अल्ट्रासोनिक फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी): उन्नत सोनिकेशन के साथ प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लोज़ को बढ़ाना

अल्ट्रासोनिक फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) आधुनिक प्रोटिओमिक्स में एक अत्यधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि के रूप में उभर रहा है। स्थापित FASP वर्कफ़्लो में नियंत्रित sonication को एकीकृत करके, शोधकर्ता प्रोटीन निष्कर्षण, पाचन दक्षता और समग्र डेटा गुणवत्ता में काफी सुधार कर सकते हैं। उच्च-थ्रूपुट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूना तैयार करने की बढ़ती मांग के साथ, माइक्रोप्लेट सोनिकेटर UIP400MTP जैसे केंद्रित सोनिकेटर वैज्ञानिक और व्यावहारिक प्रासंगिकता प्राप्त कर रहे हैं।

वैज्ञानिक संदर्भ: प्रोटिओमिक्स में FASP क्यों मायने रखता है

फिल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) कुशल एंजाइमेटिक पाचन को सक्षम करते हुए डिटर्जेंट, लवण और अन्य दूषित पदार्थों को हटाने की क्षमता के कारण बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स में एक स्वर्ण मानक बन गया है। हालांकि, शास्त्रीय एफएएसपी प्रोटोकॉल अक्सर अपूर्ण लसीका, असंगत पाचन और नमूना परिवर्तनशीलता से संबंधित सीमाओं का सामना करते हैं – खासकर जब जटिल या लचीली जैविक कोशिकाओं या ऊतकों से निपटते हैं।
यह वह जगह है जहां केंद्रित अल्ट्रासोनिक ऊर्जा (सोनिकेशन) एक निर्णायक लाभ प्रदान करती है। यांत्रिक कतरनी बलों और गुहिकायन को शुरू करके, सोनिकेशन प्रोटीन अखंडता से समझौता किए बिना एफएएसपी वर्कफ़्लो में कई महत्वपूर्ण चरणों को बढ़ाता है।

अल्ट्रासोनिक FASP में Sonication के सकारात्मक प्रभाव

Sonication नियंत्रित ध्वनिक गुहिकायन का परिचय देता है – सूक्ष्म बुलबुला बनना और पतन – जो स्थानीयकृत कतरनी बल और माइक्रोस्ट्रीमिंग उत्पन्न करता है।
Sonication बड़े पैमाने पर स्थानांतरण में सुधार और प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में तेजी लाकर अल्ट्रासोनिक FASP में एल्काइलेशन और पाचन दोनों चरणों को बढ़ाता है। अल्ट्रासोनिक ऊर्जा का अनुप्रयोग गुहिकायन उत्पन्न करता है, जिससे स्थानीयकृत माइक्रोस्ट्रीमिंग और क्षणिक कतरनी बल होते हैं जो प्रोटीन मैट्रिक्स या फिल्टर वातावरण में अभिकर्मकों के तेजी से मिश्रण और कुशल प्रवेश को बढ़ावा देते हैं। एल्काइलेशन के दौरान, इसके परिणामस्वरूप आयोडोएसिटामाइड द्वारा सिस्टीन अवशेषों का अधिक समान और तेज़ संशोधन होता है। पाचन चरण में, सोनिकेशन प्रोटियोलिटिक दरार साइटों की पहुंच को बढ़ाता है और एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन में सुधार करता है, जिससे ट्रिप्सिन गतिविधि में तेजी आती है और पाचन दक्षता बढ़ती है। कुल मिलाकर, अल्ट्रासोनिक उपचार प्रतिक्रिया पूर्णता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता को बनाए रखने या सुधारने के दौरान प्रसंस्करण समय को कम कर देता है।

प्रोटिओमिक्स नमूना तैयार करने में, अल्ट्रासोनिक एफएएसपी का अनुवाद होता है:

• अधिक कुशल सेल व्यवधान और प्रोटीन निष्कर्षण, यहां तक कि कठिन ऊतकों या माइक्रोबियल नमूनों में भी
• प्रोटीन का बढ़ा हुआ घुलनशीलता
• पाचन के दौरान बेहतर एंजाइम पहुंच
• प्रसंस्करण समय में कमी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की क्षमता में वृद्धि

पारंपरिक यांत्रिक या रासायनिक लसीका विधियों के विपरीत, अल्ट्रासोनिक प्रसंस्करण अत्यधिक नियंत्रणीय और स्केलेबल है, जो इसे मानकीकृत प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है।

