Plasmidforberedelse ved hjælp af ultralydbehandling

Ultralydbehandling er en pålidelig teknik til at fragmentere plasmid-DNA. Præcist kontrollerbar amplitude, pulseringstilstand og temperaturkontrol er de vigtigste funktioner i en ultralydsapparat til ikke-skadelig plasmidfragmentering. Derudover hjælper brugen af visse midler med at beskytte mod plasmidnedbrydning. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til kontrolleret plasmidfragmentering fra enkelte hætteglas, samtidig sonikering af adskillige prøver såvel som plader med flere brønde. Lær mere om vellykket ultralydsplasmidfragmentering!

Plasmidklipning ved hjælp af ultralydbehandling

Når DNA-prøver udsættes for ultralydsbølger, skaber de ultralydsgenererede vibrationer akustisk kavitation i væsken, der skærer eller bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt via mekaniske kræfter. Sonikering er den mest udbredte metode til bulk DNA-forskydningseksperimenter, herunder applikationer, såsom kromatinimmunudfældning (ChIP), for hvilke små fragmentstørrelser er helt afgørende for at opnå høj opløsning. (jf. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) er en specifik form for DNA, der er kendetegnet ved sin ringform og findes i bakterier og nogle eukaryoter.
Supercoiled pDNA er den ønskede form for plasmid-DNA, da det viser de bedste resultater i down-stream-processer såsom automatiseret sekventering og transfektion. Ultralydbehandling er velegnet til at fragmentere pDNA, herunder supercoiled pDNA, med succes.
Thompson et al. (2008) viste, at plasmidsonikering, som er kendt for at fragmentere supercoiled DNA, er en effektiv måde at forbedre sekvens phred20 læselængder til det punkt, at de ikke adskiller sig signifikant fra Beckman Coulters kontrolskabelon eller enzymatisk lineariserede plasmider.

brug af plasmid Vektorer

Plasmider bruges ofte som værktøjer til at klone, overføre og manipulere gener. Når plasmider bruges eksperimentelt til disse formål, kaldes de vektorer. DNA-fragmenter eller gener kan indsættes i en plasmidvektor, hvilket skaber et såkaldt rekombinant plasmid. Plasmidvektorer bruges som bærere til at drive rekombinant DNA ind i en værtscelle og er en nøglekomponent i molekylær kloning.
“Ikke-virale vektorer undersøges grundigt for deres potentielle anvendelse i genterapi til behandling af forskellige komplicerede sygdomme. Ikke-virale vektorer beskytter plasmid-DNA mod fysisk, kemisk og enzymatisk nedbrydning og leverer DNA-molekylet til målstedet. For eksempel danner kationiske liposomer, chitosan og andre positivt ladede nanopartikler komplekser med plasmid-DNA gennem elektrostatiske interaktioner. Imidlertid er de let dannede kationiske liposomer/plasmid-DNA-komplekser relativt store (dvs. 300-400 nm) og heterogene i naturen, hvilket gør dem vanskelige at bruge i farmaceutiske applikationer. De store og heterogene plasmid-DNA / liposomer, plasmid-DNA / aerosoler og plasmid-DNA / peptidkomplekser kan reduceres til mindre og homogene partikler ved hjælp af ultralydbehandling.” (Sarker et al., 2019)
Et fremtrædende eksempel på brugen af plasmidvektorer er CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9-systemet leveres typisk til celler som et enkelt stort plasmid eller flere mindre plasmider, der koder for en målsekvens, en CRISPR-guide og Cas9.

Ultralydsforberedelse af DNA-belastede PLGA-nanopartikler ved nanoudfældning

Jo et al. (2020) brugte poly(mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) for at danne en nanopartikelbærer til levering af et model CRISPR-Cas9-plasmid til primære knoglemarvsafledte makrofager. Til nanoudfældning af PLGA-nanopartikler blev PLGA med to forskellige slutgrupper (ester- og amingrupper) brugt med det formål, at de positivt ladede aminendestykker øger indkapslingseffektiviteten og belastningen på grund af ladningsinteraktionerne mellem den og den negativt ladede rygrad i DNA'et. I et 50 ml polypropylen konisk centrifugerør blev 100 mg Pluronic F127 opløst i 20 ml autoklaveret DI-vand ved hvirvelblanding efterfulgt af 30 minutters skånsom sonikering ved hjælp af et ultralydsbad (se CupHorn). En autoklaveret magnetisk omrøringsstang blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved 600 RPM i 30 minutter, mens de andre opløsninger blev lavet. Laboratorieudstyr af plast blev brugt i stedet for glas overalt for at minimere uspecifik adsorption af DNA. Opløsninger af PLGA opløst i DMF (44,48 mg/ml) og TIPS-pentacen opløst i THF (0,667 mg/ml) blev fremstillet separat. PLGA'en blev efterladt i ro til våd i DMF i 30 minutter, før den blev sonikeret i 30 minutter. (for fuld protokol se Jo et al., 2020)

Plasmid DNA-beskyttelse under sonikering

DNA, herunder plasmider og supercoiled plasmider, er meget følsomme nedbrydninger. Alle tilgængelige fragmenteringsmetoder er kendt for visse ulemper. Ultralyd DNA-fragmentering er en af de foretrukne metoder, da kontrolleret sonikering i kombination med beskyttelsesforanstaltninger gør det muligt at reducere forskydnings- og varmeinduceret skade på DNA-strenge.
Udover indstillinger med lav amplitude, pulseringstilstand og temperaturkontrol under ultralyds-DNA-klipning viste brugen af visse midler signifikant beskyttende effekt mod DNA-nedbrydning. For eksempel beskytter forskellige polymerer, peptider og lipider plasmid-DNA'et under ultralydbehandling.

