Gentransformation in Pflanzenzellen mittels Ultraschall

Die Ultraschall-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) ist eine effiziente Methode zur Infektion von Pflanzenzellen mit Fremdgenen. Dabei wird Agrobacterium als Transporter genutzt wird. Ultraschallkavitation verursacht Sonoporation, wodurch eine gezielte Mikroverwundung des Pflanzengewebes erreicht wird. Über diese mit Ultraschall erzeugten Mikroverletzungen können DNA und DNA-Vektoren effizient in die Zellmatrix transportiert werden.

Sonoporation – Durch Ultraschall intensivierte Zelltransformation

Wenn niederfrequenter Ultraschall (ca. 20 kHz) auf Zellsuspensionen angewendet wird, bewirken die Effekte der akustischen Kavitation eine vorübergehende Membranpermeabilisierung im Zellgewebe. Dieser Ultraschalleffekt ist als Sonoporation bekannt und wird für den Gentransfer in Zellen oder Gewebe genutzt.
Die Vorteile der Ultraschallbehandlung beruhen auf ihrem nicht-thermischen mechanischen Arbeitsprinzip, das die Ultraschallbehandlung oft vielseitiger und weniger abhängig von Zelltypen macht. Die vielseitige Anwendung der Sonoporation eröffnet die Möglichkeit, transgene Pflanzen zu nutzen, welche ein erhebliches Potenzial für die Bioproduktion komplexer therapeutischer Proteine haben. Solche pflanzenbasierten Bioreaktoren lassen sich leicht genetisch manipulieren, verhindern die potenzielle Kontamination mit menschlichen Krankheitserregern, schädigen die transformationsvermittelnden Bakterien (z.B. Agrobacterium tumefaciens) nicht und sind eine kostengünstige, wirksame Methode der Biosynthese.

Ultraschall-gestützte Zelltransformation

Die Beschallung ist eine Technik, bei der Niederfrequenz-Ultraschallwellen eingesetzt werden, um Partikel in einer Lösung zu homogenisieren, Lösungen zu mischen und so die Geschwindigkeit des Stoffaustauschs und des Lösens zu erhöhen. Gleichzeitig können durch die Beschallung gelöste Gase aus Flüssigkeiten entfernt werden. Bei der Pflanzentransformation bewirkt die Beschallung die Bildung von Mikrowunden auf dem Pflanzengewebe und verbessert die Übertragung von nackter DNA oder DNA-Vektoren in den Pflanzenprotoplasten.

Für die Gentransformation ist die Ultraschall-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) die bevorzugte Methode und hat eine deutlich höhere Effizienz als das Sonikations-Verfahren, bei dem nackte DNA und DNA-Vektoren direkt in den Protoplasten übertragen werden. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die ultraschall-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) durch Ultraschallwellen und die daraus resultierende akustische Kavitation Mikrowunden an Pflanzenzellen hervorrufen kann. Eine kurze Ultraschallbehandlung erzeugt Mikrowunden auf und unter der Oberfläche von Explantaten. Die verletzten Zellen ermöglichen das Eindringen von Agrobacterium in die tieferen Teile des Pflanzengewebes, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Infektion der Pflanzenzellen erhöht wird. Außerdem fördern die sekretierten phenolischen Verbindungen die Transformation. Durch die mit Ultraschall erzeugten Mikrowunden wird zudem das Eindringen der Bakterien in die Explantate gefördert. SAAT wurde erfolgreich für die genetische Transformation von Pflanzenarten eingesetzt, die als besonders resistent gegen das Agrobacterium gelten.
SAAT ist ein sehr einfaches und kostengünstiges Verfahren, das den Agrobacterium-vermittelten Gentransfer deutlich verbessert. Neben der erfolgreichen Anwendung von SAAT bei der Transformation von Chenopodium rubrum L. und Beta vulgaris L. wurde dieser Ansatz auch bei der Produktion von rekombinantem Escherichia coli Wildtyp hitzelabilem Holotoxin und Escherichia coli mutierten LT-Impfstoffadjuvantien in Nicotiana tabacum angewandt, bei denen die höchsten systemischen LT-B-spezifischen IgG-Titer bei Vögeln nachgewiesen wurden.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka und R. Baranski, 2014)

