) का उपयोग किया गया। इसके बाद सामग्री को 14,000 rpm पर 10 min तक सेंट्रीफ्यूज किया गया और अधिप्लावी का उपयोग वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए किया गया। पच्चीस μg प्रोटीन को नमूना बफर और अपचायक अभिकर्मक (Invitrogen) में उबाला गया और फिर 4–12% पॉलीएक्रिलामाइड जेलों (Invitrogen) का उपयोग करके SDS-PAGE द्वारा अलग किया गया तथा नाइट्रोसेल्युलोज़ झिल्ली (GE health care) पर स्थानांतरित किया गया। झिल्ली को 1% केसीन (Sigma-Aldrich) और 1% Tris (1 M) युक्त TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) से 1 h तक ब्लॉक किया गया। ब्लॉकिंग के बाद, झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश में विकसित मानव CBS के विरुद्ध एंटीबॉडी, 1/500, जिसे प्रो. R. Banerjee की प्रयोगशाला, Ann Arbor, MI, USA में विकसित किया गया था) के साथ हल्के से हिलाते हुए 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। हॉर्सरैडिश पेरॉक्सिडेज़ (HPR) से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (Dako) के साथ कमरे के तापमान पर 1 h तक इनक्यूबेशन किया गया। सभी ब्लॉटों को एन्हांस्ड केमिल्यूमिनेसेंस (Perkin Elmer) द्वारा विकसित किया गया।
 

अल्ट्रासोनिक कोशिका लिसिस और निष्कर्षण की सर्वोत्तम कार्यप्रथाओं, लाइसेट तैयार करने और प्रक्रिया में सुधार की अनुशंसाओं के बारे में अधिक पढ़ने के लिए यहाँ क्लिक करें!
 
नीचे दी गई तालिका हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटरों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:

साहित्य / संदर्भ

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.