Plasmid Forberedelse ved hjælp af ultralydbehandling

Ultralydbehandling er en pålidelig teknik til at fragmentere plasmid-DNA. Præcist kontrollerbar amplitude, pulsationstilstand og temperaturregulering er de vigtigste funktioner i en ultralydsapparat til ikke-skadelig plasmidfragmentering. Derudover hjælper brugen af visse midler med at beskytte mod nedbrydning af plasmid. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til kontrolleret plasmidfragmentering fra enkelte hætteglas, samtidig sonikering af adskillige prøver samt plader med flere brønde. Lær mere om vellykket ultralyd plasmid fragmentering!

Plasmidforskydning ved hjælp af ultralydbehandling

Når DNA-prøver udsættes for ultralydbølger, skaber de ultralydsgenererede vibrationer akustisk kavitation i væsken, der skærer eller bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt via mekaniske kræfter. Sonikering er den mest anvendte metode til bulk DNA-forskydningseksperimenter, herunder applikationer, såsom Kromatin Immunoprecipitation (ChIP), for hvilke små fragmentstørrelser er helt afgørende for at opnå høj opløsning. (jf. Tseng et al., 2012)
Plasmid DNA (pDNA) er en specifik form for DNA, der er kendetegnet ved sin ringform og findes i bakterier og nogle eukaryoter.
Supercoiled pDNA er den ønskede form for plasmid-DNA, da det viser de bedste resultater i nedstrømsprocesser såsom automatiseret sekventering og transfektion. Ultralydbehandling er velegnet til fragment pDNA, herunder supercoiled pDNA, med succes.
Thompson et al. (2008) demonstrerede, at plasmid sonikering, som er kendt for at fragmentere supercoiled DNA, er en effektiv måde at forbedre sekvens phred20 læselængder til det punkt, at de ikke er signifikant forskellige fra Beckman Coulters kontrolskabelon eller enzymatisk lineariserede plasmider.

Anvendelse af plasmidvektorer

Plasmider bruges ofte som værktøjer til at klone, overføre og manipulere gener. Når plasmider anvendes eksperimentelt til disse formål, kaldes de vektorer. DNA-fragmenter eller gener kan indsættes i en plasmidvektor, hvilket skaber et såkaldt rekombinant plasmid. Plasmidvektorer bruges som køretøjer til at drive rekombinant DNA ind i en værtscelle og er en nøglekomponent i molekylær kloning.
“Ikke-virale vektorer undersøges grundigt for deres potentielle anvendelse i genterapi til behandling af forskellige komplicerede sygdomme. Ikke-virale vektorer beskytter plasmid-DNA mod fysisk, kemisk og enzymatisk nedbrydning og leverer DNA-molekylet til målstedet. For eksempel danner kationiske liposomer, chitosan og andre positivt ladede nanopartikler komplekser med plasmid-DNA gennem elektrostatiske interaktioner. Imidlertid er de let dannede kationiske liposomer / plasmid DNA-komplekser relativt store (dvs. 300-400 nm) og heterogene i naturen, hvilket gør dem vanskelige at anvende i farmaceutiske applikationer. De store og heterogene plasmid DNA / liposomer, plasmid DNA / aerosoler og plasmid DNA / peptider komplekser kan reduceres til mindre og homogene partikler ved hjælp af ultralydbehandling.” (Sarker et al., 2019)
Et fremtrædende eksempel på brugen af plasmidvektorer er CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9-systemet leveres typisk til celler som et enkelt stort plasmid eller flere mindre plasmider, der koder for en målsekvens, en CRISPR-guide og Cas9.

Ultralyd Forberedelse af DNA-belastede PLGA Nanopartikler ved Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) anvendte poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) for at danne en nanopartikelbærer til levering af en model CRISPR-Cas9-plasmid i primære knoglemarvsafledte makrofager. Til nanofældning af PLGA nanopartikler blev PLGA med to forskellige endegrupper (ester- og amingrupper) anvendt med det formål, at de positivt ladede amin-endehætter øger indkapslingseffektiviteten og belastningen på grund af ladningsinteraktionerne mellem den og DNA'ets negativt ladede rygrad. I et 50 ml polypropylen konisk centrifugerør blev 100 mg Pluronic F127 opløst i 20 ml autoklaveret DI-vand ved hvirvelblanding efterfulgt af 30 minutters blid sonikering ved hjælp af et ultralydsbad (se CupHorn). En autoklaveret magnetisk omrøringsstang blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved 600 rpm i 30 minutter, mens de andre opløsninger blev fremstillet. Plastlabware blev brugt i stedet for glasvarer overalt for at minimere uspecifik adsorption af DNA. Opløsninger af PLGA opløst i DMF (44,48 mg/ml) og TIPS-pentacen opløst i THF (0,667 mg/ml) blev fremstillet separat. PLGA blev efterladt stille til våd i DMF i 30 minutter, før den blev sonikeret i 30 min. (for fuld protokol se Jo et al., 2020)

Plasmid DNA-beskyttelse under sonikering

DNA, herunder plasmider og superspolerede plasmider, er meget følsom nedbrydning. Alle tilgængelige fragmenteringsmetoder er kendt for visse ulemper. Ultralyd DNA-fragmentering er en af de foretrukne metoder, da kontrolleret sonikering i kombination med beskyttelsesforanstaltninger gør det muligt at reducere forskydnings- og varmeinduceret beskadigelse af DNA-strenge.
Udover indstillinger for lav amplitude, pulseringstilstand og temperaturregulering under ultralyd DNA-forskydning viste brugen af visse midler signifikant beskyttende virkning mod DNA-nedbrydning. For eksempel beskytter forskellige polymerer, peptider og lipider plasmid-DNA'et under ultralydbehandling.

