Genetische Transformation von Pflanzenzellen mittels Ultraschall

Die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) ist eine effiziente Methode, um Pflanzenzellen mithilfe von Agrobacterium als Transporter mit fremden Genen zu infizieren. Ultraschallkavitation bewirkt Sonoporation, die als gezielte Mikroverletzung von Pflanzengewebe beschrieben werden kann. Über diese durch Ultraschall erzeugten Mikroverletzungen können DNA und DNA-Vektoren effizient in die Zellmatrix transportiert werden.

Sonoporation – durch Ultraschall verbesserte Zelltransformation

Wenn niederfrequenter Ultraschall (ca. 20 kHz) auf Zellsuspensionen angewendet wird, bewirkt die akustische Kavitation eine vorübergehende Permeabilisierung der Zellmembranen im Gewebe. Dieser Ultraschalleffekt wird als Sonoporation bezeichnet und für den Gentransfer in Zellen oder Gewebe genutzt.
Die Vorteile der Ultraschallbehandlung beruhen auf ihrem nichtthermischen, mechanischen Wirkprinzip, wodurch die Beschallung häufig vielseitiger und weniger vom Zelltyp abhängig ist. Die vielseitige Anwendbarkeit der Sonoporation eröffnet die Möglichkeit, transgene Pflanzen zu nutzen, die ein erhebliches Potenzial für die biologische Produktion komplexer humaner therapeutischer Proteine besitzen. Solche pflanzenbasierten Bioreaktoren lassen sich leicht genetisch verändern, verhindern eine mögliche Kontamination mit humanpathogenen Erregern, schädigen keine transformationsvermittelnden Bakterien (z. B. Agrobacterium) und stellen eine kostengünstige, wirksame Methode der Biosynthese dar.

Ultraschallunterstützte Zelltransformation

Die Beschallung ist eine Technik, bei der niederfrequente Ultraschallwellen eingesetzt werden, um Partikel in einer Lösung zu bewegen und Lösungen zu mischen. Dadurch werden Stofftransport und Auflösung beschleunigt. Gleichzeitig kann die Beschallung gelöste Gase aus Flüssigkeiten entfernen. Bei der Pflanzentransformation bewirkt die Beschallung die Bildung von Mikroverletzungen im Pflanzengewebe und verbessert das Einbringen nackter DNA in den pflanzlichen Protoplasten.

Für die genetische Transformation ist die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) die bevorzugte Methode. Sie ist deutlich effizienter als die Beschallung zum direkten Transfer nackter DNA und von DNA-Vektoren in den Protoplasten. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) eingesetzt werden kann, um durch Ultraschallwellen und die daraus resultierende akustische Kavitation mechanische Schädigungen und Verletzungen an Pflanzenzellen hervorzurufen. Eine kurze Ultraschallbehandlung erzeugt Mikroverletzungen auf der Oberfläche von Explantaten. Die verletzten Zellen ermöglichen es Agrobacterium, in tiefere Bereiche des Pflanzengewebes einzudringen, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Infektion der Pflanzenzellen steigt. Zusätzlich fördern die ausgeschiedenen phenolischen Verbindungen die Transformation. Die durch Ultraschall erzeugten Mikroverletzungen erleichtern auch das Eindringen von Bakterien in die Explantate. SAAT wurde erfolgreich zur genetischen Transformation von Pflanzenarten eingesetzt, die als besonders resistent gegenüber Agrobacterium gelten.
Die wichtigsten Vorteile von SAAT sind die sehr einfache und kostengünstige Durchführung sowie die deutliche Verbesserung des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers. Neben der erfolgreichen Anwendung von SAAT bei der Transformation von Chenopodium rubrum L. und Beta vulgaris L. wurde dieser Ansatz auch zur Produktion von rekombinantem hitzelabilem Wildtyp-Holotoxin von Escherichia coli und mutierten LT-Impfstoffadjuvanzien von Escherichia coli in Nicotiana tabacum eingesetzt, wobei die höchsten systemischen LT-B-spezifischen IgG-Titer bei Vögeln nachgewiesen wurden.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka und R. Baranski, 2014)

