उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन पाचन के साथ प्रोटिओमिक वर्कफ़्लोज़
प्रोटिओमिक्स जैविक प्रक्रियाओं और प्रणालियों को समझने के लिए एक आवश्यक क्षेत्र है, प्रोटीन पाचन इसके वर्कफ़्लो में एक महत्वपूर्ण कदम है। परंपरागत रूप से, प्रोटीन पाचन ट्रिप्सिन जैसे प्रोटियोलिटिक एंजाइमों का उपयोग करके समाधान में किया जाता है, जो विशेष रूप से लाइसिन और आर्जिनिन अवशेषों पर पेप्टाइड बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है। यह प्रक्रिया मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) अनुप्रयोगों में आयनीकरण और विखंडन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल पेप्टाइड्स उत्पन्न करती है। हालांकि, पारंपरिक पाचन विधियों को पूरा करने के लिए 12-24 घंटे की आवश्यकता होती है, जिससे प्रोटिओमिक वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण अड़चनें पैदा होती हैं।
अल्ट्रासोनिकेशन एक शक्तिशाली विकल्प प्रदान करता है, नाटकीय रूप से पाचन समय को घंटों से कुछ ही मिनटों तक छोटा करता है। जब Hielscher CupHorn, VialTweeter, और 96 अच्छी तरह से प्लेट sonicator UIP400MTP के रूप में उन्नत बहु नमूना sonicators के साथ संयुक्त, ultrasonication त्वरित, उच्च throughput प्रोटिओमिक्स सक्षम बनाता है। ये प्रौद्योगिकियां वर्कफ़्लोज़ को सुव्यवस्थित करती हैं, नमूना तैयार करने के समय को कम करती हैं और प्रजनन क्षमता या डेटा गुणवत्ता से समझौता किए बिना दक्षता बढ़ाती हैं।
प्रोटीन पाचन में अल्ट्रासोनिक ऊर्जा की भूमिका
अल्ट्रासोनिकेशन केंद्रित अल्ट्रासाउंड तरंगों को कैविटेशन-स्थानीयकृत माइक्रोबबल्स बनाने के लिए नियोजित करता है जो तीव्र कतरनी बलों को उत्पन्न करने के लिए ढह जाते हैं। यह घटना बड़े पैमाने पर हस्तांतरण को बढ़ाती है, सब्सट्रेट के साथ एंजाइमों के मिश्रण को बढ़ावा देती है, और प्रोटीन संरचनाओं को प्रकट करती है, ट्रिप्सिन जैसे प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के लिए दरार साइटों को उजागर करती है।
परिणाम? दक्षता या प्रजनन क्षमता से समझौता किए बिना पाचन समय में उल्लेखनीय कमी।
अल्ट्रासोनिक-एन्हांस्ड प्रोटियोलिटिक पाचन: कार्यप्रणाली और परिणाम
त्वरित पाचन प्रोटोकॉल
अल्ट्रासोनिक-असिस्टेड पाचन वर्कफ़्लो में तेजी लाने के लिए प्रोटियोलिटिक एंजाइम और अल्ट्रासोनिक ऊर्जा को जोड़ती है। उदाहरण के लिए, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) का उपयोग करके, पाचन वर्कफ़्लो निम्नानुसार आगे बढ़ता है:
- कमी: प्रोटीन के नमूने (0.5 मिलीग्राम / एमएल, 20 माइक्रोन) को अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (12.5 मिमी) में डीटीटी (2 माइक्रोन, 110 मिमी) के साथ इलाज किया जाता है। Sonication 5 मिनट के लिए 50% आयाम पर लागू किया जाता है.
- क्षारीकरण: IAA (2 μL, 400 mM) जोड़ने के बाद, समान परिस्थितियों में सोनिकेशन दोहराया जाता है।
- पाचन: नमूने पतला और स्थिर ट्रिप्सिन नैनोकणों के साथ ऊष्मायन कर रहे हैं. सोनिकेशन का अंतिम दौर (5 मिनट) पाचन को पूरा करता है। पेप्टाइड्स को एमएस विश्लेषण के लिए अलग, सुखाया और संग्रहीत किया जाता है।
यह अल्ट्रासोनिक विधि कुल तैयारी के समय को 12 घंटे से 30 मिनट तक कम कर देती है। त्वरित प्रक्रिया के बावजूद, पेप्टाइड उपज और गुणवत्ता पारंपरिक रातोंरात तरीकों के अनुरूप रहती है।
अल्ट्रासोनिक प्रोटीन पाचन की क्षमता
ई कोलाई प्रोटिओम का उपयोग करके तुलनात्मक अध्ययन में:
- प्रोटीन की पहचान: अल्ट्रासोनिक रूप से पचने वाले नमूनों ने 12 घंटे में 817 की तुलना में 5 मिनट में 777 प्रोटीन की पहचान की। साझा प्रोटीन पहचान 70% से अधिक हो गई।
- प्रजनन क्षमता: दोहराने वाले विश्लेषणों ने विश्वसनीयता का प्रदर्शन करते हुए, प्रत्येक विधि के भीतर 98% से ऊपर सहसंबंध मान दिखाए।
- वरणक्षमता: कुछ प्रोटीनों को प्रत्येक विधि द्वारा अधिमानतः पचाया जाता था, जिसमें अल्ट्रासोनिक पाचन 65 प्रोटीन और रातोंरात पाचन 54 प्रोटीन के पक्ष में होता था। इस तरह के बारीक अंतर विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासोनिकेशन की अनूठी क्षमता को रेखांकित करते हैं।
एक ई कोलाई में सात नुकीले प्रोटीन के लेबल मुक्त प्रोटीन मात्रा का ठहराव परिणाम
नमूना। निम्नलिखित प्रोटीन दो अलग-अलग स्तरों पर जोड़े गए थे जैसा कि कॉलम में उल्लेख किया गया है
"थियो अनुपात" के रूप में नामित। थियो अनुपात इसमें प्रयुक्त दो स्तरों के बीच सैद्धांतिक अनुपात है
प्रयोग। बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (ALBU), β-लैक्टोग्लोबुलिन (LACB), α-S1 कैसिइन (CASA1),
α-S2 कैसिइन (CASA2), साइटोक्रोम c (CYC), ओवलब्यूमिन (OVAL) और कार्बोनिक एनहाइड्रेज़ 2
(सीएएच2)। अनुपात MaxQuant से प्राप्त LFQ प्रोटीन तीव्रता का उपयोग कर गणना की गई
विश्लेषण। प्रत्येक विधि (पी>0.01, एन = 3, टी-सैद्धांतिक = 4.6) के साथ प्राप्त मूल्यों की तुलना करने के लिए छात्र का टी परीक्षण लागू किया गया था।
अध्ययन और ग्राफिक: © मार्टिंस एट अल।
नैनोपार्टिकल-इमोबिलाइज्ड ट्रिप्सिन
अल्ट्रासोनिकेशन के साथ स्थिर ट्रिप्सिन नैनोकणों (जैसे, टी-एफएमएनपी) का एकीकरण प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो को और बढ़ाता है। ये नैनोकण एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के लिए एक उच्च सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं, जिससे दक्षता बढ़ती है। जब जटिल प्रोटिओम पर लागू किया जाता है, जैसे कि ई कोलाई, संयुक्त विधि प्राप्त करती है:
- गति: 5 मिनट के भीतर पाचन पूरा करें।
- यथार्थता: पारंपरिक तरीकों के लिए तुलनीय प्रोटीन मात्रा का ठहराव (पी > 0.01, एन = 3)।
- अनुमापकता: UIP400MTP जैसे मल्टी-वेल प्लेटफॉर्म के लिए अनुकूलन उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है।
चरण-दर-चरण निर्देशों के साथ विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए यहां क्लिक करें!
