Ultralydslyse til Western Blotting
- Western blot er en analytisk procedure til påvisning af specifikke proteiner i en prøve af vævshomogenat eller celleekstrakt.
- For at køre en Western blot eller for at måle enzymaktivitet kræver mange analyser adgang til materialerne (f.eks. proteiner, DNA, subcellulære fragmenter), der er fanget i cellen.
- Sonikering er en pålidelig og let at håndtere metode til kontrolleret celleforstyrrelse og lysis.
Ultralyd celle afbrydelse
Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er det første skridt for mange biologiske, biokemiske og analytiske teknikker (PAGE, Western blotting, ELISA, massespektrometri osv.) eller proteinoprensning. For at opnå et højt proteinudbytte skal cellematerialet og vævet effektivt forstyrres/lyseres. Uanset om det er plantecelle eller dyrevæv, er sonikering metoden til at forberede dit cellelysat let og hurtigt.
Fordele ved sonikering
- Hurtig & Effektiv
- Nem betjening
- højt proteinudbytte
- reproducerbar/repeterbar
- Præcist kontrolleret
- skalerbar

VialTweeter soniker til ultralydsprøveforberedelse såsom celleforstyrrelse og proteinisolering
Protokol for immunpræcipitation for Western Immunoblotting
A. Reagenser
Til fremstilling af opløsningerne skal du bruge renset vand såsom Milli-Q.
- 1X fosfatbufret saltvand (PBS)
- 1X cellelysebuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
Vigtigt: Tilsæt 1 mM PMSF umiddelbart før brug. - 15 μl Protein A+15 μl Protein G er tilstrækkeligt til IP, men det kan afhænge af dit primære antistof og prøvevolumen. Du kan også bruge færdigblandet protein A/G agarose (f.eks. Protein A til kanin IgG pull down og Protein G til mus IgG pull down)
- 3X SDS-prøvebuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 ved 25 °C), 6 % w/v SDS, 30 % glycerol, 150 mM DTT, 0,03 % w/v bromphenolblå
B. Fremstilling af cellelysater
- Høst cellerne. For at høste celler under ikke-denaturerende forhold skal du fjerne medier og skylle celler én gang med iskold PBS.
- Fjern PBS og tilsæt 0,5 ml iskold 1X cellelysebuffer til hver plade (10 cm) og inkuber pladerne på is i 5 minutter.
- Skrab celler af pladerne og overfør til mikrocentrifugerør. Hold på is.
- Soniker to gange i 10 sekunder i iskold immunudfældningsbuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 og proteasehæmmerblandingen). Til sonikering er VialTweeter eller en sonde ultralydsapparat som f.eks. UP100H eller UP200Ht er bedst egnede.
- Lysaterne centrifugeres ved 15.000 g i 10 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt rør. (Om nødvendigt kan lysat opbevares ved -80°C.)
- Tilsæt det primære antistof til supernatanten. Supernatanten med det primære antistof inkuberes i 1 time ved 4°C under let omrøring. Primært antistof tilsættes typisk i en mængde, der er 10 gange mere koncentreret end den, der bruges til western blotting. (Du kan starte med 1μg pr. 100μL.)
- Supernatanten inkuberes derefter yderligere med en blanding af lige store mængder protein A-agarose (Invitrogen) og protein G-agarose i yderligere 1 time.
- Vask agarosepillerne tre gange med IP-buffer. Derefter ekstraheres de bundne proteiner med SDS-PAGE-belastningsbufferen ved opvarmning ved 95°C i 5 minutter.
C. Immunudfældning
- Tag 200 μl cellelysat og tilsæt primært antistof. Inkuber med blid vuggning natten over ved 4°C.
- Tilsæt enten protein A- eller G-agaroseperler (20 μl 50% perleopslæmning). Inkuber med forsigtig vuggning i 1-3 timer ved 4°C.
- Mikrocentrifuge i 30 sekunder ved 4°C. Vask pellet fem gange med 500 μl 1X cellelysebuffer. Opbevares på is under vask.
- Opslæm pelleten med 20 μl 3X SDS-prøvebuffer. Vortex, og mikrocentrifuger derefter i 30 sekunder.
- Prøven opvarmes til 95-100 °C i 2-5 minutter og mikrocentrifugeres i 1 minut ved 14.000 X g.
- Læg prøven (15-30 μl) på SDS-PAGE-gel (12-15%).
- Analyser prøven ved Western blotting.
