औद्योगिक उत्पादन में जैव-अभियांत्रिकी से विकसित कोशिकाओं का अल्ट्रासोनिक लयन

जैव-अभियांत्रिकी से विकसित E. coli जैसी जीवाणु प्रजातियों के साथ-साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित स्तनधारी और पादप कोशिका प्रकारों का जैव प्रौद्योगिकी में अणुओं की अभिव्यक्ति के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इन संश्लेषित जैव-अणुओं को मुक्त करने के लिए एक विश्वसनीय कोशिका विघटन तकनीक आवश्यक है। उच्च-प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेशन कुशल और विश्वसनीय कोशिका लयन की एक प्रमाणित विधि है – जिसे अधिक प्रसंस्करण क्षमता के लिए आसानी से बड़े पैमाने पर अपनाया जा सकता है। Hielscher Ultrasonics उच्च गुणवत्ता वाले जैव-अणुओं का बड़ी मात्रा में उत्पादन करने हेतु प्रभावी कोशिका लयन के लिए उच्च-प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक उपकरण प्रदान करता है।

कोशिका कारखानों से अणुओं का निष्कर्षण

विभिन्न प्रकार के जैव-अणुओं के उत्पादन के लिए अनेक अभियांत्रिकीकृत सूक्ष्मजीवों और पादप कोशिकाओं का उपयोग सूक्ष्मजीवी कोशिका कारखानों के रूप में किया जा सकता है। इनमें कई अन्य के साथ Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana और शैवाल शामिल हैं। ये कोशिका कारखाने प्रोटीन, लिपिड, जैव-रसायन, बहुलक, जैव ईंधन और ओलियोकेमिकल्स का उत्पादन कर सकते हैं, जिनका उपयोग खाद्य पदार्थों के रूप में या औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए कच्चे माल के रूप में किया जाता है। कोशिका कारखानों के रूप में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं का संवर्धन बंद बायोरिएक्टरों में किया जाता है, जहाँ वे उच्च दक्षता, विशिष्टता और कम ऊर्जा आवश्यकताएँ प्राप्त कर सकती हैं।
जैव-अभियांत्रिकी से विकसित कोशिका संवर्धनों से लक्षित अणुओं को पृथक करने के लिए कोशिकाओं का विघटन करना आवश्यक है, ताकि अंतःकोशिकीय पदार्थ मुक्त हो सके। कोशिका विघटन और यौगिकों को मुक्त करने के लिए अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटनकारी उपकरणों का उपयोग एक अत्यंत विश्वसनीय और कुशल तकनीक के रूप में सुस्थापित है।

सूक्ष्मजीवी कोशिका कारखाने चयापचयी रूप से अभियांत्रिकीकृत कोशिकाएँ हैं, जिनका उपयोग विभिन्न मूल्यवान यौगिकों के संश्लेषण के लिए किया जाता है। अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन कोशिका के भीतर से मूल्यवान यौगिकों को मुक्त करने की एक कुशल और विश्वसनीय विधि है।
अध्ययन और चित्र: ©Villaverde, 2010.

अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटनकारी उपकरणों के लाभ

एक गैर-तापीय, सौम्य, फिर भी अत्यंत कुशल तकनीक के रूप में अल्ट्रासोनिक विघटनकारी उपकरणों का उपयोग प्रयोगशाला और उद्योग में कोशिकाओं के लयन तथा उच्च गुणवत्ता वाले अर्क तैयार करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए कोशिका कारखानों से अणुओं को पृथक करने में।