Allgemeines Verfahren für den Gentransfer durch Sonoporation in Pflanzenzellen

1. Vorbereitung des genetischen Materials: Bereiten Sie zunächst das genetische Material vor, das Sie in die Pflanzenzellen einbringen wollen. Dabei kann es sich um Plasmid-DNA, RNA oder andere Nukleinsäuren handeln.
2. Isolierung von Pflanzenzellen: Isolieren Sie die Pflanzenzellen, auf die Sie abzielen wollen. Je nach Experiment können diese Zellen aus Pflanzengeweben oder -kulturen isoliert werden.
3. Zellsuspension: Suspendieren Sie die Pflanzenzellen in einem geeigneten Medium oder Puffer. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und sich in einem Zustand befinden, der die Genaufnahme begünstigt.
4. Richten Sie Ihren Sonicator ein: Bereiten Sie Ihr Sondenschallgerät vor, indem Sie Parameter wie Amplitude, Zeit, Energie und Temperatur voreinstellen. Tauchen Sie die Ultraschallsonde in die Zellsuspension ein.
5. Ultraschallverfahren: Starten Sie den Beschallungsvorgang. Die schnelle Schwingung der Sondenspitze erzeugt Kavitationsblasen in der Flüssigkeit. Diese Blasen expandieren und kollabieren aufgrund der Ultraschallwellen, wodurch mechanische Kräfte und Mikroströmungen in der Suspension entstehen.
6. Sonoporation: Die durch die Kavitation erzeugten mechanischen Kräfte und Mikroströmungen schaffen vorübergehend Poren und Löcher in den Membranen der Pflanzenzellen. Das in der Suspension enthaltene genetische Material kann durch diese Poren in die Pflanzenzellen gelangen.
7. Inkubation: Inkubieren Sie die Pflanzenzellen nach der Sonoporation, damit sie sich erholen und ihre Membranen stabilisieren können. Dies ist ein entscheidender Schritt, um das Überleben der Zellen und einen erfolgreichen Gentransfer zu gewährleisten.

Gentransfer über Agrobacterium oder Liposomen

Es gibt zwei gängige Formen der Transfektion von Pflanzenzellen. Sie verwenden entweder Agrobacterium, eine Gattung gramnegativer Bakterien, oder Liposomen als Träger des genetischen Materials.

• Agrobacterium-vermittelte Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens ist ein Bakterium, das häufig in der Pflanzengentechnik eingesetzt wird. Bei dieser Methode wird Plasmid-DNA, die das gewünschte Gen enthält, in das Agrobacterium eingeführt, das dann mit Pflanzenzellen gemischt wird. Die Zellsuspension wird einer Sonoporation mit einem Sondensonicator unterzogen. Durch die Ultraschallenergie wird die Übertragung des genetischen Materials von Agrobacterium auf die Pflanzenzellen gefördert. Diese Methode wird häufig für die genetische Veränderung von Pflanzen eingesetzt.
• Liposomen-vermittelte Sonoporation: Liposomen sind Bläschen auf Lipidbasis, die genetisches Material tragen können. Bei dieser Methode werden Liposomen, die mit Plasmid-DNA oder anderen Nukleinsäuren beladen sind, mit Pflanzenzellen vermischt. Um die Aufnahme der Liposomen in die Pflanzenzellen zu erleichtern, wird eine Sonoporation mit einem Sondensonicator durchgeführt. Durch den Ultraschall werden die Lipiddoppelschichten der Liposomen aufgebrochen und das genetische Material in die Pflanzenzellen freigesetzt. Dieser Ansatz ist nützlich für Studien zur vorübergehenden Genexpression in Pflanzenzellen.

Wissenschaftlich nachgewiesene Vorteile der Ultraschall-gestützten Agrobacterium-vermittelten Transformation (SAAT)

Die Ultraschall-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) wurde bereits bei zahlreichen Pflanzenarten angewandt. Eine kurze und relativ milde Ultraschallbehandlung von Pflanzenzellkulturen bewirkt eine Sonoporation, die anschließend ein tiefes Eindringen von Agrobacterium als Gentransporter ermöglicht. Nachstehend finden Sie beispielhafte Studien, welche die positiven Auswirkungen von SAAT belegen.