Western Blot-analyse med Sonicator UP50H
Følgende protokol ved hjælp af sonde-type sonde-soniker UP50H blev brugt i undersøgelse af Kriebisch et al. (2011):
Totalt protein blev isoleret fra MC3T3-E1-celler behandlet med 1,25(OH)2D3 (10−8 M) eller køretøj. Cellerne blev lyseret med en buffer indeholdende 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) og 0,5% natriumdeoxycholat (Merck). Cellelysatet blev sonikeret i 2 × 10 sekunder ved cyklus 1 og amplitude 80 med UP50H ultralydsprocessor (Hielscher, ultralydsteknologi, Teltow, Tyskland). Derefter blev materialet centrifugeret i 10 minutter ved 14.000 omdr./min., og supernatanten blev brugt til Western blotting. Femogtyve μg protein blev kogt i prøvebuffer og reduktionsmiddel (Invitrogen) og efterfølgende adskilt af SDS-PAGE ved hjælp af 4-12 % polyacrylamidgeler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran (GE sundhedspleje). Membranen blev blokeret i 1 time med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) indeholdende 1% kasein (Sigma-Aldrich) og 1% Tris (1 M). Efter blokering blev membranen inkuberet med let omrøring natten over ved 4°C med det primære antistof (kanin anti-human CBS 1/500, udviklet i laboratoriet hos Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med et peberrodsperoxidase (HPR)-konjugeret sekundært antistof (Dako) blev udført i 1 time ved stuetemperatur. Alle blots blev udviklet ved forbedret kemiluminescens (Perkin Elmer).
Klik her for at læse mere om bedste praksis for ultralydscellelyse og ekstraktion, lysatpræparation og anbefalinger til procesforbedringer!
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater i laboratoriestørrelse:
Anbefalede enheder | Batch volumen | Flowhastighed |
---|---|---|
UIP400MTP 96-brønds plade soniker | Multi-brønd / mikrotiterplader | n.a. |
Ultralyd CupHorn | CupHorn til hætteglas eller bægerglas | n.a. |
GDmini2 | ultralyd mikro-flow reaktor | n.a. |
VialTweeter | 0.5 til 1,5 ml | n.a. |
UP100H | 1 til 500 ml | 10 til 200 ml/min |
UP200Ht, UP200St | 10 til 1000 ml | 20 til 200 ml/min |
UP400St | 10 til 2000 ml | 20 til 400 ml/min |
Ultralyd sigte ryster | n.a. | n.a. |
Kontakt os! / Spørg os!

UIP400MTP plade sonicator til sonikering med høj kapacitet af 96-brønds plader
Om Western Blotting
Blots er analytiske procedurer, hvor DNA, RNA og proteiner overføres til en bærer, så de kan adskilles.
Det sydlige blot bruges til påvisning af DNA, det nordlige blot for RNA og det vestlige blot for proteiner.
Western blotting kaldes også protein immunoblotting, fordi et antistof bruges til specifikt at detektere dets antigen. Western Blotting er en af de vigtigste analysemetoder til at påvise specifikke proteiner i prøven. I Western blot immobiliseres proteinerne på membraner for at detektere dem ved hjælp af monoklonale eller polyklonale antistoffer.
Ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) adskilles native proteiner af 3D-struktur eller denaturerede proteiner af længden af polypeptidet. Proteinerne overføres derefter til en membran (typisk nitrocellulose eller PVDF), hvor de farves med antistoffer, der er specifikke for målproteinet. Gelelektroforesetrinnet er inkluderet i western blot-analyse for at løse problemet med krydsreaktivitet af antistoffer.
Derefter blottes de adskilte proteiner på en matrix (for det meste på en nitrocellulose- eller PVDF-membran), hvor de farves med antistoffer. Antistofferne fungerer som en sonde og udvælges specifikt til målproteinet. Analysen af placeringen og intensiteten af den specifikke reaktion afslører ekspressionsdetaljer for målproteinerne i den givne prøve. Western blotting kunne detektere målprotein, som er så lavt som 1ng på grund af høj opløsning af gelelektroforese og stærk specificitet og høj følsomhed af immunassayet. Western blot-metoden anvendes inden for molekylærbiologi, biokemi, immunogenetik og andre molekylære forskningsområder.
Andre relaterede teknikker omfatter dot blot-analyse, immunhistokemi og immuncytokemi, hvor antistoffer bruges til at detektere proteiner i væv og celler ved immunfarvning, og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
Litteratur / Referencer
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter soniker til samtidig prøveforberedelse af flere hætteglas