• Under DNA- og RNA-klipning brydes DNA-molekyler i mindre stykker. DNA / RNA fragmentering er en af de vigtige prøve prep trin, der kræves for at skabe biblioteker til næste generation sekventering (NGS).
• Ultrasonic DNA klipning bruger kræfter akustisk kavitation at bryde DNA eller RNA i stykker på 100 – 5 kb bp.
• Ultrasonic forskydning giver præcis DNA-fragmentering og tilpasning til den ønskede DNA længde.

DNA-klipning ved hjælp af ultralydbehandling

Hielscher Ultralyd tilbyder forskellige ultralyd-baserede løsninger til DNA, RNA og chromatin klipning. Vælge mellem et probe-type ultrasonicators (fx UP100H) til direkte lydbehandling ved anvendelse af en mikrospids eller bruge VialTweeeter eller den ultrasoniske cuphorn til indirekte DNA-fremstilling af forskellige prøver samtidigt. Hielscher tilbyder den ideelle enhed overvejer dine behov: vejr du har en eller op til 10 prøver, mængder fra mikroliter til liters volumen – Hielscher ultralyds-processorer er tilgængelige til at opfylde dine krav til at forberede DNA, RNA og kromatin fragmenter på det rigtige længde. Reproducerbarhed, nem betjening og præcis styring giver mulighed for en pålidelig bibliotek til næste-generations sekventering.
I modsætning til enzymatisk DNA-fragmentering, ultralyd klipning anvender rene mekaniske forskydningskræfter uden at tilføje nogen kemikalier. Ved præcis indstilling af procesparametre, ultralyd klipning producerer højmolekylære DNA-fragmenter (plasmid og genomisk DNA).
Oprensede nukleinsyrer kan amplificeres før eller efter en fragmentering trin.
Lydbehandling parametre (strøm, puls cyklus / burst, tid og temperatur) kan styres sikkert via software-indstillinger.

Protokoller for Ultrasonic DNA Shearing

For Kromatin immunpræcipitationsassay

Kort sagt blev celler pletteret i 60 mm diameter skåle (400.000 pr. Skål) og transficeret med RhoA siRNA (som beskrevet); Efter 72 timer blev de inkuberet med formaldehyd (slutkoncentration, 1%) i 10 minutter ved 37 ° C til tværbindingsproteiner til DNA. Tværbindingsreaktionen blev standset ved tilsætning af en tiendedel mængde 1,25 mol / l glycin, hvilket gav 125 mmol / l slutkoncentration. Celler blev vasket to gange med iskold PBS, resuspenderet i radioimmunoprecipitationsassaybuffer [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCI )] indeholdende 1 mmol / 1 phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag / ml aprotinin og 1 Ag / ml pepstatin A og holdt på is i 30 minutter. Derefter blev cellelysater sonikeret på is med a Hielscher UP200S ultralyd sonikator (3 x 40 s, amplitude 40%, cyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), indtil tværbundne chromatins blev forskudt til opnåelse af DNA-fragmenter mellem 200 og 1.000 bp. En tiendedel af hele lysat blev anvendt til at kvantificere mængden af ​​tilstedeværende DNA i forskellige prøver og betragtes som “samlede input DNA”. Supernatanter blev inkuberet med laksesperma-DNA / protein-agarose-50% opslæmning for at reducere ikke-specifik baggrund. Immunpræcipitation blev derefter udført natten over ved 4 ° C med 5 Ag af anti-NF-nB p65 (Upstate) eller uden antistof (negativ kontrol). Disse supernatanter blev suppleret med 5 mol / l NaCl og opvarmet natten over ved 65 ° C for at vende tilbage protein-DNA-tværbindinger. Immunkomplekserne blev yderligere behandlet med DNase- og RNase-frit proteinase K, og DNA blev oprenset ved phenol / chloroformekstraktion og ethanolfældning. PCR blev udført med specifikke primere svarende til en sekvens i promotorregionen af ​​det humane iNOS-genet (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ekspressionsundersøgelser

Til ekspressionsundersøgelser, den rekombinante stamme L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genet for EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein), SSU-kromosomale integrerede, blev dyrket i de forskellige medier som tidligere beskrevet og desuden suppleret med 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under dyrkning blev 1 ml prøver udtaget, centrifugeret (2000 x g, 20 ° C, 10 min) og vasket med 0,9% NaCl-opløsning. Pellet blev resuspenderet i buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) og nedbrudt af lydbehandling med ultralyd-processor UP400S (Anvendelse af energi ~ 400 Ws). Cellerester blev fjernet ved centrifugering (6000 x g, 4 ° C, 5 min) og analyseret ved natriumdodecylsulfat - polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) under reducerende betingelser ifølge fremgangsmåden af ​​Laemmli (1970) med 12,5% polyacralamide geler . EGFP-ekspression blev undersøgt i bevæget kultur. (Fritsche et al. 2007)

kromatin immunofældning

Chromatin immunoprecipitation assay blev udført under anvendelse af chip-IT^Tm Express (Aktiv Motif, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger med nogle ændringer. Kort fortalt differentierede humane podocytter blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket med iskold PBS, og fiksering reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 0,125 M glycin i 5 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket igen med iskoldt PBS og skrabet fra skålen. Celler blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i lysisbuffer. Efter centrifugering blev pelleteret kerner resuspenderet i klipning puffer, inkuberet på is i 30 minutter, og chromatin blev klippet ved sonikering, fx UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) ved 25% power 5 pulser på 20 sek hver på is i fragmenter på ca. 200-600 bp. Det forskydede chromatin blev derefter centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet. Til immunpræcipitation blev 60 μl kromatin inkuberet med 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-KB p65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-KB p50 (Abcam) antistoffer eller med kanin IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) som en negativ kontrol natten over ved 4 ° C med forsigtig rotation. Immunokomplekser bundet til magnetiske perler blev opsamlet under anvendelse af et magnetisk stativ, vasket omfattende, og protein / DNA-tværbindingerne blev omvendt og DNA elueret til realtids PCR-analyse. (Ristola et al., 2009)