Stabiliteten af plasmid-DNA og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser mod ultralydsforskydningsspænding blev undersøgt ved hjælp af agarosegelelektroforeseanalyse. Både plasmid-DNA- og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsspænding på forskellige tidspunkter. Plasmid-DNA'et blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30 og 40 minutter. Imidlertid blev plasmid-DNA/IL-nanokomplekserne udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter.
(studie og billede: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) viste, at når plasmid-DNA / ionisk væske (pDNA/IL) nanostrukturer blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter og kompleksbundet med det kommercielt tilgængelige kationiske genleveringsmiddel lipofectamin, var procentdelen af fluorescerende positive celler 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, henholdsvis 65 % og 50 % (se diagrammet nedenfor). Procentdelen af fluorescerende positive celler steg, når nanostrukturerne blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 10 og 20 minutter, og faldt derefter langsomt.

Indflydelse af ionisk væske [Bmim][PF6] på leveringen af plasmid-DNA til COS7-celler. Plasmid DNA / IL (ionisk væske) nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i op til 120 minutter og kompleksbundet med LA, før de blev leveret til COS7-celler. Dataene viser det gennemsnitlige antal (%) af GFP-positive HeLa-celler talt i 10 forskellige mikroskopiske felter, og eksperimentet blev udført flere gange på tre forskellige dage. (Studie og diagram: ©Sarker et al., 2019)

Ultralyd lysat forberedelse

Ultralyd cellelyseprotokol
Start med en beriget prøve af celler, der blev fremstillet via en celleseparationsmetode (f.eks. immunomagnetisk celleseparation, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), tæthedsgradientcentrifugering, immuntæthedscelleisolering).
Celleprøverne skal vise et volumen af en lysisbuffer, der er passende til forsøgsmålet og sonde-type ultralydsapparat.
Hypotoniske buffere foretrækkes, da de forbedrer ultralydscellelyse. Det er vigtigt, at tilsætningsstoffer og saltkoncentration anvendes på en hensigtsmæssig måde.
Vælg din ultralydslyseringsenhed: Til indirekte sonikering af hætteglas anbefales VialTweeter eller CupHorn. Til multiwell-plader er UIP400MTP den ideelle ultralydsapparat. Og klassisk sonde-type sonde-type sondebehandling, en ultralydshomogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospids er bedst egnede.
Protokol for sonde-type sonikering: Placer ultralydssonden i sample volumen i et mikrocentrifugerør og soniker i ca. 10 sekunder. Afhængigt af DNA-prøven kan sonikeringen gentages en eller to gange mere. Den krævede ultralydsenergiindgang (Ws / ml) afhænger af prøvens viskositet og DNA-type. Afkøling via isbad og pulseringstilstand af ultralydsapparatet hjælper med at forhindre, at prøven nedbrydes termisk.
Efter ultralydslyse centrifugeres prøven for at adskille pilleaffald (indeholdende ulyserede celler, kerner og ulyserede organeller)
Hvis prøven ikke straks behandles yderligere, kan den opbevares ved en passende temperatur for at bevare dens levedygtighed.

Ultralydapparater til DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til DNA-, RNA- og kromatinfragmentering. Disse forskellige platforme inkluderer ultralydssonder (sonotroder), indirekte sonikeringsopløsninger til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multi-brøndplader (f.eks. 96-brønds plader, mikrotiterplader), sonoreaktorer og ultralyd cuphorns. Alle platforme til DNA-klipning drives af frekvenstunede, højtydende ultralydsprocessorer, som er præcist kontrollerbare og leverer reproducerbare resultater.

Ultralydsprocessorer til ethvert prøveantal og størrelse

Med Hielschers multi-sample ultralydapparater VialTweeter (til op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader / multiwell-plader) bliver det let muligt at reducere prøvebehandlingstiden på grund af intens og præcist kontrollerbar ultralydbehandling, samtidig med at der opnås den ønskede DNA-fragmentstørrelse, fordeling og udbytte. Ultralyd DNA-fragmentering gør plasmidforberedelsestrin effektive, pålidelige og skalerbare. Protokoller kan skaleres lineært fra en til adskillige prøver ved at anvende konstante ultralydsparametre.
Sonde ultralydapparater med en til fem fingre er ideelle til fremstilling af mindre prøvenumre. Hielschers laboratorie ultralydapparater fås med forskellige effektniveauer, så du kan vælge den ideelle ultralydsforstyrrer til din DNA-relaterede applikation.