(सीएफ मार्टिंस एट अल।
Hielscher sonicators के साथ उच्च गति और उच्च थ्रूपुट पर प्रोटीन पाचन
प्रोटिओमिक्स के लिए सर्वश्रेष्ठ सोनिकेटर मॉडल
Hielscher Ultrasonics एक साथ बहु-नमूना तैयार करने के लिए विभिन्न सोनिकेटर मॉडल प्रदान करता है, जो उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लोज़ की सुविधा प्रदान करता है। चाहे आप शीशियों, टेस्ट ट्यूब, बहु अच्छी तरह से प्लेटों (जैसे 6-, 24-, 96 अच्छी तरह से प्लेट) या पेट्री व्यंजन के साथ काम करते हैं – हम आपको आपके प्रयोगों के लिए आदर्श सोनिकेटर प्रदान करते हैं।
UIP400MTP मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर
अंतिम थ्रूपुट के लिए, UIP400MTP अल्ट्रासोनिक रूप से 96-अच्छी प्लेटों को संसाधित करने की क्षमता प्रदान करता है। किसी भी मानक माइक्रोप्लेट के साथ संगत, UIP400MTP को महंगे मालिकाना डिस्पोजेबल की आवश्यकता नहीं होती है और आपको अपने शोध के लिए सर्वश्रेष्ठ मल्टी-वेल प्लेट चुनने की स्वतंत्रता देता है। प्लेट में एक समान ऊर्जा प्रदान करके, यह केवल 1 घंटे में 200 जटिल प्रोटिओम तक तेजी से कमी, क्षारीकरण और पाचन को सक्षम बनाता है। स्वचालन और दक्षता का यह स्तर उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक्स और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर के बारे में अधिक जानें!
वायलट्वीटर
वायलट्वीटर प्रयोगशालाओं के लिए सिलवाया गया है जिसमें 10 शीशियों या टेस्ट ट्यूब तक के एक साथ सोनिकेशन की आवश्यकता होती है। इसका गैर-इनवेसिव दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटीन पाचन सुनिश्चित करते हुए क्रॉस-संदूषण जोखिम को समाप्त करता है। यह उपकरण सीमित नमूना मात्रा या विविध नमूना प्रकारों के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए आदर्श है।
VialTweeter मल्टी-ट्यूब सोनिकेटर के बारे में अधिक जानें!
Hielscher UP200St-CupHorn
कपहॉर्न सोनिकेटर एक शक्तिशाली उपकरण है जिसे सीलबंद कंटेनरों में कई नमूनों के एक साथ प्रसंस्करण के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह एक समान अल्ट्रासोनिक ऊर्जा वितरण और सटीक तापमान नियंत्रण सुनिश्चित करता है। एक साथ पांच नमूनों को संसाधित करने की क्षमता, कम, अल्काइलेटेड और पचाने वाले वर्कफ़्लोज़ के साथ इसकी संगतता के साथ, कपहॉर्न को एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए एक विश्वसनीय उपकरण बनाता है।
कपहॉर्न सोनोरिएक्टर के बारे में अधिक जानें!
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
नैनोपार्टिकल-स्थिर ट्रिप्सिन का उपयोग करके अल्ट्रासोनिकेशन-असिस्टेड प्रोटियोलिटिक पाचन के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल
मार्टिंस एट अल (2019) द्वारा यह प्रोटोकॉल अल्ट्रासोनिक ऊर्जा और नैनोपार्टिकल-इमोबिलाइज्ड ट्रिप्सिन (टी-एफएमएनपी) का उपयोग करके तेजी से प्रोटीन पाचन के लिए अनुकूलित है। उल्लिखित कदम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त कुशल कमी, क्षारीकरण और प्रोटियोलिसिस सुनिश्चित करते हैं।
प्रोटोकॉल चरण
- डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड में कमी
- एम्बिक बफर में 20 माइक्रोन प्रोटीन नमूने (0.5 मिलीग्राम/एमएल) में डीटीटी समाधान (110 मिमी) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
- सोनोरिएक्टर UP200St-CupHorn में नमूना ट्यूब रखें।
- 50% आयाम (200 डब्ल्यू, 26 किलोहर्ट्ज़) पर 2.5 मिनट के लिए नमूना सोनिकेट।
- ठंडा करने की अनुमति देने के लिए एक संक्षिप्त अंतराल के लिए रुकें, फिर उसी परिस्थितियों में एक और 2.5 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
- कम सिस्टीन अवशेषों का अल्काइलेशन
- कम प्रोटीन नमूने में आईएए समाधान (400 मिमी) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
- क्षारीकरण की सुविधा के लिए 50% आयाम पर 2.5 मिनट के लिए सोनिकेट।
- ठंडा करने के लिए रुकें, फिर अतिरिक्त 2.5 मिनट के लिए सोनियाकेट करें।
नोट: आईएए गिरावट को रोकने के लिए प्रकाश के लिए alkylated नमूना के जोखिम को कम से कम.