सूक्ष्मजीवी कोशिका कारखानों के कुशल विघटन के लिए उच्च-शक्ति अल्ट्रासाउंड

अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटनकारी उपकरणों की कार्यप्रणाली और प्रभाव:
अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन में अल्ट्रासाउंड तरंगों की शक्ति का उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र / कोशिका विघटक में टाइटेनियम मिश्रधातु से बना एक प्रोब (जिसे सोनोट्रोड भी कहते हैं) लगा होता है, जो लगभग 20 kHz की उच्च आवृत्ति पर दोलन करता है। इसका अर्थ है कि अल्ट्रासोनिक प्रोब सोनिकेशन किए जा रहे द्रव में प्रति सेकंड 20,000 कंपन संचारित करता है। द्रव में संचारित अल्ट्रासाउंड तरंगों की विशेषता बारी-बारी से आने वाले उच्च-दाब / निम्न-दाब चक्र हैं। निम्न-दाब चक्र के दौरान द्रव फैलता है और सूक्ष्म निर्वात बुलबुले बनते हैं। ये बहुत छोटे बुलबुले कई वैकल्पिक दाब चक्रों के दौरान बढ़ते रहते हैं, जब तक कि वे और अधिक ऊर्जा अवशोषित नहीं कर सकते। इस बिंदु पर कैविटेशन बुलबुले तीव्रता से अंतःस्फोटित होते हैं और स्थानीय स्तर पर असाधारण रूप से उच्च ऊर्जा घनत्व वाला वातावरण बनाते हैं। इस घटना को ध्वनिक कैविटेशन कहा जाता है और इसकी विशेषता स्थानीय स्तर पर अत्यधिक उच्च तापमान, अत्यधिक उच्च दाब और अपरूपण बल हैं। ये अपरूपण प्रतिबल कोशिका भित्तियों को कुशलतापूर्वक तोड़ते हैं और कोशिका के आंतरिक भाग तथा आसपास के विलायक के बीच द्रव्यमान अंतरण बढ़ाते हैं। पूर्णतः यांत्रिक तकनीक के रूप में, अल्ट्रासोनिक रूप से उत्पन्न अपरूपण बलों का व्यापक उपयोग होता है और जीवाणु कोशिका विघटन तथा प्रोटीन पृथक्करण के लिए यह अनुशंसित प्रक्रिया है। कोशिका विघटन की एक सरल और तीव्र विधि के रूप में, सोनिकेशन छोटे, मध्यम और बड़े आयतनों से पृथक्करण के लिए आदर्श है। Hielscher के डिजिटल अल्ट्रासोनिकेटर सोनिकेशन के सटीक नियंत्रण के लिए सेटिंग्स के एक स्पष्ट मेनू से सुसज्जित हैं। सोनिकेशन के सभी डेटा अंतर्निर्मित SD-कार्ड पर स्वचालित रूप से संग्रहीत होते हैं और आसानी से उपलब्ध होते हैं। अल्ट्रासोनिक विघटन प्रक्रिया के दौरान बाहरी शीतलन, पल्स मोड में सोनिकेशन आदि जैसे ऊष्मा अपव्यय के उन्नत विकल्प आदर्श प्रक्रिया तापमान बनाए रखना सुनिश्चित करते हैं और इस प्रकार निकाले गए ताप-संवेदनशील यौगिकों की अक्षुण्णता सुनिश्चित करते हैं।

अनुसंधान अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन और निष्कर्षण की खूबियों को रेखांकित करता है

प्रो. Chemat et al. (2017) अपने अध्ययन में निष्कर्ष प्रस्तुत करते हैं कि “अल्ट्रासाउंड-सहायित निष्कर्षण खाद्य और प्राकृतिक उत्पादों के लिए पारंपरिक तकनीकों का एक पर्यावरण-अनुकूल और आर्थिक रूप से व्यवहार्य विकल्प है। मुख्य लाभों में निष्कर्षण और प्रसंस्करण के समय, उपयोग की जाने वाली ऊर्जा और विलायकों की मात्रा, इकाई प्रचालनों तथा CO₂ के उत्सर्जन में कमी शामिल है।”
Gabig-Ciminska et al. (2014) ने अपने अध्ययन में DNA मुक्त करने के लिए बीजाणुओं के लयन हेतु एक उच्च-दाब होमोजेनाइज़र और एक अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक का उपयोग किया। कोशिका विघटन की दोनों विधियों की तुलना करते हुए, अनुसंधान दल बीजाणु DNA के लिए कोशिका लयन के संबंध में निष्कर्ष निकालता है कि “विश्लेषण उच्च-दाब समांगीकरण से प्राप्त कोशिका लयनों का उपयोग करके किया गया है। बाद में, हमने पाया कि इस उद्देश्य के लिए अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटन के उत्कृष्ट लाभ हैं। यह काफी तेज़ है और इससे छोटे नमूना आयतनों का प्रसंस्करण किया जा सकता है।” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

