Ultralyd DNA-klipning

Under DNA- og RNA-klipning fragmenteres lange DNA-molekyler i mindre stykker, et afgørende skridt i forberedelsen af prøver til næste generations sekventeringsbibliotekskonstruktion (NGS). Ultralyd DNA-klipning anvender akustiske kavitationskræfter til at bryde DNA eller RNA i fragmenter fra 100 bp til 5 kb. Denne metode muliggør præcis kontrol over fragmentstørrelsen, hvilket letter tilpasning til den ønskede DNA-længde for optimale sekventeringsresultater.

DNA-klipning ved hjælp af ultralydbehandling

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede løsninger til DNA-, RNA- og kromatinklipning. Vælg mellem en sonde-type ultralydapparater (f.eks. UP100H) til direkte sonikering ved hjælp af en mikrotip, eller brug VialTweeeter eller ultralyd cuphorn til indirekte DNA-forberedelse af forskellige prøver samtidigt. Hielscher tilbyder den ideelle enhed i forhold til dine behov: uanset om du har 1 eller op til 10 prøver, volumener fra mikroliter til liter volumener – Hielscher sonikere opfylder dine krav til at forberede DNA-, RNA- og kromatinfragmenter i den rigtige længde. Reproducerbarhed, nem betjening og præcis kontrol giver mulighed for et pålideligt bibliotek til næste generations sekventering.
I modsætning til enzymatisk DNA-fragmentering anvender ultralydsklipning rene mekaniske forskydningskræfter uden at tilføje kemikalier. Ved den præcise indstilling af procesparametre producerer ultralydsforskydning DNA-fragmenter med høj molekylvægt (plasmid og genomisk DNA).
Oprensede nukleinsyrer kan amplificeres før eller efter et fragmenteringstrin.
Sonikeringsparametre (effekt, pulscyklus? bursts, tid og temperatur) kan styres sikkert via softwareindstillinger.

Protokoller til ultralyd DNA-klipning

Til kromatinimmunpræcipitationsanalyse

Kort fortalt blev celler belagt i skåle med en diameter på 60 mm (400.000 pr. skål) og transfekteret med RhoA siRNA (som beskrevet); efter 72 timer blev de inkuberet med formaldehyd (slutkoncentration, 1%) i 10 minutter ved 37°C for at krydsbinde proteiner til DNA. Tværbindingsreaktionen blev slukket ved tilsætning af en tiendedel volumen af 1,25 mol/L glycin, hvilket gav 125 mmol/L slutkoncentration. Celler blev vasket to gange med iskold PBS, resuspenderet i radioimmunopræcipitationsanalysebuffer [150 mmol/L NaCl, 1 % NP40, 0,5 % deoxycholat, 0,1 % SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] indeholdende 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/ml aprotinin og 1 Ag/ml pepstatin A og holdt på is i 30 minutter. Derefter blev cellelysater sonikeret på is med en Hielscher UP200S ultralydsapparat (3 x 40 s, amplitude 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), indtil tværbundne kromatiner blev klippet for at give DNA-fragmenter mellem 200 og 1.000 bp. En tiendedel af hele lysatet blev brugt til at kvantificere mængden af DNA til stede i forskellige prøver og betragtet som “samlet input DNA”. Supernatanter blev inkuberet med laksesæd-DNA/proteinagarose-50% gylle for at reducere uspecifik baggrund. Immunudfældning blev derefter udført natten over ved 4°C med 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) eller uden antistof (negativ kontrol). Disse supernatanter blev suppleret med 5 mol/L NaCl og opvarmet natten over ved 65°C for at tilbageføre protein-DNA-tværbindinger. Immunkomplekserne blev yderligere behandlet med DNase- og RNase-fri proteinase K, og DNA blev oprenset ved phenol/chloroform-ekstraktion og ethanoludfældning. PCR blev udført med specifikke primere svarende til en sekvens inden for promotorregionen af det humane iNOS-gen (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Undersøgelser af EGFP-ekspression

Til ekspressionsundersøgelser blev den rekombinante stamme L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genet for EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosomal ssu integreret, dyrket i de forskellige medier som beskrevet tidligere og yderligere suppleret med 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under dyrkningen blev der taget 1 ml prøver, centrifugeret (2000 × g, 20°C, 10 min) og vasket med 0,9% NaCl-opløsning. Pellet blev resuspenderet i buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) og opløst ved sonificering med ultralydsprocessoren UP400S (anvendelse af energi ∼ 400 Ws). Celleaffald blev fjernet ved centrifugering (6000 × g, 4°C, 5 min) og analyseret ved natriumdodecylsulfat – polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under reducerende forhold i henhold til metoden fra Laemmli (1970) med 12,5 % polyakralamidgeler. EGFP-ekspression blev undersøgt i agiteret kultur. (Fritsche et al. 2007)

kromatin immunpræcipitation

Kromatinimmunudfældningsanalysen blev udført ved hjælp af ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) ved 25 % effekt 5 impulser på 20 sek. hver på is i fragmenter på ca. 200-600 bp. Den afklippede kromatin blev derefter centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet. For immunpræcipitationer blev 60 μl kromatin inkuberet med 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-KB p50 (Abcam) antistoffer eller med kanin IgG (Zymed Laboratories), som en negativ kontrol, natten over ved 4°C med blid rotation. Immunkomplekser bundet til magnetiske perler blev indsamlet ved hjælp af et magnetisk stativ, vasket grundigt, og protein/DNA-tværbindingerne blev vendt og DNA elueret til realtids-PCR-analyse. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA-forberedelse til chip array-analyse