Allgemeines Vorgehen beim Gentransfer in Pflanzenzellen mittels Sonoporation

1. Vorbereitung des genetischen Materials: Bereiten Sie zunächst das genetische Material vor, das Sie in die Pflanzenzellen einbringen möchten. Dabei kann es sich um Plasmid-DNA, RNA oder andere Nukleinsäuren handeln.
2. Isolierung der Pflanzenzellen: Isolieren Sie die Pflanzenzellen, die Sie behandeln möchten. Je nach Experiment können diese Zellen aus Pflanzengeweben oder Kulturen isoliert werden.
3. Zellsuspension: Suspendieren Sie die Pflanzenzellen in einem geeigneten Medium oder Puffer. Dies ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und sich in einem Zustand befinden, der die Aufnahme von Genen begünstigt.
4. Einrichtung Ihres Ultraschallgeräts: Bereiten Sie Ihr Ultraschallgerät mit Sonotrode vor, indem Sie Beschallungsparameter wie Amplitude, Zeit, Energie und Temperatur voreinstellen. Tauchen Sie die Sonotrode in die Zellsuspension ein.
5. Beschallung: Starten Sie die Beschallung. Die schnelle Schwingung der Sonotrodenspitze erzeugt Kavitationsblasen in der Flüssigkeit. Diese Blasen dehnen sich durch die Ultraschallwellen aus und kollabieren, wodurch mechanische Kräfte und Mikroströmungen in der Suspension entstehen.
6. Sonoporation: Die durch Kavitation erzeugten mechanischen Kräfte und Mikroströmungen erzeugen vorübergehende Poren und Löcher in den Membranen der Pflanzenzellen. Das in der Suspension vorhandene genetische Material kann durch diese Poren in die Pflanzenzellen gelangen.
7. Inkubation: Inkubieren Sie die Pflanzenzellen nach der Sonoporation, damit sie sich erholen und ihre Membranen stabilisieren können. Dies ist ein entscheidender Schritt, um das Überleben der Zellen und einen erfolgreichen Gentransfer sicherzustellen.

Gentransfer über Agrobacterium oder Liposomen

Es gibt zwei gängige Verfahren zur Transfektion von Pflanzenzellen. Sie verwenden entweder Agrobacterium, eine Gattung gramnegativer Bakterien, oder Liposomen als Träger des genetischen Materials.

• Agrobacterium-vermittelte Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens ist ein Bakterium, das häufig in der pflanzlichen Gentechnik eingesetzt wird. Bei dieser Methode wird Plasmid-DNA mit dem gewünschten Gen in Agrobacterium eingebracht, das anschließend mit Pflanzenzellen gemischt wird. Die Zellsuspension wird mit einem Ultraschallgerät mit Sonotrode einer Sonoporation unterzogen. Die Ultraschallenergie verbessert den Transfer des genetischen Materials von Agrobacterium in die Pflanzenzellen. Diese Methode wird häufig zur genetischen Veränderung von Pflanzen eingesetzt.
• Liposomenvermittelte Sonoporation: Liposomen sind lipidbasierte Vesikel, die genetisches Material transportieren können. Bei dieser Methode werden mit Plasmid-DNA oder anderen Nukleinsäuren beladene Liposomen mit Pflanzenzellen gemischt. Die Sonoporation mithilfe eines Ultraschallgeräts mit Sonotrode erleichtert die Aufnahme der Liposomen durch die Pflanzenzellen. Der Ultraschall bricht die Lipiddoppelschichten der Liposomen auf und setzt dadurch das genetische Material in den Pflanzenzellen frei. Dieser Ansatz eignet sich für Untersuchungen zur transienten Genexpression in Pflanzenzellen.