Ultraschall-gestützte Transformation von Ashwagandha

Um die Transformationseffizienz von W. somnifera (auch Ashwagandha oder Winterkirsche genannt) zu verbessern, untersuchten Dehdashti und Kollegen (2016) den Einsatz von Acetosyringon (AS) und Ultraschall.
Acetosyringon (AS) wurde an drei Stellen zugegeben: Agrobacterium-Flüssigkultur, Agrobacterium-Infektion und Co-Kultur von Explantaten mit Agrobacterium. Die Zugabe von 75 μM AS zur Agrobacterium-Flüssigkultur erwies sich als optimal für die Induktion von vir-Genen.
Die zusätzliche Anwendung von Ultraschall (SAAT) führte zur höchsten Genexpression. Die gusA-Genexpression in Haarwurzeln war am besten, wenn die Blätter und Sprossspitzen 10 bzw. 20 Sekunden lang beschallt wurden. Die Transformationseffizienz des verbesserten Protokolls lag bei 66,5 % für Blatt- und 59,5 % für Sprossspitzenexplantate. Im Vergleich zu anderen Protokollen war die Transformationseffizienz dieses verbesserten Protokolls bei Blättern 2,5-fach und bei Sprossspitzen 3,7-fach höher. Southern-Blot-Analysen bestätigten 1-2 Kopien des gusA-Transgens in den Linien W1-W4, während in der Linie W5, die mit dem verbesserten Protokoll erzeugt wurde, 1-4 Transgenkopien nachgewiesen wurden.

Auswirkung der Dauer der Ultraschall-gestützten Agrobacterium-vermittelten Transformation (SAAT) auf die Transformationshäufigkeit von W. somnifera- (a)Blatt- und (b) Sprossspitzen-Explantaten
(Studie und Grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraschall-gestützte Transformation von Baumwolle

Hussain et al. (2007) zeigen die positiven Auswirkungen der ultraschall-gestützten Transformation in der Baumwoll-Pflanze. Die durch Niederfrequenz-Ultraschall verursachte akustische Kavitation erzeugt Mikrowunden auf und unter der Oberfläche des Pflanzengewebes (Sonoporation) und ermöglicht es dem Agrobakterium, tiefer und vollständig in das Pflanzengewebe einzudringen. Diese Art der Verwundung erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass tiefer im Gewebe liegende Pflanzenzellen infiziert werden. Um die Transformationseffizienz von SAAT zu bewerten, wurde die GUS-Genexpression gemessen. Das GUS-Reportersystem ist ein Reportergensystem, das insbesondere in der Pflanzenmolekularbiologie und Mikrobiologie eingesetzt wird. Durch die Anpassung verschiedener SAAT-Parameter konnte die transiente GUS-Expression in Baumwolle unter Verwendung reifer Embryonen als Explantat deutlich gesteigert werden. GUS wurde erstmals 24 Stunden nach der Inkubation der Explantate nachgewiesen. Nach 48 Stunden war die GUS-Expression sehr intensiv, was als nützlicher Indikator für eine erfolgreiche Transformation des Baumwoll-Explantats nach der ultraschall-gestützten Agrobacterium-vermittelten Transformation (SAAT) diente. Beim Vergleich verschiedener Transformationstechniken (biolistische, Agro-, BAAT- und SAAT-Techniken) zeigte die ultraschall-gestützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) bei weitem die besten Transformationsergebnisse.

Wahl des Transformationsverfahrens auf der Grundlage der transienten Expression von GUS. Die Ultraschall-unterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation (SAAT) zeigt eine deutlich höhere transiente Expression.
(Studie und Grafik: © Hussain et al., 2007)

Hochleistungs-Ultraschallprozessoren für die Sonoporation und SAAT

Hielscher Ultrasonics verfügt über langjährige Erfahrung in der Entwicklung und Herstellung von Hochleistungs-Ultraschallgeräten für Laboratorien, Forschungseinrichtungen sowie für die industrielle Produktion mit sehr hohem Durchsatz. Für die Mikrobiologie und die Life Science bietet Hielscher verschiedene Lösungen an, um den unterschiedlichen Anforderungen gerecht zu werden, die für bestimmte Gewebe und deren Behandlung notwendig sind. Für die gleichzeitige Beschallung zahlreicher Proben bietet Hielscher den UIP400MTP für Multiwell-Platten, den VialTweeter für die Beschallung von bis zu 10 Fläschchen (z.B. Eppendorf-Röhrchen) oder das Ultraschall-CupHorn. Als Laborhomogenisatoren sind Sonden-Ultraschallgeräte von 50 bis 400 Watt erhältlich, während Industriesysteme den Leistungsbereich von 500 Watt bis 16 kW abdecken.
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In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren: