Hielscher – Ultraschall-Technologie

Stammzellisolierung durch Ultraschall

  • Ultraschallkavitation ist eine höchst effektives mechanisches Verfahren, um Stammzellen aus menschlichem Fettgewebe zu isolieren.
  • Die mittels Ultraschall isolierte vaskuläre stromale Fraktion (SVF) verfügt über ein hohes regeneratives Potenzial für medizinische Anwendungen.
  • Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Möglichkeiten der direkten und indirekten Beschallung für die Stammzellgewinnung.

Ultraschall-gestützte Stammzellisolierung

Dem menschlichen Körper entnommenes Fettgewebe (durch Fettabsaugung) wird mit Ultraschall behandelt, um Stammzellen und andere Wachstumszellen aus dem Gewebe freizusetzen. Diese separierte Zellfraktion wird stromal-vaskuläre Fraktion (stromal vascular fraction / SVF) genannt.
Das Ultraschallverfahren zur Stammzellisolierung aus Fettgewebe beruht einzig und allein auf dem Prinzip der Ultraschallkavitation und deren mechanischen Scherkräfte. Die Kavitationskräfte schließen das adipöse Gwebe auf, so dass die Stammzellen aus der Struktur des Fettgewebes herausgelöst und freigesetzt werden. Der ultraschall-gestützte Stammzellisolierung ist eine enzym-freie Methode, bei welcher der Einsatz von Kollagenase, Trypsin oder Dispase vollständig vermieden wird.
Um die extrahierten Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, endotheliale Vorläuferzellen und andere Wachstumszellen abzutrennen, wird Fettgewebe nach der Beschallung zentrifugiert.
Die abgetrennten Stammzellen werden aufgefangen und durch Zellzahl-, Vitalitäts- und Endotoxinbestimmung sowie Gram-Färbung bezüglich ihrer Qualität analysiert, bevor sie anschließend sofort für eine autologe Transplantation verwendet werden oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung gelagert werden.

Weshalb Enzyme vermeiden?

Da eine enzymatische Stammzellisolierung mit hohen Kosten und möglichen Sicherheitsrisiken behaftet ist sowie teilweise mangelnde Wirksamkeit aufweist [Oberbauer et al. 2015], ist eine nicht-enzymatische Isolierung wie durch Ultraschallkavitation bevorzugt. Der ultraschall-gestützte Stammzellisolierung ersetzt den enzymatischen Zellaufschluss durch die mechanische Trennung der Zellen und Zellaggregate aus dem Fettgewebe.

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Vorteile der Ultraschalllyse
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  • Schnell
  • effizient
  • reproduzierbar
  • sicher
  • Enzym-frei
  • kostengünstig
  • Sterile Optionen
Ultraschallkavitation ist eine zuverlässige Methode, um Stammzellen aus Fettgewebe zu isolieren. © Oberbauer et al. 2015

Aus Fettgewebe isolierte Stammzellen

Stammzell-Ausbeute

Veröffentlichte Methoden der SVF-Isolatierung mittels Ultraschallkavitation ergeben eine Stammzellausbeute von 1,67-2,24 × 107 Zellen mit einer Zellviabilität von 97,1-98,9 % [Victor, S., 2014]. Zellausbeuten von etwa 2 Millionen Zellen/Gramm Fettgewebe wurden durch die ultraschall-gestützte Lyse von reifen Adipozyten aus dissoziiertem Fettgewebe gewonnen [Bright et al., 2014].
Mittels Ultraschall isolierte Stammzellen weisen ein gleich hoch adipogenes und osteogenes Differenzierungspotenzial wie Zellen auf, die mittels eines enzymatischen Standardverfahrens gewonnen wurden [Oberbauer et al. 2015] .

Ultraschall-Systeme für die Stammzellisolierung

Um höchste Sicherheit und beste Qualität zu gewährleisten, ist ein zuverlässige Ultraschallgerät, welches die präzise Kontrolle über die Stammzellisolierung ermöglicht, unerlässlich. Hielscher Ultrasonics bietet verschiedene Geräteoptionen für eine autologe Ultraschallisolierung von Stammzellen und endothelialen Vorläuferzellen.

Direkte Beschallung

UP200St (200W) Ultraschallgerät mit SchallschutzboxStammzellen können durch direkte Beschallung isoliert werden. Dazu wird das Ultraschallhorn (Sonotrode, Ultraschallspitze / -sonde) in der adipösen Fettgewebe getaucht. Über die Sonotrode werden die Ultraschallwellen direkt in das Fettgewebe gekoppelt, so dass die Ultraschallkavitation die Stammzellen und Stromazellen aus dem restlichen Gewebe löst. Hielscher's Ultraschallprozessoren UP200Ht und UP200St mit Sonotrode S26d14 sind häufig verwendete Systeme für die autologe Stammzellisolierung. Die SVF-Isolierung durch eine direkte Beschallung ist vor allem für den Einsatz im Reinraum geeignet.

indirekten Beschallung

Da die Stammzellen für autologe Anwendungen verwendet werden, ist die Sterilität des Prozesses äußerst wichtig. Daher hat Hielscher mehrere Möglichkeiten der indirekte Beschallung entwickelt, z.B. die Ultraschallsysteme GDmini2, VialTweeter sowie weitere kundenspezifische Systeme. Bei der indirekten Beschallung werden die Ultraschallwellen durch die Gefäßwand eines Behälters in das Fettgewebe eingekoppelt. Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF) wird dabei ebenso wie bei der direkten Beschallung durch Ultraschallkavitation aus dem Fettgewebe gelöst.
VialTweeter-Sonotrode S26d11x10 für den UP200St (zum Vergrößern anklicken!)Die indirekte Beschallung-Prozess bietet den Vorteil, dass die Zellen in einem geschlossenen Gefäß kontaminationsfrei in einem geschlossenen Gefäß verarbeitet werden, da das Risiko einer Kreuzkontamination durch das Einführen des Ultraschallhorns (Sonotrode) entfällt. Die Zellisolierung erfolgt in einem geschlossenen System unter sterilen Bedingungen.