खाद्य उत्पादन के लिए कोशिका कारखानों से जैव-अणु

सूक्ष्मजीवी कोशिका कारखाने एक व्यवहार्य और कुशल उत्पादन पद्धति हैं, जिसमें बैक्टीरिया, यीस्ट, कवक आदि जैसे सूक्ष्मजीवों की चयापचयी जैव-अभियांत्रिकी के माध्यम से स्वाभाविक और गैर-स्वाभाविक मेटाबोलाइट्स की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए सूक्ष्मजीवों का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, बड़ी मात्रा में एंज़ाइमों का उत्पादन Aspergillus oryzae, कवक और बैक्टीरिया जैसे सूक्ष्मजीवों का उपयोग करके किया जाता है। बड़ी मात्रा में उत्पादित इन एंज़ाइमों का उपयोग खाद्य और पेय पदार्थों के उत्पादन के साथ-साथ कृषि, जैवऊर्जा और घरेलू देखभाल में किया जाता है।
Acetobacter xylinum और Gluconacetobacter xylinus जैसे कुछ बैक्टीरिया किण्वन प्रक्रिया के दौरान सेल्यूलोज़ का उत्पादन करते हैं, जिसमें नैनोफाइबर एक बॉटम-अप प्रक्रिया में संश्लेषित होते हैं। बैक्टीरियल सेल्यूलोज़ (जिसे सूक्ष्मजीवी सेल्यूलोज़ भी कहा जाता है) रासायनिक रूप से पादप सेल्यूलोज़ के समतुल्य होता है, लेकिन इसमें उच्च क्रिस्टलीयता और उच्च शुद्धता (लिग्निन, हेमिसेल्यूलोज़, पेक्टिन और अन्य जैवजनित घटकों से मुक्त) होती है। साथ ही, इसकी अनूठी संरचना सेल्यूलोज़ नैनोफाइबर से बुने हुए त्रि-आयामी (3D) जालिकावत नेटवर्क की होती है। (cf. Zhong, 2020) पादप-व्युत्पन्न सेल्यूलोज़ की तुलना में बैक्टीरियल सेल्यूलोज़ अधिक टिकाऊ होता है और उत्पादित सेल्यूलोज़ शुद्ध होता है, जिसके लिए जटिल शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता नहीं होती। बैक्टीरियल कोशिकाओं से बैक्टीरियल सेल्यूलोज़ को अलग करने के लिए अल्ट्रासोनिकेशन और NaOH या SDS (सोडियम डोडेसिल सल्फेट) का उपयोग करके विलायक निष्कर्षण बहुत प्रभावी हैं।

औषधि और टीका उत्पादन के लिए कोशिका कारखानों से जैव-अणु

कोशिका कारखानों से प्राप्त सबसे प्रमुख औषधीय उत्पादों में से एक मानव इंसुलिन है। जैव-अभियांत्रिकी द्वारा इंसुलिन के उत्पादन के लिए मुख्य रूप से E. coli और Saccharomyces cerevisiae का उपयोग किया जाता है। चूँकि जैव-संश्लेषित नैनो-आकार के अणु उच्च जैवसंगतता प्रदान करते हैं, इसलिए फेरिटिन जैसे जैविक नैनोकण अनेक जैव-विनिर्माण अनुप्रयोगों के लिए लाभकारी हैं। इसके अतिरिक्त, चयापचयी रूप से अभियांत्रित सूक्ष्मजीवों में उत्पादन अक्सर प्राप्त उपज के संदर्भ में उल्लेखनीय रूप से अधिक प्रभावी होता है। उदाहरण के लिए, आर्टेमिसिनिक अम्ल, रेस्वेराट्रॉल और लाइकोपीन का उत्पादन दस गुने से लेकर कई सौ गुने तक बढ़ गया है और औद्योगिक पैमाने पर उत्पादन पहले से स्थापित है या विकासाधीन है। (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
उदाहरण के लिए, स्वतः संयोजित होने के गुणों वाले प्रोटीन-आधारित नैनो-आकार के जैव-अणु, जैसे फेरिटिन और वायरस-सदृश कण, टीका विकास के लिए विशेष रूप से रुचिकर हैं, क्योंकि वे रोगजनकों के आकार और संरचना दोनों की नकल करते हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ अंतःक्रिया को बढ़ावा देने के लिए उनकी सतह पर एंटीजन का संयुग्मन किया जा सकता है। ऐसे अणु तथाकथित कोशिका कारखानों (जैसे, अभियांत्रित E. coli स्ट्रेन) में अभिव्यक्त किए जाते हैं, जो एक निश्चित लक्ष्य अणु का उत्पादन करते हैं।

फेरिटिन मुक्त करने के लिए E. coli BL21 के अल्ट्रासोनिक लयन का प्रोटोकॉल

फेरिटिन एक प्रोटीन है, जिसका प्राथमिक कार्य लोहे का भंडारण करना है। फेरिटिन टीकों में स्वतः संयोजित होने वाले नैनोकणों के रूप में आशाजनक क्षमताएँ दिखाता है, जहाँ इसका उपयोग टीका वितरण वाहक के रूप में किया जाता है (जैसे SARS-Cov-2 स्पाइक प्रोटीन)। Sun et. al. (2016) का वैज्ञानिक शोध दर्शाता है कि कम NaCl सांद्रताओं (≤50 mmol/L) पर Escherichia coli से पुनःसंयोजक फेरिटिन को घुलनशील रूप में मुक्त किया जा सकता है। E. coli BL21 में फेरिटिन को अभिव्यक्त करने और फेरिटिन को मुक्त करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक लागू किया गया। पुनःसंयोजक pET-28a/ferritin प्लाज़्मिड को E coli BL21 (DE3) स्ट्रेन में रूपांतरित किया गया। फेरिटिन वाली E coli BL21 (DE3) कोशिकाओं को 37°C पर 0.5% कानामाइसिन युक्त LB संवर्धन माध्यम में संवर्धित किया गया और 0.6 के OD600 पर 0.4% आइसोप्रोपिल-β-D-थायोगैलेक्टोपाइरानोसाइड से 37°C पर 3 घंटे के लिए प्रेरित किया गया। इसके बाद अंतिम संवर्धन को 4°C पर 10 मिनट के लिए 8000g पर अपकेंद्रीकरण करके एकत्र किया गया और पेलेट प्राप्त किया गया। फिर पेलेट को क्रमशः LB माध्यम (1% NaCl, 1% Typone, 0.5% यीस्ट अर्क)/लयन बफ़र (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) और NaCl विलयन की विभिन्न सांद्रताओं (0, 50, 100, 170, और 300 mmol/L) में पुनः निलंबित किया गया। बैक्टीरियल कोशिका लयन के लिए पल्स मोड में सोनिकेशन किया गया: उदाहरण के लिए, अल्ट्रासोनिकेटर UP400St का उपयोग 100% आयाम पर, 5 सेकंड चालू और 10 सेकंड बंद के कार्य चक्र के साथ, 40 चक्रों तक किया गया) और फिर 4°C पर 10 000g पर 15 मिनट तक अपकेंद्रण किया गया। अधिप्लवी और अवक्षेप का विश्लेषण सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (SDS-PAGE) द्वारा किया गया। सोडियम डोडेसिल सल्फेट से अभिरंजित सभी जेलों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनर से स्कैन किया गया। जेल छवियों का विश्लेषण Magic Chemi 1D सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया। सर्वोत्तम स्पष्टता के लिए, प्राचलों को समायोजित करके प्रोटीन बैंडों का पता लगाया गया। बैंडों के आँकड़े तीन तकनीकी पुनरावृत्तियों से प्राप्त किए गए। (cf. Sun et al., 2016)

