Sonikeringsassisteret proteinudvinding fra tumorvæv – protokol

Denne protokol beskriver en sonikeringsassisteret proteinekstraktionsmetode til tumorvæv, der forbedrer standard CPTAC urea lysis workflow ved at tilføje et kontrolleret probe-sonikeringstrin under vævsforstyrrelse. Denne modifikation bygger på den etablerede CPTAC-proteom- og fosfoproteompræparationsstrategi i dyb skala og forbedrer forstyrrelse af celle- og subcellulær struktur, reducerer prøveviskositet og forbedrer frigivelse af proteiner, der typisk er sværere at genvinde med urinstoflysis alene, især membranbundne og DNA-bindende eller kerneassocierede proteiner. I den underliggende undersøgelse øgede den sonikeringsassisterede arbejdsgang påvisningen af både proteiner og fosfopeptider, samtidig med at kompatibiliteten med den efterfølgende CPTAC-lignende fordøjelse, TMT-mærkning, fraktionering, fosfopeptidberigelse og LC-MS/MS-analyse-pipeline blev bevaret.

Sonikeringsassisteret proteinekstraktion fra tumorvæv til dyb proteomisk og fosfoproteomisk analyse

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Anvendelsesområde for protokollen

Brug denne procedure til:

• friskfrosset, kryopulveriseret tumorvæv
• cellepellets eller andre biologiske prøver, hvor urinstofbaseret ekstraktion allerede er etableret
• globale proteomik- og fosfoproteomik-arbejdsgange med tryptisk fordøjelse og valgfri TMT-mærkning

Undersøgelsen af Li et al. (2025) siger, at arbejdsgangen også kan anvendes til andre prøvetyper som cellelinjer, blod og urin, men optimering kan være nødvendig efter prøvetype.

Optimeret arbejdsgang for prøveforberedelse med implementeret sonikeringstrin. Den optimerede arbejdsgang og det eksperimentelle design er baseret på CPTAC-prøveforberedelsesprotokollen til global proteomisk og fosfoproteomisk analyse.
Undersøgelse og skema: ©Li et al., 2025

Arbejdsprincip

Den oprindelige undersøgelse tilføjede sonikering til standard CPTAC urea lysis workflow og fandt forbedret påvisning af proteiner forbundet med membraner og kerner. Forfatterne siger, at sonikeringsparametrene skal finjusteres med hensyn til prøvestørrelse/koncentration. – ved at vælge sonotrodens størrelse, energitilførsel og pulstiming.

For Hielscher UP200Ht og UP200St betyder det f.eks:

• brug amplitude og pulstilstand som de vigtigste kontrolvariabler
• Hold prøverne kolde hele vejen igennem (f.eks. på is)
• Begynd med konservative indstillinger
• optimer i forhold til prøvens klarhed, temperatur, proteinudbytte og downstream-peptidkvalitet

 
Begge Hielscher 200 watt sonikatormodeller UP200Ht og UP200St er designet til små og mellemstore prøvevolumener med justerbare amplitude- og pulsindstillinger; begge ultralydshomogenisatorer giver digital berøringsskærmskontrol til præcis parameterjustering, automatiseret dataoptagelse, pluggbar temperatursensor, fjernbetjening, prøvebelysning.
 

Reagenser til sonikeringsassisteret proteinekstraktion

Urea lysis-buffer

Tilbered frisk umiddelbart før brug:

• 8 M urinstof
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea skal være helt opløst, før der tilsættes additiver; inhibitorer skal tilsættes umiddelbart før brug; bufferen skal opbevares på is; og det anbefales at hvirvle snarere end at vortexe kraftigt efter tilsætning af additiver.
 

Yderligere reagenser:

• Reagenser til BCA-proteinanalyse
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Myresyre
• TMT-reagenser, hvis du bruger multiplexet kvantitativ proteomik
• IMAC-reagenser, hvis du udfører fosfopeptidberigelse

Udstyr til sonikeringsassisteret proteinekstraktion

Påkrævet

Anbefalet valg af probe

Til prøver omkring 200-1000 µL skal du bruge en sonotrode med lille diameter, der er egnet til direkte højintensitetsbehandling af små mængder. Hielscher tilbyder flere sonotrode-diametre, og mindre spidsdiametre giver højere intensitet ved spidsen.

Praktisk bemærkning: Brug den mindste sonde, der giver effektiv blanding uden overdreven skumdannelse eller kontakt med beholdervæggen.

Hvis du arbejder med flere prøver på samme tid, kan du overveje Multi-Tube Sonicator VialTweeter eller Microplate Sonicator UIP400MTP!