Stabiliteten af plasmid-DNA og plasmid-DNA / IL-nanokomplekser mod ultralydforskydningsstress blev undersøgt ved hjælp af agarosegelelektroforeseassay. Både plasmid-DNA og plasmid-DNA / IL-nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsstress i forskellige tidspunkter. Plasmid-DNA'et blev udsat for ultralydsforskydningsstress i 0, 10, 20, 30 og 40 minutter. Imidlertid blev plasmid DNA / IL nanokomplekser udsat for ultralydsforskydningsstress i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter.
(studie og billede: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) viste, at når plasmid-DNA / ionisk væske (pDNA / IL) nanostrukturer blev udsat for ultralydsforskydningsstress for 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter og kompleksiseret med det kommercielt tilgængelige kationiske genleveringsmiddel lipofectamin, var procentdelen af fluorescerende positive celler 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Henholdsvis 65 % og 50 % (se figur nedenfor). Procentdelen af fluorescerende positive celler steg, når nanostrukturerne blev udsat for ultralydsforskydningsstress i 10 og 20 minutter og derefter faldt langsomt.

Indflydelse af ionisk væske [Bmim][PF6] på levering af plasmid-DNA til COS7-celler. Plasmid DNA / IL (ionisk væske) nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsstress i op til 120 minutter og kompleksiseret med LA, før de leverede til COS7-celler. Dataene viser det gennemsnitlige antal (%) af GFP-positive HeLa-celler talt i 10 forskellige mikroskopiske felter, og eksperimentet blev udført flere gange på tre forskellige dage. (Undersøgelse og diagram: ©Sarker et al., 2019)

Ultralyd lysat forberedelse

Ultralyd celle lysis protokol
Start med en beriget prøve af celler, der blev fremstillet via en celleseparationsmetode (f.eks. Immunomagnetisk celleseparation, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscelleisolering).
Celleprøverne skal vise et volumen af en lysisbuffer, der er passende for det eksperimentelle mål og sonde-type ultralydsapparat.
Hypotoniske buffere foretrækkes, da de forbedrer ultralydscellelyse. Det er vigtigt, at tilsætningsstoffer og saltkoncentration anvendes på en passende måde.
Vælg din ultralydslyseenhed: Til indirekte sonikering af hætteglas anbefales VialTweeter eller CupHorn. For multiwell-plader er UIP400MTP den ideelle ultralydsapparat. Og klassisk sonde-type sonikering, en ultralyd homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikro-tip er mest egnede.
Protokol til sonde-type sonikering: Placer ultralydsonden i prøvevolumenet i et mikrocentrifugerør og sonikere i ca. 10 sekunder. Afhængigt af DNA-prøven kan sonikeringen gentages en eller to gange mere. Den krævede ultralyd energi input (Ws / ml) afhænger af prøvens viskositet og DNA-type. Køling via isbad og pulsationstilstand af ultralydsapparatet hjælper med at forhindre, at prøven er termisk nedbrudt.
Efter ultralydslyse centrifugeres prøven for at adskille pelletsaffald (indeholdende ulysede celler, kerner og uinlyserede organeller)
Hvis prøven ikke straks behandles yderligere, kan den opbevares ved en passende temperatur for at bevare dens levedygtighed.

Ultralydapparater til DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til DNA, RNA og kromatinfragmentering. Disse forskellige platforme omfatter ultralydsonder (sonotoder), indirekte sonikeringsopløsninger til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multibrøndplader (f.eks. 96-brøndsplader, mikrotiterplader), sonoreactors og ultralyd cuphorns. Alle platforme til DNA-klipning drives af frekvenstunede, højtydende ultralydsprocessorer, som netop kan styres og giver reproducerbare resultater.

Ultralydsprocessorer til et vilkårligt prøvenummer og -størrelse

Med Hielscher's multi-sample ultralydapparater VialTweeter (for op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader / multiwell plader) bliver det let muligt at reducere prøvebehandlingstiden på grund af intens og præcist kontrollerbar ultralydbehandling, samtidig med at man opnår den ønskede DNA-fragmentstørrelsesfordeling og udbytte. Ultralyd DNA-fragmentering gør plasmidforberedelsestrin effektive, pålidelige og skalerbare. Protokoller kan skaleres lineært fra en til adskillige prøver ved at anvende konstante ultralydsparametre.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.