कोशिका कारखानों के औद्योगिक लयन के लिए अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक

अल्ट्रासोनिक लयन और निष्कर्षण कोशिका कारखानों से चयापचयजों को मुक्त करने की एक विश्वसनीय और सुविधाजनक विधि है, जो लक्ष्य अणुओं के प्रभावी उत्पादन में सहायता करती है। अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक प्रयोगशाला से लेकर औद्योगिक आकार तक उपलब्ध हैं और प्रक्रियाओं का पैमाना पूरी तरह रैखिक रूप से बढ़ाया जा सकता है।
Hielscher Ultrasonics उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक विघटकों के लिए आपका सक्षम भागीदार है और उसे बेंच-टॉप तथा औद्योगिक परिवेशों में अल्ट्रासोनिक प्रणालियाँ स्थापित करने का दीर्घकालिक अनुभव है।
परिष्कृत हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर की बात करें तो Hielscher Ultrasonics की कोशिका विघटन प्रणालियाँ सर्वोत्तम प्रक्रिया नियंत्रण, आसान संचालन और उपयोगकर्ता-अनुकूलता की सभी आवश्यकताओं को पूरा करती हैं। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटरों के ग्राहक और उपयोगकर्ता इस लाभ को महत्व देते हैं कि Hielscher अल्ट्रासोनिक कोशिका विघटक और निष्कर्षक डिजिटल टच-डिस्प्ले और ब्राउज़र से दूरस्थ नियंत्रण के माध्यम से प्रक्रिया की सटीक निगरानी और नियंत्रण की सुविधा देते हैं। सोनिकेशन के सभी महत्वपूर्ण आँकड़े (जैसे शुद्ध ऊर्जा, कुल ऊर्जा, आयाम, अवधि, तापमान, दाब) एक एकीकृत SD-कार्ड पर CSV फ़ाइल के रूप में स्वचालित रूप से सहेजे जाते हैं। इससे पुनरुत्पादनीय और पुनरावृत्तियोग्य परिणाम प्राप्त करने में मदद मिलती है तथा प्रक्रिया का मानकीकरण और अच्छी विनिर्माण पद्धतियों (cGMP) का पालन आसान होता है।
निश्चित रूप से, Hielscher अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर पूर्ण भार पर 24/7 संचालन के लिए बनाए जाते हैं और इसलिए औद्योगिक उत्पादन परिवेशों में विश्वसनीय रूप से संचालित किए जा सकते हैं। अत्यधिक मजबूती और कम रखरखाव की आवश्यकता के कारण अल्ट्रासोनिक उपकरणों के निष्क्रिय रहने का समय बहुत कम होता है। CIP (स्थापित स्थान पर सफ़ाई) और SIP (स्थापित स्थान पर निर्जर्मीकरण) सुविधाएँ श्रमसाध्य सफ़ाई को न्यूनतम करती हैं, विशेष रूप से इसलिए कि तरल के संपर्क में आने वाले सभी भागों की सतहें चिकनी धातु की होती हैं (कोई छिपे हुए छिद्र या नोज़ल नहीं होते)।

नीचे दी गई तालिका हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है: