Ultralydsbaseret DNA-fragmentering ved forskydning

Ved fragmentering af DNA og RNA ved forskydning opdeles lange DNA-molekyler i mindre stykker, hvilket er et afgørende trin i klargøringen af prøver til opbygning af biblioteker til næste generations sekventering (NGS). Ultralydsbaseret DNA-fragmentering ved forskydning anvender akustiske kavitationskræfter til at bryde DNA eller RNA i fragmenter fra 100 bp til 5 kb. Denne metode muliggør præcis kontrol over fragmentstørrelsen, så den kan tilpasses den ønskede DNA-længde for at opnå optimale sekventeringsresultater.

DNA-fragmentering ved forskydning med ultralyd

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede løsninger til fragmentering af DNA, RNA og kromatin ved forskydning. Vælg en ultralydssonikator af sondetypen (f.eks. UP100H) til direkte sonikering med en mikrospids, eller brug VialTweeeter eller ultralyds-cuphorn til indirekte DNA-præparation af forskellige prøver samtidigt. Hielscher tilbyder det ideelle apparat til dine behov: Uanset om du har 1 eller op til 10 prøver med volumener fra mikroliter til liter, opfylder Hielschers sonikatorer dine krav til fremstilling af DNA-, RNA- og kromatinfragmenter med den rette længde. Reproducerbarhed, nem betjening og præcis kontrol muliggør et pålideligt bibliotek til næste generations sekventering.
I modsætning til enzymatisk DNA-fragmentering anvender ultralydsbaseret fragmentering ved forskydning rent mekaniske forskydningskræfter uden tilsætning af kemikalier. Ved præcis indstilling af procesparametrene producerer ultralydsbaseret fragmentering ved forskydning DNA-fragmenter med høj molekylvægt (plasmid-DNA og genomisk DNA).
Oprensede nukleinsyrer kan amplificeres før eller efter et fragmenteringstrin.
Sonikeringsparametre (effekt, pulscyklus / pulsserier, tid og temperatur) kan styres sikkert via softwareindstillinger.

Protokoller til ultralydsbaseret DNA-fragmentering ved forskydning

Til kromatinimmunpræcipitationsanalyse

Kort beskrevet blev cellerne udsået i skåle med en diameter på 60mm (400.000 pr. skål) og transfekteret med RhoA siRNA (som beskrevet); efter 72 h blev de inkuberet med formaldehyd (slutkoncentration, 1%) i 10 min ved 37°C for at krydsbinde proteiner til DNA. Krydsbindingsreaktionen blev standset ved tilsætning af en tiendedel volumen 1,25 mol/L glycin, hvilket gav en slutkoncentration på 125 mmol/L. Cellerne blev vasket to gange med iskold PBS, resuspenderet i buffer til radioimmunpræcipitationsanalyse [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] indeholdende 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL aprotinin og 1 Ag/mL pepstatin A og holdt på is i 30 min. Derefter blev cellelysaterne sonikeret på is med en Hielscher UP200S ultralydssonikator (3 x 40 s, amplitude 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), indtil det krydsbundne kromatin var fragmenteret ved forskydning til DNA-fragmenter på mellem 200 og 1.000 bp. En tiendedel af det samlede lysat blev anvendt til at kvantificere mængden af DNA i forskellige prøver og betragtet som “samlet input-DNA”. Supernatanterne blev inkuberet med en 50% suspension af laksesæds-DNA/proteinagarose for at reducere uspecifik baggrund. Immunpræcipitation blev derefter udført natten over ved 4°C med 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) eller uden antistof (negativ kontrol). Disse supernatanter blev tilsat 5 mol/L NaCl og opvarmet natten over ved 65°C for at ophæve protein-DNA-krydsbindingerne. Immunkomplekserne blev yderligere behandlet med DNase- og RNase-fri proteinase K, og DNA blev oprenset ved phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. PCR blev udført med specifikke primere svarende til en sekvens i promotorregionen af det humane iNOS-gen (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Undersøgelser af EGFP-ekspression

Til ekspressionsundersøgelser blev den rekombinante stamme L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Tyskland), med genet for EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) integreret i det kromosomale ssu-locus, dyrket i de forskellige medier som tidligere beskrevet og yderligere suppleret med 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under dyrkningen blev der udtaget prøver på 1 ml, som blev centrifugeret (2000 × g, 20°C, 10 min) og vasket med 0,9% NaCl-opløsning. Pelleten blev resuspenderet i buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) og disintegreret ved sonikering med ultralydsprocessoren UP400S (tilført energi ∼ 400 Ws). Cellerester blev fjernet ved centrifugering (6000 × g, 4°C, 5 min) og analyseret ved natriumdodecylsulfat–polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under reducerende betingelser efter Laemmlis metode (1970) med 12,5% polyakrylamidgeler. EGFP-ekspression blev undersøgt i kultur under omrystning. (Fritsche et al. 2007)

Kromatinimmunpræcipitation

Kromatinimmunpræcipitationsanalysen blev udført med ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) i henhold til producentens anvisninger med enkelte ændringer. Kort beskrevet blev differentierede humane podocytter krydsbundet med 1% formaldehyd i 10 min ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket med iskold PBS, og fikseringsreaktionen blev standset ved tilsætning af 0,125 M glycin i 5 min ved stuetemperatur. Cellerne blev igen vasket med iskold PBS og skrabet af skålen. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i lysebufferen. Efter centrifugering blev de pelleterede cellekerner resuspenderet i fragmenteringsbufferen og inkuberet på is i 30 min, og kromatinet blev fragmenteret ved forskydning gennem sonikering, f.eks. med UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) ved 25% effekt med 5 pulser på hver 20 sec på is til fragmenter på ca. 200–600 bp. Det fragmenterede kromatin blev derefter centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet. Til immunpræcipitationerne blev 60 μl kromatin inkuberet med 1 μg antistoffer mod Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Storbritannien) eller NF-κB p50 (Abcam) eller med kanin-IgG (Zymed Laboratories) som negativ kontrol natten over ved 4°C under forsigtig rotation. Immunkomplekser bundet til magnetiske kugler blev opsamlet ved hjælp af et magnetstativ og vasket grundigt, hvorefter protein/DNA-krydsbindingerne blev ophævet, og DNA blev elueret til realtids-PCR-analyse. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-præparation til chiparrayanalyse

