Sonikeringsassisteret proteinekstraktion fra tumorvæv – protokol

Denne protokol beskriver en metode til sonikeringsassisteret proteinekstraktion fra tumorvæv, som videreudvikler standardarbejdsgangen for urealyse fra CPTAC ved at tilføje et kontrolleret trin med sondesonikering under vævsdisruptionen. Med udgangspunkt i den etablerede præparationsstrategi fra CPTAC til dybdegående proteom- og fosfoproteomanalyse forbedrer denne ændring disruptionen af celler og subcellulære strukturer, reducerer prøvens viskositet og øger frigivelsen af proteiner, som typisk er vanskeligere at udvinde med urealyse alene, især membranbundne og DNA-bindende eller cellekerneassocierede proteiner. I det bagvedliggende studie øgede den sonikeringsassisterede arbejdsgang påvisningen af både proteiner og fosfopeptider, samtidig med at kompatibiliteten med den efterfølgende analysearbejdsgang med spaltning efter modellen fra CPTAC, mærkning med TMT, fraktionering, fosfopeptidberigelse og analyse med LC-MS/MS blev bevaret.

Sonikeringsassisteret proteinekstraktion fra tumorvæv til dybdegående proteomisk og fosfoproteomisk analyse

Følgende protokol er optimeret til ekstraktion af proteiner fra kryopulveriseret tumorvæv i en lysebuffer med 8 M urea: Et ekstra trin med sondesonikering forbedrer udvindingen af vanskeligt ekstraherbare proteinklasser, især membranassocierede proteiner og proteiner associeret med DNA/cellekernen, før spaltning og efterfølgende analyse med LC-MS/MS. I det bagvedliggende studie af Li et al. (2025) øgede tilføjelsen af sonikering påvisningen af membran- og cellekerneassocierede proteiner og understøttede en dybdegående dækning af >12.000 proteiner og >25.000 fosfopeptider med deres arbejdsgang.

Protokollens anvendelsesområde

Brug denne procedure til:

• friskfrosset, kryopulveriseret tumorvæv
• cellepellets eller andre biologiske prøver, hvor ureabaseret ekstraktion allerede er etableret
• arbejdsgange til global proteomik og fosfoproteomik med tryptisk spaltning og valgfri TMT-mærkning

Studiet af Li et al. (2025) angiver, at arbejdsgangen også kan anvendes til andre prøvetyper såsom cellelinjer, blod og urin, men optimering kan være nødvendig afhængigt af prøvetypen.

Optimeret arbejdsgang til prøvepræparation med et implementeret sonikeringstrin. Den optimerede arbejdsgang og forsøgsdesignet er baseret på CPTAC-protokollen til prøvepræparation til global proteomisk og fosfoproteomisk analyse.
Studie og skematisk fremstilling: ©Li et al., 2025

Funktionsprincip

Det oprindelige studie tilføjede sonikering til den almindelige CPTAC-arbejdsgang med urea-lyse og fandt forbedret påvisning af proteiner associeret med membraner og cellekerner. Forfatterne angiver, at sonikeringsparametrene skal finjusteres i forhold til prøvestørrelse/-koncentration – ved at vælge sonotrodestørrelse, energitilførsel og pulstiming.

For Hielscher UP200Ht og UP200St betyder dette eksempelvis:

• brug amplitude og pulstilstand som de primære styringsvariabler
• hold prøverne kolde under hele forløbet (dvs. på is)
• begynd med forsigtige indstillinger
• optimer ud fra prøvens klarhed, temperatur, proteinudbytte og den efterfølgende peptidkvalitet

 
Begge ultralydsapparatmodeller på 200 watt fra Hielscher, UP200Ht og UP200St, er udviklet til små og mellemstore prøvevolumener med justerbare amplitude- og pulsindstillinger; begge ultralydshomogenisatorer tilbyder digital berøringsskærmsstyring til præcis parameterjustering, automatisk dataregistrering, tilslutningsbar temperatursensor, fjernstyring og prøvebelysning.
 

Reagenser til sonikeringsassisteret proteinekstraktion

Urea-lysebuffer

Tilbered frisk umiddelbart før brug:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea skal være fuldstændigt opløst, før tilsætningsstofferne tilsættes; inhibitorer bør tilsættes umiddelbart før brug; bufferen bør opbevares på is; og efter tilsætning af tilsætningsstoffer anbefales forsigtig bevægelse i cirkler frem for kraftig vortexblanding.
 

Yderligere reagenser:

• Reagenser til BCA-proteinanalyse
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Myresyre
• TMT-reagenser, hvis der anvendes multiplexeret kvantitativ proteomik
• IMAC-reagenser, hvis der udføres fosfopeptidberigelse

Udstyr til sonikeringsassisteret proteinekstraktion

Påkrævet

Anbefalet valg af sonde

Til prøver på omkring 200–1000 µL skal der bruges en sonotrode med lille diameter, som er egnet til direkte behandling af små volumener med høj intensitet. Hielscher tilbyder flere sonotrodediametre, og mindre spidsdiametre giver højere intensitet ved spidsen.

Praktisk bemærkning: Brug den mindste sonde, der giver effektiv blanding uden overdreven skumdannelse eller kontakt med beholdervæggen.