EHEC DNA-præparat til chip array analyse

Arrangement af cellelysater og ekstraheret DNA'er
Bakterielle pellets suspenderet i PBS til den ønskede slutkoncentration blev behandlet med ultralyd disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) udstyret med en mikrotip MS1 (1 mm i diameter). Driftsfrekvensen var 30 kHz, og effektiv udgangseffekt var 100 W. Under operationen blev prøver afkølet i et isvandbad, blandet og centrifugeret. Prøverne blev anvendt til flowcytometriundersøgelser, mens prøver til senere behandling blev underkastet en varmebehandling (95 ° C, 5 minutter). De råcellelysater blev behandlet med en blanding af phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1). Et lige stort volumen af ​​denne blanding blev tilsat til lysatprøven, opløsningen blev vortexet kraftigt i 15 s og centrifugeret ved 15.000 xg i 2 minutter ved stuetemperatur (RT) omkring 22 ° C. Den øverste vandige fase indeholdende det genomiske DNA blev forsigtigt adskilt og opsamlet i et nyt sterilt Eppendorf-rør.
Efterfølgende blev prøver sonicated til fragmentering af DNA'et. Sonikeringstrinnet blev realiseret under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. For at evaluere fragmenteringseffekterne på det genomiske DNA blev prøver analyseret ved anvendelse af agarosegelelektroforese.
(…) Prøverne sonikeret tidligere i 2,5 minutter blev underkastet et ekstraktionstrin efter varmebehandling og centrifugering. Udgivet DNA blev ekstraheret to gange med en phenol: chloroform: isoamylalkoholblanding og efterfølgende udsat for anden sonikering i 0-15 min. Agarosegelelektroforese blev anvendt til at bestemme størrelsesfordelingen af ​​DNA udsat for ultralydfragmentering efter ultralyd (Fig. Øverst til højre). Meget fragmenteret DNA var tydeligt fra tilstedeværelsen af ​​et DNA-smear frem for bånd med højmolekylvægt, der blev elimineret fra prøver soniceret i 2,5 minutter eller længere. Længere sonikering reducerede gradvist fragmentlængder til ca. 150-600 bp, og sonikering i 15 min forringede yderligere disse fragmenter, som det ses mest ved smørets overdel. Således faldt den gennemsnitlige DNA-fragmentstørrelse gradvis med ultralydetid, og 5 min-behandlingen fik lov til at opnå størrelserne af DNA-fragmenter, som var mest egnede til chip array-analyser. Til sidst blev DNA-analysepræparationsproceduren omfattende første 2 min ultralydbehandling, DNA-ekstraktion (2 x) og efterfølgende 5 minutters sonikering etableret. (Basselet et al., 2008)

Kromatin Immunpræcipitation (chip)

HEK293-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og fikseret med 2 mM disuccinimidylglutarat i 45 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes cellerne to gange med PBS. Chromatin blev tværbundet i 10 minutter ved stuetemperatur ved anvendelse af 1% (vol / vol) formaldehyd og vasket to gange med iskold PBS. Tværbindingsreaktionen blev stoppet ved inkubering med glycin ved en slutkoncentration på 0,125 M i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation med trypsin blev cellerne skrabet fra cellekulturskålen og vasket to gange med PBS. Cellepellet blev resuspenderet i lysisbuffer (5 mM rør, pH 8,0, 85 mM KCI og 0,5% (vol / vol) Nonidet P-40) inkuberet på is i 10 minutter og homogeniseret med en Dounce-homogenisator. Efterfølgende blev kernerne pelleteret ved centrifugering (3500 xg, 5 minutter, 4 ° C) og resuspenderet i nukleibuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 10 mM EDTA og 1% (vægt / volumen) SDS). Nuklear blev forstyrret af sonikering med tre 20 s pulser i a UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) ved en indstilling på cyklus 0,5 og amplitude 30%, hvilket gav genomiske DNA fragmenter med en bulk størrelse på 200 - 1000 bp. For chip, blev 50 g af DNA fortyndet 4 gange i immunpræcipiteringsbuffer (16,7 mM Tris-HCI, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (volumen / volumen) Triton X-100 og 0,01% (vægt / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histon modifikation analyse ved chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Kort fortalt, 6 x 10⁶ Cellerne blev vasket to gange med PBS og tværbundet på dyrkningspladen i 15 minutter ved stuetemperatur i nærvær af 0,5% formaldehyd. Tværbinding reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 0,125 M glycin. Alle efterfølgende trin blev udført ved 48 ° C. Alle puffere blev for-kølet og indeholdt proteaseinhibitorer (Complete Mini, Roche). Celler blev vasket to gange med PBS og derefter skrabet. Indsamlede pellets blev opløst i 1 ml lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) og blev sonikeret i et koldt ethanolbad i 10 cyklusser ved 100% amplitude bruger UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatin fragmentering blev visualiseret i 1% agarosegel. Opnåede fragmenter var i 200-500pb interval. Opløseligt kromatin blev opnået ved centrifugering af sonikerede prøver ved 14.000 i 10 min ved 48 ° C. Den opløselige fraktion blev fortyndet 1/10 i fortyndingsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) og derefter opdelt i portioner og opbevaret ved 80 ° C indtil anvendelse. (Rodriguez et al. 2008)