Arrangement af cellelysater og ekstraherede DNA'er
Bakteriepiller suspenderet i PBS til den ønskede endelige koncentration blev behandlet med ultralydsforstyrrer UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) udstyret med en microtip MS1 (1 mm i diameter). Driftsfrekvensen var 30 kHz og den effektive udgangseffekt var 100 W. Under operationen blev prøverne afkølet i et isvandsbad, blandet og centrifugeret. Prøverne blev brugt til flowcytometriundersøgelser, mens prøverne til senere håndtering blev udsat for en varmebehandling (95°C, 5 min). Råcellelysaterne blev behandlet med en blanding af phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Et lige stort volumen af denne blanding blev tilsat lysatprøven, opløsningen blev hvirvlet kraftigt i 15 sekunder og centrifugeret ved 15.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur (RT) omkring 22 °C. Den øverste vandige fase, der indeholdt det genomiske DNA, blev omhyggeligt adskilt og indsamlet i et nyt sterilt Eppendorf-rør.
Efterfølgende blev prøver sonikeret for at fragmentere DNA'et. Sonikeringstrinnet blev realiseret under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. For at evaluere fragmenteringseffekterne på det genomiske DNA blev prøver analyseret ved hjælp af agarosegelelektroforese.
(…) Prøverne sonikeret tidligere i 2,5 minutter blev udsat for et ekstraktionstrin efter varmebehandling og centrifugering. DNA frigivet blev ekstraheret to gange med en phenol: chloroform: isoamylalkoholblanding og derefter udsat for anden sonikering i 0 - 15 minutter. Agarosegelelektroforese blev brugt til at bestemme størrelsesfordelingen af DNA udsat for ultralydsfragmentering efter ekstraktion (fig. øverst til højre). Meget fragmenteret DNA var tydeligt fra tilstedeværelsen af en DNA-udstrygning snarere end højmolekylvægtsbånd, der blev elimineret fra prøver sonikeret i 2,5 minutter eller længere. Længere sonikering reducerede gradvist fragmentlængderne til ca. 150 - 600 bp, og sonikering i 15 minutter nedbrød disse fragmenter yderligere, som det for det meste kan ses af den øverste del af udstrygningen. Således faldt den gennemsnitlige DNA-fragmentstørrelse gradvist med ultralydbehandlingstid, og 5 minutters behandling gjorde det muligt at opnå de størrelser af DNA-fragmenter, der er bedst egnede til chip array-analyser. Endelig blev DNA-analytforberedelsesproceduren, der omfatter de første 2 minutters ultralydsbehandling, DNA-ekstraktion (2×) og efterfølgende 5 minutters sonikering, etableret. (Basselet et al. 2008)

Kromatin immunpræcipitation (ChIP)

HEK293-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og fikseret med 2 mM disuccinimidyl-glutarat i 45 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev cellerne vasket to gange med PBS. Kromatin blev tværbundet i 10 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af 1% (v/v) formaldehyd og vasket to gange med iskold PBS. Tværbindingsreaktionen blev stoppet ved inkubation med glycin i en slutkoncentration på 0,125 M i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation med trypsin blev cellerne skrabet fra cellekulturskålen og vasket to gange med PBS. Cellepelleten blev resuspenderet i lysisbuffer (5 mM rør, pH 8,0, 85 mM KCl og 0,5 % (v/v) Nonidet P-40), inkuberet på is i 10 minutter og homogeniseret med en Dounce-homogenisator. Efterfølgende blev kerner pelleteret ved centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 °C) og resuspenderet i kernebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA og 1% (w/v) SDS). Kerner blev forstyrret af sonikering med tre 20-s impulser i en UP50H soniker (Hielscher Ultraschall Technologie) ved en indstilling af cyklus 0,5 og amplitude 30 %, hvilket giver genomiske DNA-fragmenter med en bulkstørrelse på 200 – 1000 bp. For ChIP blev 50 g DNA fortyndet 4 gange i immunpræcipitationsbuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 og 0,01 % (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonmodifikationsanalyse ved kromatinimmunudfældning (ChIP)

Kort sagt, 6 x 10⁶ celler blev vasket to gange med PBS og tværbundet på dyrkningspladen i 15 minutter ved stuetemperatur i nærvær af 0,5 % formaldehyd. Tværbindingsreaktionen blev stoppet ved tilsætning af 0,125 M glycin. Alle efterfølgende trin blev udført ved 48°C. Alle buffere var forkølet og indeholdt proteasehæmmere (Complete Mini, Roche). Celler blev vasket to gange med PBS og derefter skrabet. Indsamlede pellets blev opløst i 1 ml lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) og blev sonikeret i et koldt ethanolbad i 10 cyklusser ved 100% amplitude ved hjælp af en UP50H soniker (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatinfragmentering blev visualiseret i 1% agarosegel. De opnåede fragmenter var i intervallet 200-500pb. Opløseligt kromatin blev opnået ved centrifugering af de sonikerede prøver ved 14.000 g i 10 minutter ved 48 °C. Den opløselige fraktion blev fortyndet 1/10 i fortyndingsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) derefter alikvoteret og opbevaret ved 80°C indtil brug. (Rodriguez et al. 2008)