पारंपरिक दृष्टिकोण पर अल्ट्रासोनिक FASP के लाभ

FASP प्रोटोकॉल में sonication का एकीकरण औसत दर्जे का लाभ प्रदान करता है जो सीधे डाउनस्ट्रीम मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों को प्रभावित करता है।
अल्ट्रासोनिक एफएएसपी अधिक पूर्ण प्रोटीन वसूली को सक्षम बनाता है, विशेष रूप से रेशेदार ऊतकों या बायोफिल्म जैसे चुनौतीपूर्ण नमूनों से। समान ऊर्जा वितरण प्रतिकृतियों में लगातार उपचार सुनिश्चित करता है, जिससे परिवर्तनशीलता कम हो जाती है – मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए एक आवश्यक आवश्यकता।
इसके अतिरिक्त, सोनिकेशन एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन में सुधार करके पाचन कैनेटीक्स को तेज करता है। इसके परिणामस्वरूप अक्सर पाचन समय कम होता है और पेप्टाइड उपज अधिक होती है, जबकि अनुक्रम कवरेज बनाए रखता है।
वर्कफ़्लो के दृष्टिकोण से, अल्ट्रासोनिक सिस्टम मैनुअल हस्तक्षेप को कम करते हैं और आक्रामक रासायनिक उपचार की आवश्यकता को समाप्त करते हैं, नमूना अखंडता को संरक्षित करते हैं और प्रोटोकॉल मानकीकरण को सरल बनाते हैं।

वेन आरेख ओवर-नाइट एफएएसपी की तुलना में अल्ट्रासोनिक एफएएसपी द्वारा पहचाने गए प्रोटीन की बढ़ी हुई संख्या को दर्शाता है
छवि और अध्ययन: ©कार्वाल्हो एट अल., 2020

प्रोटोकॉल: UIP400MTP के साथ उच्च-थ्रूपुट अल्ट्रासोनिक FASP

बड़े नमूना समूहों को संसाधित करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए, UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर मानक मल्टी-वेल प्लेट्स (जैसे, 96-अच्छी तरह से प्लेटें) के एक साथ सोनिकेशन को सक्षम बनाता है, जिससे थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता में काफी वृद्धि होती है।
इस प्रारूप में, नमूने (आमतौर पर 50-200 माइक्रोन प्रति कुएं) सीधे अल्ट्राफिल्ट्रेशन या डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के साथ संगत माइक्रोप्लेट्स में तैयार किए जाते हैं। Lysis बफ़र्स मानक FASP प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समान हैं।

UIP400MTP सभी कुओं में एक समान अल्ट्रासोनिक ऊर्जा लागू करता है। Sonication आमतौर पर नमूना प्रकार के आधार पर 2-4 मिनट के लिए 60-80% आयाम पर किया जाता है। प्लग करने योग्य तापमान संवेदक का उपयोग करके तापमान की निगरानी करें। स्पंदित sonication का उपयोग करना और वैकल्पिक रूप से एक प्रयोगशाला चिलर के लिए।

अनुकरणीय प्रोटोकॉल:

1. एल्काइलेशन चरण के लिए, 7 चक्रों (30 एस ऑन, 15 एस ऑफ; कुल सोनिकेशन समय: 5 मिनट 45 एस) के लिए 40% आयाम पर माइक्रोप्लेट सोनिकेटर (UIP400MTP) का उपयोग करके नमूने सोनिकेट किए जाते हैं।
2. सोनिकेशन के बाद, आयोडोएसिटामाइड (आईएए) समाधान को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। ट्रिप्सिन पाचन से पहले, अवशिष्ट यूरिया को हटाने के लिए नमूनों को धोया जाना चाहिए, एक मजबूत अराजक एजेंट जो एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकता है। इसलिए, नमूनों को 25 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट (एएमबीआईसी) के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोया जाता है।
3. इसके बाद, 12.5 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में तैयार ट्रिप्सिन समाधान (1:30 एंजाइम-से-प्रोटीन अनुपात) के 100 माइक्रोन जोड़े जाते हैं। प्रोटीन पाचन तब एक ही sonication शर्तों (40% आयाम, 7 चक्र, 30 एस पर / 15 एस बंद; कुल समय: 5 मिनट 45 एस) के तहत UIP400MTP का उपयोग करके किया जाता है।
4. सोनिकेशन के बाद, नमूनों को फिल्टर प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है या प्लेट-आधारित एफएएसपी सिस्टम का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। कमी और क्षारीकरण चरण प्लेट में किए जाते हैं, एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो बनाए रखते हैं।
5. ट्रिप्सिन पाचन नियंत्रित परिस्थितियों (जैसे, 37 डिग्री सेल्सियस, 4-16 घंटे) के तहत किया जाता है, एंजाइमेटिक गतिविधि में तेजी लाने और पेप्टाइड उपज में सुधार करने के लिए संक्षिप्त अल्ट्रासोनिक उत्तेजना के विकल्प के साथ।
6. पेप्टाइड्स सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पुनर्प्राप्त किए जाते हैं और एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए तैयार होते हैं।

इस प्रणाली का मुख्य लाभ सभी कुओं में समान प्रसंस्करण स्थितियों को वितरित करने, बैच प्रभाव को कम करने और बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में मजबूत मात्रात्मक तुलना को सक्षम करने की क्षमता में निहित है।

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साहित्य/सन्दर्भ