उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले प्रोटीन पाचन के साथ प्रोटिओमिक कार्यप्रवाह

जैविक प्रक्रियाओं और प्रणालियों को समझने के लिए प्रोटिओमिक्स एक आवश्यक क्षेत्र है, जिसके कार्यप्रवाहों में प्रोटीन पाचन एक महत्वपूर्ण चरण है। परंपरागत रूप से, प्रोटीन पाचन विलयन में ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीन अपघटित करने वाले एंजाइमों का उपयोग करके किया जाता है। ट्रिप्सिन विशेष रूप से लाइसिन और आर्जिनिन अवशेषों पर पेप्टाइड बंधों का जलअपघटन करता है। इस प्रक्रिया से ऐसे पेप्टाइड बनते हैं जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) अनुप्रयोगों में आयनीकरण और खंडन के लिए उपयुक्त होते हैं। हालांकि, पारंपरिक पाचन विधियों को पूरा होने में 12–24 घंटे लगते हैं, जिससे प्रोटिओमिक कार्यप्रवाहों में महत्वपूर्ण बाधाएँ उत्पन्न होती हैं।
अल्ट्रासोनिकेशन एक प्रभावशाली विकल्प प्रदान करता है, जो पाचन का समय घंटों से घटाकर केवल कुछ मिनट कर देता है। Hielscher CupHorn, VialTweeter और 96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP जैसे उन्नत बहु-नमूना सोनिकेटरों के साथ मिलकर, अल्ट्रासोनिकेशन त्वरित और उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले प्रोटिओमिक्स को संभव बनाता है। ये प्रौद्योगिकियाँ कार्यप्रवाहों को सुव्यवस्थित करती हैं, नमूना तैयार करने का समय घटाती हैं और पुनरुत्पादकता या डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना दक्षता बढ़ाती हैं।

प्रोटीन पाचन में अल्ट्रासोनिक ऊर्जा की भूमिका

अल्ट्रासोनिकेशन में केंद्रित अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग करके कैविटेशन उत्पन्न किया जाता है – अर्थात स्थानीय सूक्ष्म बुलबुले बनते हैं, जो ढहकर तीव्र अपरूपण बल उत्पन्न करते हैं। यह परिघटना द्रव्यमान अंतरण बढ़ाती है, एंजाइमों को सब्सट्रेटों के साथ मिलाने में सहायता करती है और प्रोटीन संरचनाओं को खोलती है, जिससे विदलन स्थल ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीन अपघटित करने वाले एंजाइमों के लिए सुलभ हो जाते हैं।
इसका परिणाम? दक्षता या पुनरुत्पादकता से समझौता किए बिना पाचन के समय में उल्लेखनीय कमी।

अल्ट्रासोनिकेशन से संवर्धित प्रोटीन अपघटनी पाचन: कार्यविधि और परिणाम

त्वरित पाचन प्रोटोकॉल

अल्ट्रासोनिक-सहायित पाचन में कार्यप्रवाहों को तेज़ करने के लिए प्रोटीन अपघटित करने वाले एंजाइमों और अल्ट्रासोनिक ऊर्जा का संयोजन किया जाता है। उदाहरण के लिए, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) का उपयोग करते समय पाचन कार्यप्रवाह इस प्रकार आगे बढ़ता है:

1. अपचयन: प्रोटीन नमूनों (0.5 mg/mL, 20 µL) को अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (12.5 mM) में DTT (2 µL, 110 mM) से उपचारित किया जाता है। 50% आयाम पर 5 मिनट तक सोनिकेशन किया जाता है।
2. ऐल्किलीकरण: IAA (2 µL, 400 mM) मिलाने के बाद, उन्हीं परिस्थितियों में सोनिकेशन दोहराया जाता है।
3. पाचन: नमूनों को तनु किया जाता है और स्थिरीकृत ट्रिप्सिन युक्त नैनोकणों के साथ इन्क्यूबेट किया जाता है। सोनिकेशन का अंतिम चक्र (5 मिनट) पाचन पूरा करता है। पेप्टाइडों को अलग किया जाता है, सुखाया जाता है और MS विश्लेषण के लिए संग्रहित किया जाता है।

यह अल्ट्रासोनिक विधि तैयारी का कुल समय 12 घंटे से घटाकर 30 मिनट से भी कम कर देती है। प्रक्रिया तेज़ होने के बावजूद, पेप्टाइड की प्राप्त मात्रा और गुणवत्ता पारंपरिक रात भर चलने वाली विधियों के अनुरूप बनी रहती हैं।