Klargøring af cellelysater og ekstraheret DNA
Bakteriepellets suspenderet i PBS til den ønskede slutkoncentration blev behandlet med ultralydsdisintegratoren UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) udstyret med en mikrospids MS1 (1mm i diameter). Driftsfrekvensen var 30 kHz, og den effektive udgangseffekt var 100 W. Under behandlingen blev prøverne afkølet i et is-vandbad, blandet og centrifugeret. Prøverne blev anvendt til flowcytometriske undersøgelser, mens prøver til senere håndtering blev varmebehandlet (95°C, 5 min). De rå cellelysater blev behandlet med en blanding af phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Et lige så stort volumen af denne blanding blev tilsat lysatprøven, opløsningen blev vortexblandet kraftigt i 15 s og centrifugeret ved 15.000 x g i 2 min ved stuetemperatur (RT) på omkring 22°C. Den øverste vandige fase, som indeholdt det genomiske DNA, blev forsigtigt separeret og opsamlet i et nyt sterilt Eppendorf-rør.
Derefter blev prøverne sonikeret for at fragmentere DNA’et. Sonikeringstrinnet blev udført under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. For at vurdere fragmenteringens virkninger på det genomiske DNA blev prøverne analyseret ved agarosegelelektroforese.
(…) De prøver, der tidligere var blevet sonikeret i 2,5 min, gennemgik et ekstraktionstrin efter varmebehandling og centrifugering. Det frigivne DNA blev ekstraheret to gange med en blanding af phenol:chloroform:isoamylalkohol og derefter sonikeret endnu en gang i 0 – 15 min. Agarosegelelektroforese blev anvendt til at bestemme størrelsesfordelingen af DNA udsat for ultralydsfragmentering efter ekstraktion (fig. øverst til højre). Stærkt fragmenteret DNA kunne konstateres ved tilstedeværelsen af et DNA-smear frem for bånd med høj molekylvægt, som var elimineret fra prøver sonikeret i 2,5 min eller længere. Længere sonikering reducerede gradvist fragmentlængderne til ca. 150 – 600 bp, og sonikering i 15 min nedbrød disse fragmenter yderligere, hvilket især kan ses i den øverste del af smearet. Den gennemsnitlige DNA-fragmentstørrelse faldt således gradvist med ultralydsbehandlingstiden, og behandlingen på 5 min gjorde det muligt at opnå de DNA-fragmentstørrelser, der var bedst egnede til chiparrayanalyser. Til sidst blev der fastlagt en procedure til klargøring af DNA-analytten bestående af først 2 min ultralydsbehandling, DNA-ekstraktion (2×) og efterfølgende 5 min sonikering. (Basselet et al. 2008)

Kromatinimmunpræcipitation (ChIP)

HEK293-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og fikseret med 2 mM disuccinimidylglutarat i 45 min ved stuetemperatur. Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS. Kromatin blev krydsbundet i 10 min ved stuetemperatur med 1% (v/v) formaldehyd og vasket to gange med iskold PBS. Krydsbindingsreaktionen blev standset ved inkubation med glycin i en slutkoncentration på 0,125 M i 5 min ved stuetemperatur. Efter inkubation med trypsin blev cellerne skrabet af celledyrkningsskålen og vasket to gange med PBS. Cellepelleten blev resuspenderet i lysebuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl og 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuberet på is i 10 min og homogeniseret med en Dounce-homogenisator. Derefter blev cellekernerne pelleteret ved centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 °C) og resuspenderet i kernebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA og 1% (w/v) SDS). Cellekernerne blev disintegreret ved sonikering med tre pulser på 20 s i en UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) med indstillingerne cyklus 0,5 og amplitude 30%, hvilket gav genomiske DNA-fragmenter med en overvejende størrelse på 200 – 1000 bp. Til ChIP blev 50g DNA fortyndet 4 gange i immunpræcipitationsbuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 og 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analyse af histonmodifikationer ved kromatinimmunpræcipitation (ChIP)

Kort beskrevet blev 6 x 10⁶ celler vasket to gange med PBS og krydsbundet på dyrkningspladen i 15 min ved stuetemperatur i nærvær af 0,5% formaldehyd. Krydsbindingsreaktionen blev standset ved tilsætning af 0,125 M glycin. Alle efterfølgende trin blev udført ved 48°C. Alle buffere var afkølet på forhånd og indeholdt proteasehæmmere (Complete Mini, Roche). Cellerne blev vasket to gange med PBS og derefter skrabet af. De opsamlede pellets blev opløst i 1 ml lysebuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) og sonikeret i et koldt ethanolbad i 10 cyklusser ved 100% amplitude med en UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatinfragmentering blev visualiseret i 1% agarosegel. De opnåede fragmenter lå i intervallet 200–500pb. Opløseligt kromatin blev opnået ved centrifugering af de sonikerede prøver ved 14.000g i 10 min ved 48°C. Den opløselige fraktion blev fortyndet 1/10 i fortyndingsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), derefter fordelt i aliquoter og opbevaret ved 80°C indtil brug. (Rodriguez et al. 2008)