- नमूना कमजोर पड़ने
- 4% एसीटोनिट्राइल (वी / वी) युक्त 25 एमएम एम्बिक बफर का उपयोग करके 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में अल्काइलेटेड प्रोटीन नमूना पतला करें।
- कोमल पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
- नैनोपार्टिकल-इमोबिलाइज्ड ट्रिप्सिन के साथ प्रोटियोलिटिक पाचन
- पतला प्रोटीन नमूने में टी-एफएमएनपी समाधान (3 मिलीग्राम/एमएल) के 20 माइक्रोन जोड़ें।
- 50% आयाम पर 2.5 मिनट के लिए सोनोरिएक्टर में मिश्रण को सोनिकेट करें।
- ठंडा करने के लिए रुकें, फिर उन्हीं परिस्थितियों में एक और 2.5 मिनट के लिए सोनियाकेट करें।
- ट्रिप्सिन नैनोकणों का पृथक्करण
- पचा पेप्टाइड्स युक्त सतह पर तैरनेवाला से टी-FMNPs अलग करने के लिए एक चुंबक का प्रयोग करें.
- सतह पर तैरनेवाला एक नई microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- एमएस विश्लेषण के लिए पेप्टाइड की तैयारी
- एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में पेप्टाइड्स युक्त सतह पर तैरनेवाला सूखी.
- मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे पेप्टाइड्स स्टोर करें।
साहित्य/सन्दर्भ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter Multi-Tube Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
प्रोटिओम विश्लेषण के 5 चरण क्या हैं?
प्रोटिओम विश्लेषण के पांच चरण हैं: (1) प्रोटीन निष्कर्षण, जहां प्रोटीन को लाइसिस बफर का उपयोग करके जैविक नमूनों से अलग किया जाता है; (2) प्रोटीन पृथक्करण, आमतौर पर जटिल मिश्रण को हल करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन या तरल क्रोमैटोग्राफी जैसी तकनीकों के माध्यम से प्राप्त किया जाता है; (3) प्रोटीन पाचन, जहां प्रोटीन एंजाइमेटिक रूप से पेप्टाइड्स में क्लीव होते हैं, अक्सर ट्रिप्सिन का उपयोग करते हैं; (4) मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, जहां पेप्टाइड्स को आयनित, खंडित और उनके द्रव्यमान और अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जाता है; और (5) डेटा विश्लेषण, जहां जैव सूचना विज्ञान उपकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के आधार पर प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारित करते हैं, प्रोटिओम में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
प्रोटीन पाचन क्या है?
प्रोटीन पाचन एंजाइमेटिक प्रक्रिया है जिसके द्वारा प्रोटीन को पेप्टाइड बॉन्ड के दरार के माध्यम से छोटे पेप्टाइड्स या अमीनो एसिड में हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है, आमतौर पर प्रोटियोलिटिक एंजाइमों द्वारा सुविधा प्रदान की जाती है।
3 प्रोटीन एंजाइम क्या हैं?
तीन मुख्य प्रोटियोलिटिक एंजाइम ट्रिप्सिन, काइमोट्रिप्सिन और पेप्सिन हैं, जिनमें से प्रत्येक विशिष्ट सब्सट्रेट विशिष्टताओं और इष्टतम गतिविधि स्थितियों के साथ है।
प्रोटीन के लिए तरीके क्या हैं?
प्रोटियोलिसिस के तरीकों में एंजाइमेटिक पाचन (जैसे, ट्रिप्सिन या अन्य प्रोटीज का उपयोग करके), रासायनिक दरार (जैसे, मेथिओनिन अवशेषों के लिए साइनोजन ब्रोमाइड), और एंजाइमेटिक गतिविधि को बढ़ाने के लिए अल्ट्रासोनिकेशन जैसे भौतिक तरीके शामिल हैं।
प्रोटियोलिसिस को क्या रोकता है?
प्रोटियोलिसिस को प्रोटीज इनहिबिटर द्वारा बाधित किया जा सकता है, जैसे कि फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड (पीएमएसएफ) या एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए), अत्यधिक पीएच या तापमान जैसे पर्यावरणीय कारकों द्वारा, या प्रोटीज गतिविधि के लिए आवश्यक कॉफ़ैक्टर्स की अनुपस्थिति से।
Hielscher Ultrasonics से उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers बनाती है प्रयोगशाला तक औद्योगिक आकार।