Ultralydslyse til Western blotting

• Western blot er en analytisk procedure til påvisning af specifikke proteiner i en prøve af vævshomogenat eller celleekstrakt.
• For at udføre et Western blot eller måle enzymaktivitet kræver mange assays adgang til de materialer (f.eks. proteiner, DNA, subcellulære fragmenter), der er indesluttet i cellen.
• Sonikering er en pålidelig og letanvendelig metode til kontrolleret celledisruption og lyse.

Celledisruption med ultralyd

Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er det første trin i mange biologiske, biokemiske og analytiske teknikker (PAGE, Western blotting, ELISA, massespektrometri osv.) eller i proteinoprensning. For at opnå et højt proteinudbytte skal cellematerialet og vævet effektivt disrupteres/ lyseres. Uanset om det drejer sig om planteceller eller animalsk væv, er sonikering metoden til nemt og hurtigt at fremstille dit cellelysat.

Fordele ved sonikering

• hurtig & effektiv
• nem betjening
• højt proteinudbytte
• reproducerbar/ gentagelig
• præcist kontrolleret
• skalerbar

Immunpræcipitationsprotokol til Western immunoblotting

A. Reagenser

Brug renset vand såsom Milli-Q til fremstilling af opløsningerne.

• 1X fosfatbufferet saltvand (PBS)
• 1X cellelysebuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Vigtigt: Tilsæt 1 mM PMSF umiddelbart før brug.
• 15 μl protein A+15 μl protein G er tilstrækkeligt til IP, men det kan afhænge af dit primære antistof og prøvevolumen. Du kan også bruge forblandet protein A/ G-agarose (f.eks. protein A til pull-down af kanin-IgG og protein G til pull-down af muse-IgG)
• 3X SDS-prøvebuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 ved 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenolblåt

B. Fremstilling af cellelysater

• Høst cellerne. For at høste celler under ikke-denaturerende betingelser skal du fjerne mediet og skylle cellerne én gang med iskold PBS.
• Fjern PBS, tilsæt 0,5 ml iskold 1X cellelysebuffer til hver plade (10 cm), og inkubér pladerne på is i 5 minutter.
• Skrab cellerne af pladerne, og overfør dem til mikrocentrifugerør. Hold dem på is.
• Sonikér to gange i 10 sekunder i iskold immunpræcipitationsbuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 og proteasehæmmerblandingen). Til sonikering er VialTweeter eller en ultralydssonikator med sonde såsom UP100H eller UP200Ht mest velegnede.
• Centrifugér lysaterne ved 15.000 g i 10 minutter ved 4°C.
• Overfør supernatanten til et nyt rør. (Om nødvendigt kan lysatet opbevares ved –80°C.)
• Tilsæt det primære antistof til supernatanten. Supernatanten med det primære antistof inkuberes i 1 h ved 4°C under let omrøring. Det primære antistof tilsættes typisk i en koncentration, der er 10x højere end den, der anvendes til Western blotting. (Du kan starte med 1μg pr. 100μL.)
• Supernatanten inkuberes derefter yderligere med blandingen af lige store mængder protein A-agarose (Invitrogen) og protein G-agarose i endnu 1 h.
• Vask agarosepellets tre gange med IP-buffer. Ekstrahér derefter de bundne proteiner med SDS-PAGE-påsætningsbufferen ved opvarmning ved 95°C i 5 minutter.

C. Immunpræcipitation

• Tag 200 μl cellelysat, og tilsæt primært antistof. Inkubér under forsigtig vipning natten over ved 4°C.
• Tilsæt enten protein A- eller protein G-agarosekugler (20 μl af en 50% kuglesuspension). Inkubér under forsigtig vipning i 1–3 timer ved 4°C.
• Mikrocentrifugér i 30 sekunder ved 4°C. Vask pelleten fem gange med 500 µl 1X cellelysebuffer. Hold den på is under vaskene.
• Resuspendér pelleten i 20 μl 3X SDS-prøvebuffer. Vortexbland, og mikrocentrifugér derefter i 30 sekunder.
• Opvarm prøven til 95–100°C i 2–5 minutter, og mikrocentrifugér i 1 minut ved 14.000 X g.
• Påsæt prøven (15–30 μl) på en SDS-PAGE-gel (12–15%).
• Analysér prøven ved Western blotting.

Western blot-analyse med sonikatoren UP50H

Følgende protokol med sonikatoren UP50H med sonde blev anvendt i studiet af Kriebisch et al. (2011):
Totalprotein blev isoleret fra MC3T3-E1-celler behandlet med 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) eller vehikel. Cellerne blev lyseret med en buffer indeholdende 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) og 0,5% natriumdeoxycholat (Merck). Cellelysatet blev sonikeret i 2 × 10 s ved cyklus 1 og amplitude 80 med ultralydsprocessoren UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Tyskland). Derefter blev materialet centrifugeret i 10 min ved 14.000 rpm, og supernatanten blev anvendt til Western blotting. Femogtyve μg protein blev kogt i prøvebuffer og reduktionsmiddel (Invitrogen) og efterfølgende separeret ved SDS-PAGE med 4–12% polyakrylamidgeler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran (GE health care). Membranen blev blokeret i 1 h med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) indeholdende 1% kasein (Sigma-Aldrich) og 1% Tris (1 M). Efter blokering blev membranen inkuberet under let omrøring natten over ved 4°C med det primære antistof (kanin-anti-human-CBS 1/500, udviklet i laboratoriet hos Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med et sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (HPR) (Dako) blev udført i 1 h ved stuetemperatur. Alle blots blev fremkaldt ved forstærket kemiluminescens (Perkin Elmer).
 

Klik her for at læse mere om bedste praksis for cellelyse og ekstraktion med ultralyd, fremstilling af lysater og anbefalinger til procesforbedringer!
 
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssonikatorer til laboratoriebrug:

Litteratur / Referencer

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.