Trin-for-trin instruktioner: Procedure for sonikeringsassisteret proteinekstraktion

A. Forkøl og forbered

1. Køl centrifugen ned til 4 °C.
2. Forbered frisk urea lysis-buffer, og opbevar den på is.
3. Sæt UP200Ht eller UP200St op på et stativ inde i et lydkabinet.
4. Forbered et isbad, der er stort nok til at holde prøverørene oprejst og stabile.

Forberedelse af frisk buffer og kold håndtering er afgørende.

B. Indledende ekstraktion af urea

1. Opbevar kryopulveriseret væv på is.
2. Tilsæt 200 µL afkølet urea lysisbuffer pr. 50 mg vådt væv.
3. Vortex 5-10 s ved høj hastighed.
4. Inkuber 15 minutter ved 4°C.
5. Gentag vortex-plus-inkubationstrinnet en gang til.
6. Centrifuger ved 20.000 g i 10 minutter ved 4 °C.
7. Overfør lysat/supernatant til et rent rør med lav binding.

C. Sonikering med brug af UP200Ht eller UP200St

Startbetingelser for sonikering

• Amplitude: start ved 20-30%.
• Pulslængde: 5 s ON
• Afkøling: 2 minutter på is mellem impulserne
• Antal cyklusser: 4 cyklusser
• Samlet aktiv sonikeringstid: 20 s
• Samlet procestid inklusive afkøling: ca. 8-10 min.

Trin til sonikering

1. Overfør lysat til et rør, der er egnet til sonikering. Brug et smalt, tyndvægget rør, der giver mulighed for god varmeudveksling og sikker nedsænkning af sonden.
2. Anbring røret i et isbad. Artiklen identificerer afkøling under sonikering som afgørende for at forhindre varmeskader.
3. Sænk probespidsen ned i prøven. Hold spidsen tilstrækkeligt nedsænket til at opnå stabil kavitation, men lad den ikke røre rørets væg eller bund.
4. Kør en 5 s-puls ved startamplituden.
5. Sæt straks prøven helt tilbage på is i 2 minutter.
6. Gentag, indtil 4 cyklusser er gennemført.
7. Undersøg lysatet efter cyklus.
8. Fortsæt kun, hvis det er nødvendigt, med en ekstra 5 s-puls ad gangen, altid efterfulgt af fuld afkøling.
9. Stop, når lysatet bliver mere ensartet og mindre trevlet/viskøst.
   Slutpunktet er et mere gennemskinneligt lysat, der danner dråber i stedet for en kontinuerlig viskøs strøm.
10. Centrifuger ved ca. 16.000 g i 15 minutter ved 4 °C.
11. Overfør den klarede supernatant til et nyt rør, og mål proteinkoncentrationen.

Sammenligning af global proteomik og fosfoproteomik mellem sonikerede og ikke-sonikerede prøver.
a. Antal identificerede proteiner (global proteomics) i alle PDX-tumorvæv med eller uden sonikering. b. Antal identificerede fosfopeptider (IMAC-berigelse) i alle PDX-tumorvæv med eller uden sonikering. Kun proteiner og fosfopeptider med abundansforhold større end eller lig med den 25. percentil blev talt med. Overflødighedsforholdet blev beregnet mellem de samme typer prøver.
Undersøgelse og grafer: ©Li et al., 2025

Downstream-fordøjelse og -analyse

Efter sonikering og klaring fortsætter du som beskrevet i den oprindelige CPTAC-arbejdsgang:

1. Fortynd lysat 1:3 (v/v) med 50 mM Tris-HCl pH 8,0 for at reducere urinstof til <2 M.
2. Tilsæt LysC med 1 mAU pr. 50 µg protein, og inkuber 2 timer ved 25 °C.
3. Tilsæt trypsin i forholdet 1:49 enzym:substrat (w/w), og fordøj natten over ved 25 °C.
4. Sluk med myresyre til 1% endelig.
5. Fortsæt med afsaltning, TMT-mærkning, fraktionering, phosphopeptidberigelse og LC-MS/MS efter behov.

Differentiel ekspression af fosfopeptider fra TMT-mærket MS.
a. Den basale undertype, der fremhæver nogle humane fosfopeptider (proteinsekvensens begyndelse og slutning), der er opreguleret i sonikerede prøver sammenlignet med ikke-sonikerede prøver. b. Den luminale undertype, der fremhæver nogle humane fosfopeptider (protein_sekvensens begyndelse og slutning), der er opreguleret i sonikerede prøver sammenlignet med ikke-sonikerede prøver. c. Berigede KEGG-veje baseret på proteinerne i opregulerede fosfopeptider i sonikerede basale undertyper af tumorer. d. Berigede KEGG-veje baseret på proteinerne i opregulerede fosfopeptider i sonikerede luminale undertyper af tumorer.
Undersøgelse og grafer: ©Li et al., 2025

Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Hårde forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydsapparater.

Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.

Litteratur / Referencer