Hielscher's digitale Ultraschallgeräte können über das Touch-Display oder die Browser-Steuerung präzise gesteuert werden. Die Beschallung kann über das Menü im Gerät voreingestellt werden. Zudem verfügen die Ultraschallsysteme über eine automatische Datenerfassung. Alle Daten des Beschallungsprozesses werden automatisch auf einer integrierten SD-Karte gespeichert. Die Ultraschallintensität und Leistungsabgabe kann exakt entsprechend des Zellisolierungsprotokolls eingestellt werden.

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Literatur

  • Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.


Wissenswertes

Stammzellen

Stammzellen sind undifferenzierte Zellen eines vielzelligen Organismus, welche die Fähigkeit besitzen, eine unbestimmte Zahl von Zellen des gleichen Typs zu entwickeln. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie sich im frühenLebens- und Wachstumsstadium in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können. Stammzellen können sich selbst durch Zellteilung erneuern und in Gewebe- oder Organ-spezifischen Zellen mit speziellen Funktionen verwandeln. Pluripotente Stammzellen haben das Potenzial, sich in eine der folgenden drei Keimzellen zu differenzieren: das Entoderm (innere Magenschleimhaut, Magen-Darm-Trakt, Lunge), Mesoderm (Muskel, Knochen, Blut, urogenitale) oder Ektoderm (epidermale Gewebe und Nervensystem).
In einigen Organen und Geweben, wie z.B. im Darm und Knochenmark, teilen sich Stammzellen regelmäßig, um abgenutztes oder beschädigtes Gewebe zu reparieren und zu erneuern. In anderen Organen wie der Bauchspeicheldrüse und dem Herz teilen sich Stammzellen nur unter besonderen Bedingungen.
Mesenchymale Stromazellen/Stammzellen (MSC) bieten ein hohes Potenzial für vielfältige therapeutische Anwendungen in der regenerativen und ästhetischen Medizin. Sie sind vor allem im Knochenmark vorhanden, aber sie können auch aus anderen Gewebearten (z.B. Knorpel, Fett, Muskelzellen) isoliert werden. Mesenchymale Stammzellen gelten als prototypische adulte Stammzellen, welche durch ihre Fähigkeit zur multipotenten Selbsterneuerung gekennzeichnet sind.
In der Stammzellenforschung werden Gewebe und Organe für Transplantationszwecke gezüchtet (Tissue Engineering). Stammzellen werden desweiteren für die Behandlung von Gehirnerkrankung (z.B. Parkinson und Alzheimer-Krankheit), Zelldefekten, Blutkrankheiten (z.B. Leukämie), bei Gelenk und Knorpel-Degeneration (z.B. Arthrose) sowie für kosmetische Behandlungen (z.B. Anti-Aging-Behandlungen) eingesetzt. Stammzellen haben in der Regel einen Durchmesser von ca. 15-25 Mikrometern.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind multipotente Stromazellen, welche die Fähigkeit besitzen, sich in eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Osteoblasten (Knochenzellen), Chondrozyten (Knorpelzellen), Myozyten (Muskelzellen) und Adipozyten (Fettzellen), differenzieren zu können.

Stromal-vaskuläre Fraktion (SVF)

Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF) ist ein Bestandteil des Lipoaspirates, welches durch Fettabsaugung des Fettgewebes aus dem menschlichen Körper extrahiert werden kann. Das Lipoaspirat besteht aus einer heterogenen Zellmischung und hat einen hohen Gehalt an Stammzellen, welche "adipose-derived stem cells" (ASC oder ADSC) genannt werden. Sie zeigen Ähnlichkeiten mit Knochenmarksstammzellen, z.B. hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich in multipotente Zellen differenzieren zu können.
Die heterogene Zellmischung des SVF enthält u.a. Erythrozyten, Fibroblasten, Lymphozyten, Endothelzellen, Monozyten / Makrophagen und Perizyten sowie einen wichtigen Anteil der aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (adipose derived stem cells / ASC).

Aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen/Stammzellen (ASC)

Aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen/Stammzellen (ASC / ADSC) setzen ein hohes Level an bioaktiven Wachstumsfaktoren frei, z.B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), thrombozytären Wachstumsfaktor (PDGF), Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-β), Insulinwachstumsfaktor (IGF) sowie den brain-derived neurotrophen Wachstumsfaktor (BDNF). ACS setzen jedoch nicht nur Wachstumsfaktoren frei, sondern sie geben auch sezernieren Zytokine ab, z.B. den fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 (Flt-3) Ligand, Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), Interleukin (IL) (u.a. IL-6, IL 7, IL-8, IL-11 und IL-12), leukämie-hemmenden Faktor (LIF) und Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α).

Gewinnung von Stammzelltypen

Autologe adulte Stammzellen vom Menschen können aus den folgenden Quellen gewonnen werden:

  • aus Knochenmark: die Extraktion erfordert das Anbohren des Knochens.
  • aus Fettgewebe (Fettzellen): die Extraktion erfolgt durch eine Fettabsaugung (Liposuktion).
  • aus Blut: Extraktion durch Apherese, wobei das Blut des Spenders durch eine Art „Dialyse“ -Maschine gepumpt wird, in der die Stammzellen abgesondert werden, während die übrigen Blutbestandteile dem Spender zurückgeführt werden.