अल्ट्रासोनिक प्रोटीन पाचन की दक्षता

E. coli प्रोटिओम का उपयोग करके किए गए तुलनात्मक अध्ययनों में:

• प्रोटीन की पहचान: अल्ट्रासोनिक विधि से पचाए गए नमूनों में 5 मिनट में 777 प्रोटीनों की पहचान हुई, जबकि 12 घंटे में 817 प्रोटीनों की पहचान हुई। दोनों विधियों में समान रूप से पहचाने गए प्रोटीनों का अनुपात 70% से अधिक था।
• पुनरुत्पादकता: पुनरावृत्त विश्लेषणों में प्रत्येक विधि के भीतर सहसंबंध मान 98% से अधिक रहे, जो विश्वसनीयता दर्शाते हैं।
• चयनात्मकता: प्रत्येक विधि में कुछ प्रोटीनों का पाचन प्राथमिकता से हुआ; अल्ट्रासोनिक पाचन में 65 प्रोटीनों को और रात भर किए गए पाचन में 54 प्रोटीनों को प्राथमिकता मिली। ऐसे सूक्ष्म अंतर विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासोनिकेशन की अनूठी क्षमता को रेखांकित करते हैं।

E. coli
नमूने में मिलाए गए सात प्रोटीनों के लेबल-मुक्त प्रोटीन परिमाणीकरण के परिणाम। निम्नलिखित प्रोटीन दो अलग-अलग स्तरों पर मिलाए गए थे, जैसा कि
“Theo Ratio” नामक स्तंभ में दर्शाया गया है। Theo Ratio इस
प्रयोग में उपयोग किए गए दो स्तरों के बीच का सैद्धांतिक अनुपात है। बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (ALBU), β-लैक्टोग्लोबुलिन (LACB), α-S1 कैसीन (CASA1),
α-S2 कैसीन (CASA2), साइटोक्रोम c (CYC), ओवल्ब्यूमिन (OVAL) और कार्बोनिक एनहाइड्रेज़ 2
(CAH2)। अनुपातों की गणना MaxQuant
विश्लेषण से प्राप्त LFQ प्रोटीन तीव्रताओं का उपयोग करके की गई। प्रत्येक विधि से प्राप्त मानों की तुलना करने के लिए स्टूडेंट का t परीक्षण लागू किया गया (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6)।
अध्ययन और ग्राफ़िक: © Martins et al., 2019)

नैनोकणों पर स्थिरीकृत ट्रिप्सिन

स्थिरीकृत ट्रिप्सिन युक्त नैनोकणों (जैसे, T-FMNPs) को अल्ट्रासोनिकेशन के साथ संयोजित करने से प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाहों में और सुधार होता है। ये नैनोकण एंज़ाइम–सब्सट्रेट अंतःक्रियाओं के लिए बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं, जिससे दक्षता बढ़ती है। E. coli जैसे जटिल प्रोटिओम पर लागू करने पर, यह संयुक्त विधि निम्नलिखित परिणाम देती है:

• गति: 5 मिनट के भीतर पूर्ण पाचन।
• सटीकता: पारंपरिक विधियों के तुलनीय प्रोटीन परिमाणन (p > 0.01, n=3)।
• प्रसंस्करण क्षमता का विस्तार: UIP400MTP जैसे मल्टी-वेल प्लेटफ़ॉर्म के अनुरूप ढालने से उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ प्रसंस्करण संभव होता है।

चरण-दर-चरण निर्देशों वाले विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए यहाँ क्लिक करें!
(cf. Martins et al., 2019)

Hielscher सोनिकेटरों के साथ उच्च गति और उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाला प्रोटियोलाइटिक पाचन

प्रोटिओमिक्स के लिए सर्वोत्तम सोनिकेटर मॉडल

Hielscher Ultrasonics एक साथ कई नमूनों की तैयारी के लिए विभिन्न सोनिकेटर मॉडल प्रदान करता है, जो उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले कार्यप्रवाहों को सुगम बनाते हैं। चाहे आप वायल, टेस्ट ट्यूब, मल्टी-वेल प्लेट (जैसे 6-, 24-, 96-वेल प्लेट) या पेट्री डिश के साथ काम करते हों – हम आपके प्रयोगों के लिए आदर्श सोनिकेटर प्रदान करते हैं।

UIP400MTP मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर

अधिकतम नमूना प्रसंस्करण क्षमता के लिए, UIP400MTP अल्ट्रासोनिक विधि से 96-वेल प्लेटों का प्रसंस्करण करने की क्षमता प्रदान करता है। किसी भी मानक माइक्रोप्लेट के साथ संगत UIP400MTP के लिए महँगी स्वामित्वाधीन एकल-उपयोग सामग्री की आवश्यकता नहीं होती और यह आपको अपने शोध के लिए सर्वोत्तम मल्टी-वेल प्लेट चुनने की स्वतंत्रता देता है। पूरी प्लेट में एकसमान ऊर्जा पहुँचाकर, यह केवल 1 घंटे में 200 तक जटिल प्रोटिओम का तीव्र अपचयन, ऐल्किलीकरण और पाचन संभव बनाता है। स्वचालन और दक्षता का यह स्तर उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले प्रोटिओमिक्स और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर के बारे में अधिक जानें!

VialTweeter

VialTweeter उन प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से तैयार किया गया है जिन्हें एक साथ 10 तक वायल या टेस्ट ट्यूब का सोनिकेशन करने की आवश्यकता होती है। इसका गैर-आक्रामक तरीका पुनरुत्पादनीय प्रोटीन पाचन सुनिश्चित करते हुए परस्पर संदूषण के जोखिमों को समाप्त करता है। यह उपकरण सीमित नमूना आयतन या विविध प्रकार के नमूनों के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए आदर्श है।
VialTweeter मल्टी-ट्यूब सोनिकेटर के बारे में अधिक जानें!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn सोनिकेटर एक शक्तिशाली उपकरण है जिसे सीलबंद पात्रों में एक साथ कई नमूनों के प्रसंस्करण के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह अल्ट्रासोनिक ऊर्जा का एकसमान वितरण और सटीक तापमान नियंत्रण सुनिश्चित करता है। एक साथ पाँच तक नमूनों का प्रसंस्करण करने की क्षमता तथा अपचयन, ऐल्किलीकरण और पाचन वाले कार्यप्रवाहों के साथ इसकी संगतता, CupHorn को MS आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए एक विश्वसनीय उपकरण बनाती है।
CupHorn SonoReactor के बारे में अधिक जानें!

नैनोकणों पर स्थिरीकृत ट्रिप्सिन का उपयोग करके अल्ट्रासोनिकेशन-सहायित प्रोटियोलाइटिक पाचन के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल

Martins et al. (2019) का यह प्रोटोकॉल अल्ट्रासोनिक ऊर्जा और नैनोकणों पर स्थिरीकृत ट्रिप्सिन (T-FMNPs) का उपयोग करके तीव्र प्रोटीन पाचन के लिए अनुकूलित है। बताए गए चरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त दक्ष अपचयन, ऐल्किलीकरण और प्रोटियोलाइसिस सुनिश्चित करते हैं।
प्रोटोकॉल के चरण

1. डाइसल्फ़ाइड बंधों का अपचयन
   • AmBic बफ़र में मौजूद 20 µL प्रोटीन नमूने (0.5 mg/mL) में 2 µL DTT विलयन (110 mM) मिलाएँ।
   • नमूना ट्यूब को UP200St-CupHorn सोनो रिएक्टर में रखें।
   • नमूने का 50% आयाम पर 2.5 मिनट तक सोनिकेशन करें (200 W, 26 kHz)।
   • ठंडा होने देने के लिए थोड़ी देर रुकें, फिर उन्हीं परिस्थितियों में 2.5 मिनट और सोनिकेशन करें।
2. अपचयित सिस्टीन अवशेषों का ऐल्किलीकरण
   • अपचयित प्रोटीन नमूने में 2 µL IAA विलयन (400 mM) मिलाएँ।
   • ऐल्किलीकरण को सुगम बनाने के लिए 50% आयाम पर 2.5 मिनट तक सोनिकेशन करें।
   • ठंडा होने देने के लिए रुकें, फिर अतिरिक्त 2.5 मिनट तक सोनिकेशन करें।

   नोट: IAA के अपघटन को रोकने के लिए ऐल्किलीकृत नमूने का प्रकाश के संपर्क में आना न्यूनतम रखें।

3. नमूने का तनुकरण
   • 4% एसीटोनाइट्राइल (v/v) युक्त 25 mM AmBic बफ़र का उपयोग करके ऐल्किलीकृत प्रोटीन नमूने को तनु करें, ताकि अंतिम आयतन 100 µL हो।
   • हल्के हाथ से पिपेटिंग करके अच्छी तरह मिलाएँ।
4. नैनोकणों पर स्थिरीकृत ट्रिप्सिन के साथ प्रोटियोलाइटिक पाचन
   • तनुकृत प्रोटीन नमूने में 20 µL T-FMNP विलयन (3 mg/mL) मिलाएँ।
   • सोनोरीएक्टर में मिश्रण का 50% आयाम पर 2.5 मिनट तक सोनिकेशन करें।
   • ठंडा होने के लिए विराम दें, फिर उन्हीं परिस्थितियों में और 2.5 मिनट तक सोनिकेशन करें।
5. स्थिरीकृत ट्रिप्सिन युक्त नैनोकणों का पृथक्करण
   • पचित पेप्टाइड युक्त अधिप्लवी द्रव से T-FMNPs को अलग करने के लिए चुंबक का उपयोग करें।
   • अधिप्लवी द्रव को एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
6. MS विश्लेषण के लिए पेप्टाइड की तैयारी
   • पेप्टाइड युक्त अधिप्लवी द्रव को वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में सुखाएँ।
   • मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आगे के विश्लेषण तक सूखे पेप्टाइड को -20°C पर भंडारित करें।