Hvis du arbejder med flere prøver samtidig, kan du overveje ultralydsapparatet VialTweeter til flere prøverør eller ultralydsapparatet UIP400MTP til mikroplader!

Trinvise instruktioner: Procedure til sonikeringsassisteret proteinekstraktion

A. Forkøl og klargør

1. Køl centrifugen til 4°C.
2. Tilbered frisk urea-lysebuffer, og opbevar den på is.
3. Monter UP200Ht eller UP200St på et stativ i et lydisolerende kabinet.
4. Klargør et isbad, der er stort nok til at holde prøverørene oprejst og stabilt.

Frisk tilberedning af bufferen og håndtering under kolde forhold er afgørende.

B. Indledende ureaekstraktion

1. Opbevar kryopulveriseret væv på is.
2. Tilsæt 200 µL kølet urea-lysebuffer pr. 50 mg vådt væv.
3. Vortexbland i 5–10 s ved høj hastighed.
4. Inkuber i 15 min ved 4°C.
5. Gentag trinnet med vortexblanding og inkubation endnu en gang.
6. Centrifuger ved 20.000g i 10 min ved 4°C.
7. Overfør lysatet/supernatanten til et rent rør med lav binding.

C. Sonikering med UP200Ht eller UP200St

Startbetingelser for sonikering

• Amplitude: start ved 20–30%
• Pulslængde: 5 s TIL
• Køling: 2 min på is mellem pulserne
• Antal cyklusser: 4 cyklusser
• Samlet aktiv sonikeringstid: 20 s
• Samlet procestid inklusive køling: cirka 8–10 min

Sonikeringstrin

1. Overfør lysatet til et rør, der er egnet til sonikering. Brug et smalt, tyndvægget rør, som giver god varmeudveksling og sikker nedsænkning af sonden.
2. Placer røret i et isbad. Artiklen fremhæver køling under sonikering som afgørende for at forhindre varmeskader.
3. Nedsænk sondespidsen i prøven. Hold spidsen tilstrækkeligt nedsænket til at sikre stabil kavitation, men lad den ikke berøre rørets væg eller bund.
4. Kør én puls på 5 s ved startamplituden.
5. Sæt straks prøven helt tilbage på is i 2 min.
6. Gentag, indtil 4 cyklusser er gennemført.
7. Undersøg lysatet efter en cyklus.
8. Fortsæt kun efter behov med én ekstra puls på 5 s ad gangen, altid efterfulgt af fuld afkøling.
9. Stop, når lysatet bliver mere ensartet og mindre trådtrækkende/viskøst.
   Slutpunktet er et mere gennemskinneligt lysat, der danner dråber frem for en sammenhængende viskøs strøm.
10. Centrifuger ved cirka 16.000g i 15 min ved 4°C.
11. Overfør den klarede supernatant til et nyt rør, og mål proteinkoncentrationen.

Sammenligning af global proteomik og fosfoproteomik mellem sonikerede og ikke-sonikerede prøver.
a. Antal identificerede proteiner (global proteomik) i alle PDX-tumorvæv med eller uden sonikering. b. Antal identificerede fosfopeptider (IMAC-berigelse) i alle PDX-tumorvæv med eller uden sonikering. Kun proteiner og fosfopeptider med et abundansforhold større end eller lig med den 25. percentil blev talt med. Abundansforholdet blev beregnet mellem prøver af samme type.
Studie og grafer: ©Li et al., 2025

Efterfølgende spaltning og analyse

Efter sonikering og klaring fortsættes som beskrevet i den oprindelige arbejdsgang efter CPTAC-modellen:

1. Fortynd lysatet 1:3 (v/v) med 50 mM Tris-HCl pH 8,0 for at reducere ureakoncentrationen til <2 M.
2. Tilsæt LysC i en mængde på 1 mAU pr. 50 µg protein, og inkuber i 2 h ved 25°C.
3. Tilsæt trypsin i forholdet 1:49 enzym:substrat (w/w), og lad spaltningen forløbe natten over ved 25°C.
4. Stop reaktionen med myresyre til en slutkoncentration på 1%.
5. Fortsæt med afsaltning, TMT-mærkning, fraktionering, fosfopeptidberigelse og LC-MS/MS efter behov.

Differentiel ekspression af fosfopeptider fra TMT-mærket MS.
a. Den basale undertype med fremhævelse af nogle humane fosfopeptider (protein-sequence start og slutning), som er opreguleret i sonikerede prøver sammenlignet med ikke-sonikerede prøver. b. Den luminale undertype med fremhævelse af nogle humane fosfopeptider (protein_sequence start og slutning), som er opreguleret i sonikerede prøver sammenlignet med ikke-sonikerede prøver. c. Berigede KEGG-signalveje baseret på proteinerne for opregulerede fosfopeptider i sonikerede tumorer af den basale undertype. d. Berigede KEGG-signalveje baseret på proteinerne for opregulerede fosfopeptider i sonikerede tumorer af den luminale undertype.
Studie og grafer: ©Li et al., 2025

Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielschers ultralydsapparater er velkendte for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores ultralydsapparater i industrianlæg. Hielschers ultralydsapparater håndterer let barske forhold og krævende miljøer.

Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater er naturligvis CE-kompatible og opfylder kravene fra UL, CSA og RoHs.

Litteratur / referencer

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.