Wissenschaftlich belegte Vorteile der ultraschallunterstützten Agrobacterium-vermittelten Transformation (SAAT)

Die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) wurde bei zahlreichen Pflanzenarten angewendet. Eine kurze und relativ milde Ultraschallbehandlung von Pflanzenzellkulturen bewirkt Sonoporation, die anschließend ein tiefes Eindringen von Agrobacterium als Gentransporter ermöglicht. Im Folgenden finden Sie beispielhafte Studien, die die vorteilhaften Effekte von SAAT belegen.

Ultraschallunterstützte Transformation von Ashwagandha

Um die Transformationseffizienz bei W. somnifera (bekannt als Ashwagandha oder Winterkirsche) zu verbessern, untersuchten Dehdashti und Kollegen (2016) den Einsatz von Acetosyringon (AS) und Beschallung.
Acetosyringon (AS) wurde in drei Phasen zugesetzt: bei der Flüssigkultur von Agrobacterium, bei der Infektion mit Agrobacterium und bei der Kokultur von Explantaten mit Agrobacterium. Die Zugabe von 75 μM AS zur Agrobacterium-Flüssigkultur erwies sich als optimal für die Induktion der vir-Gene.
Die zusätzliche Anwendung der Beschallung (SAAT) führte zur höchsten Genexpression. Die gusA-Genexpression in Haarwurzeln war am höchsten, wenn Blätter und Sprossspitzen für 10 bzw. 20 s beschallt wurden. Die Transformationseffizienz des verbesserten Protokolls betrug bei Blatt- bzw. Sprossspitzenexplantaten 66,5 bzw. 59,5 %. Im Vergleich zu anderen Protokollen war die Transformationseffizienz dieses verbesserten Protokolls bei Blättern 2,5-fach höher und bei Sprossspitzen 3,7-fach höher. Southern-Blot-Analysen bestätigten 1–2 Kopien des gusA-Transgens in den Linien W1–W4, während in der mit dem verbesserten Protokoll erzeugten Linie W5 insgesamt 1–4 Transgenkopien nachgewiesen wurden.

Einfluss der Dauer der ultraschallunterstützten Agrobacterium-vermittelten Transformation (SAAT) auf die Transformationshäufigkeit von Blatt- (a) und Sprossspitzenexplantaten (b) von W. somnifera
(Studie und Grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraschallunterstützte Transformation von Baumwolle

Hussain et al. (2007) zeigen die vorteilhaften Effekte der ultraschallunterstützten Transformation von Baumwolle. Die durch niederfrequenten Ultraschall verursachte akustische Kavitation erzeugt Mikroverletzungen auf und unter der Oberfläche des Pflanzengewebes (Sonoporation) und ermöglicht es Agrobacterium, tiefer einzudringen und das Pflanzengewebe vollständig zu durchdringen. Diese Art der Verletzung erhöht die Wahrscheinlichkeit, tiefer im Gewebe liegende Pflanzenzellen zu infizieren. Zur Bewertung der Transformationseffizienz von SAAT wurde die GUS-Genexpression gemessen. Das GUS-Reportersystem ist ein Reportergensystem, das insbesondere in der pflanzlichen Molekularbiologie und der Mikrobiologie nützlich ist. Durch die Anpassung verschiedener SAAT-Parameter wurde die transiente GUS-Expression in Baumwolle unter Verwendung reifer Embryonen als Explantate deutlich gesteigert. GUS wurde erstmals 24 h nach der Inkubation der Explantate nachgewiesen. Nach 48 h war die GUS-Expression sehr intensiv und diente als nützlicher Indikator für eine erfolgreiche Transformation des Baumwoll-Explantats nach ultraschallunterstützter Agrobacterium-vermittelter Transformation (SAAT). Beim Vergleich verschiedener Transformationstechniken (Biolistik, Agro, BAAT, SAAT) zeigte die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) mit Abstand die besten Transformationsergebnisse.

Auswahl des Transformationsverfahrens anhand der transienten GUS-Expression. Die ultraschallunterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) zeigt eine deutlich höhere transiente Expression.
(Studie und Grafik: © Hussain et al., 2007)

Leistungsstarke Ultraschalllösungen für Sonoporation und SAAT

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Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Überblick über die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallgeräte: