Ultrasonic Lysis til Western blot

• Western blot er en analytisk procedure til påvisning af specifikke proteiner i en prøve af vævshomogenat eller celleekstrakt.
• For at køre et Western blot eller for at måle enzymaktivitet kræver mange assays adgang til materialerne (fx proteiner, DNA, subcellulære fragmenter) indesluttet i cellen.
• Sonication er en pålidelig og nem at håndtere metode til styret celleforstyrrelse og lysis.

Ultralydcelleforstyrrelser

Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er det første trin for mange biologiske, biokemiske og analytiske teknikker (PAGE, Western blotting, ELISA, massespektrometri, etc.) eller proteinrensning. For at opnå et højt proteinudbytte skal cellematerialet og vævet være effektivt forstyrret / lyseret. Uanset om plantecelle eller dyrvæv, sonikering er metoden til at forberede dit celle lysat nemt og hurtigt.

Fordele ved Sonication

• Hurtig & effektiv
• nem betjening
• højt proteinudbytte
• reproducerbar / gentagelig
• nøjagtigt kontrolleret
• skalerbar

Immunpræcipitationsprotokol til Western Immunoblotting

A. Reagenser

Til fremstilling af opløsningerne anvendes renset vand, såsom Milli-Q.

• 1 x phosphatbufferet saltvand (PBS)
• 1 x cellysisbuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM P-glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg / ml leupeptin
  Vigtigt: Tilsæt 1 mM PMSF umiddelbart inden brug.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G er tilstrækkeligt til IP, men det kan afhænge af dit primære antistof og prøvevolumen. Du kan også bruge præ-blandet protein A / G agarose (fx Protein A til kanin IgG pull down og Protein G for mus IgG nedtræk)
• 3X SDS prøvebuffer: 187,5 mM Tris-HCI (pH 6,8 ved 25 ° C), 6% vægt / volumen SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% vægt / volumen bromphenolblåt

B. Fremstilling af cellelysater

• Høst cellerne. For at høste celler under nondenaturerende betingelser, fjern medierne og skyll cellerne en gang med iskold PBS.
• Fjern PBS og tilsæt 0,5 ml iskold 1X celle lysisbuffer til hver plade (10 cm) og inkubér pladerne på is i 5 minutter.
• Skrab celler ud af pladerne og overfør til mikrocentrifugerør. Hold på is.
• Sonikat to gange i 10 sekunder i iskold immunpræcipitationsbuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCI [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 og proteaseinhibitorblandingen). Til sonication, den VialTweeter eller en sonde ultralydator, såsom UP100H eller Uf200 ः t er mest egnede.
• Centrifuger lysaterne ved 15.000 g i 10 minutter ved 4 ° C.
• Overfør supernatanten til et nyt rør. (Om nødvendigt kan lysat opbevares ved -80 ° C.)
• Tilsæt det primære antistof til supernatanten. Supernatanten med det primære antistof inkuberes i 1 time ved 4 ° C under let omrøring. Primær antistof tilsættes typisk i en mængde 10x mere koncentreret end anvendt til western blotting. (Du kan starte med 1μg pr. 100μL.)
• Supernatanten inkuberes derefter yderligere med blandingen af ​​lige store mængder protein A-agarose (Invitrogen) og Protein G-agarose i yderligere 1 time.
• Vask agarosepellets tre gange med IP-buffer. Derefter ekstraheres de bundne proteiner med SDS-PAGE påfyldningsbufferen ved opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter.

C. Immunpræcipitation

• Tag 200 μl celle lysat og tilsæt primær antistof. Inkuber med mild rocking natten over ved 4 ° C.
• Tilsæt enten protein A eller G agarose perler (20 μl 50% perleopslæmning). Inkuber med mild rocking i 1-3 timer ved 4 ° C.
• Mikrocentrifuge i 30 sekunder ved 4 ° C. Vask pellet fem gange med 500 μl 1X celle lysis buffer. Opbevares på is under vask.
• Resuspender pelleten med 20 μl 3X SDS prøvebuffer. Vortex, derefter mikrocentrifuge i 30 sekunder.
• Opvarm prøven til 95-100 ° C i 2-5 minutter og mikrocentrifuge i 1 minut ved 14.000 X g.
• Indlæs prøven (15-30 μl) på SDS-PAGE gel (12-15%).
• Analysér prøve ved Western blotting.

Western Blot-analyse med ultralydator UP50H

Følgende protokol blev anvendt i studie af Kriebisch et al. (2011):
Total protein blev isoleret fra MC3T3-El-celler behandlet med 1,25 (OH)₂D₃ (10).^-8 M) eller køretøj. Celler blev lyseret med en buffer indeholdende 50 mM Tris HCI, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) og 0,5% natriumdeoxycholat (Merck). Cellelysatet blev sonikeret i 2 x 10 s ved cyklus 1 og amplitude 80 med UP50H ultralyds processor (Hielscher, Ultralydteknologi, Teltow, Tyskland). Derefter blev materialet centrifugeret i 10 minutter ved 14.000 omdr./min., Og supernatanten blev anvendt til Western blotting. Femogtyve μg protein blev kogt i prøvebuffer og reduktionsmiddel (Invitrogen) og efterfølgende adskilt ved SDS-PAGE ved anvendelse af 4-12% polyacrylamidgeler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran (GE-sundhedspleje). Membranen blev blokeret i 1 time med TBS (10 mM Tris-HCI, pH 7,6; 150 mM NaCl) indeholdende 1% casein (Sigma-Aldrich) og 1% Tris (1 M). Efter blokering blev membranen inkuberet med let omrøring natten over ved 4 ° C med det primære antistof (kanin anti-human CBS 1/500, udviklet i laboratoriet af Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med et peberrodsperoxidase (HPR) -konjugeret sekundært antistof (Dako) blev udført i 1 time ved stuetemperatur. Alle blots blev udviklet ved forøget kemiluminescens (Perkin Elmer).

Litteratur / Referencer