Plasmidpræparation ved hjælp af ultralyd

Ultralydsbehandling er en pålidelig teknik til fragmentering af plasmid-DNA. Præcist styrbar amplitude, pulstilstand og temperaturstyring er de vigtigste egenskaber ved et ultralydsapparat til plasmidfragmentering uden beskadigelse. Desuden bidrager anvendelsen af visse midler til at beskytte mod plasmidnedbrydning. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til kontrolleret plasmidfragmentering i enkelte prøveglas, samtidig sonikering af talrige prøver samt behandling af multibrøndplader. Læs mere om vellykket plasmidfragmentering med ultralyd!

Forskydningsfragmentering af plasmider ved hjælp af ultralyd

Når DNA-prøver udsættes for ultralydsbølger, skaber de ultralydsgenererede vibrationer akustisk kavitation i væsken, som fragmenterer eller bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt gennem mekaniske kræfter. Sonikering er den mest anvendte metode til forsøg med forskydningsfragmentering af DNA i større mængder, herunder anvendelser såsom kromatinimmunpræcipitation (ChIP), hvor små fragmentstørrelser er helt afgørende for at opnå høj opløsning. (jf. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) er en specifik form for DNA, der er kendetegnet ved sin ringform og findes i bakterier og visse eukaryoter.
Supercoilet pDNA er den ønskede form for plasmid-DNA, da det giver de bedste resultater i efterfølgende processer såsom automatiseret sekventering og transfektion. Ultralydsbehandling er velegnet til vellykket fragmentering af pDNA, herunder supercoilet pDNA.
Thompson et al. (2008) viste, at sonikering af plasmider, som er kendt for at fragmentere supercoilet DNA, er en effektiv metode til at forbedre sekvenslæselængder ved phred20 til et niveau, hvor de ikke adskiller sig signifikant fra dem, der opnås med Beckman Coulters kontrolskabelon eller enzymatisk lineariserede plasmider.

Anvendelse af plasmidvektorer

Plasmider bruges ofte som værktøjer til at klone, overføre og manipulere gener. Når plasmider anvendes eksperimentelt til disse formål, kaldes de vektorer. DNA-fragmenter eller gener kan indsættes i en plasmidvektor, hvorved der dannes et såkaldt rekombinant plasmid. Plasmidvektorer bruges som transportmidler til at føre rekombinant DNA ind i en værtscelle og er en central komponent i molekylær kloning.
“Ikke-virale vektorer undersøges indgående med henblik på deres potentielle anvendelse i genterapi til behandling af forskellige komplicerede sygdomme. Ikke-virale vektorer beskytter plasmid-DNA mod fysisk, kemisk og enzymatisk nedbrydning og leverer DNA-molekylet til målstedet. For eksempel danner kationiske liposomer, chitosan og andre positivt ladede nanopartikler komplekser med plasmid-DNA gennem elektrostatiske interaktioner. De let dannede komplekser af kationiske liposomer/plasmid-DNA er dog relativt store (dvs. 300–400 nm) og heterogene af natur, hvilket gør dem vanskelige at anvende i farmaceutiske applikationer. De store og heterogene komplekser af plasmid-DNA/liposomer, plasmid-DNA/aerosoler og plasmid-DNA/peptider kan reduceres til mindre og homogene partikler ved hjælp af ultralydsbehandling.” (Sarker et al., 2019)
Et fremtrædende eksempel på anvendelsen af plasmidvektorer er CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet leveres typisk til celler som et enkelt stort plasmid eller flere mindre plasmider, der koder for en målsekvens, en CRISPR-guide og Cas9.

Fremstilling af DNA-holdige PLGA-nanopartikler ved nanopræcipitation med ultralyd

Jo et al. (2020) anvendte poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) til at danne en nanopartikelbærer til levering af et CRISPR–Cas9-modelplasmid til primære makrofager afledt af knoglemarv. Til nanopræcipitation af PLGA-nanopartikler blev der anvendt PLGA med to forskellige endegrupper (ester- og amingrupper) med det formål, at de positivt ladede aminendegrupper øger indkapslingseffektiviteten og beladningen gennem ladningsinteraktioner med DNA’ets negativt ladede rygrad. I et konisk centrifugerør af polypropylen på 50 mL blev 100 mg Pluronic F127 opløst i 20 mL autoklaveret deioniseret vand ved vortexblanding efterfulgt af 30 min skånsom sonikering i et ultralydsbad (se CupHorn). En autoklaveret magnetomrørerstav blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved 600 RPM i 30 min, mens de øvrige opløsninger blev fremstillet. Der blev anvendt laboratorieudstyr af plast i stedet for glas under hele processen for at minimere uspecifik adsorption af DNA. Opløsninger af PLGA opløst i DMF (44,48 mg/ ml) og TIPS pentacene opløst i THF (0,667 mg/ml) blev fremstillet separat. PLGA blev efterladt i ro til befugtning i DMF i 30 min, før det blev sonikeret i 30 min. (se Jo et al., 2020 for den fulde protokol)

Beskyttelse af plasmid-DNA under sonikering

DNA, herunder plasmider og supercoilede plasmider, er meget følsomt over for nedbrydning. Alle tilgængelige fragmenteringsmetoder er kendt for at have visse ulemper. DNA-fragmentering med ultralyd er en af de foretrukne metoder, da kontrolleret sonikering i kombination med beskyttelsesforanstaltninger gør det muligt at reducere beskadigelse af DNA-strenge forårsaget af forskydning og varme.
Ud over indstillinger med lav amplitude, pulstilstand og temperaturstyring under forskydningsfragmentering af DNA med ultralyd har anvendelsen af visse midler vist en betydelig beskyttende virkning mod DNA-nedbrydning. For eksempel beskytter forskellige polymerer, peptider og lipider plasmid-DNA under ultralydsbehandling.

Stabiliteten af plasmid-DNA og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser over for ultralydsinducerede forskydningsspændinger blev undersøgt ved hjælp af agarosegelelektroforese. Både plasmid-DNA og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser blev udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i forskellige tidsrum. Plasmid-DNA blev udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i 0, 10, 20, 30 og 40 minutter. Plasmid-DNA/IL-nanokomplekserne blev derimod udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter.
(undersøgelse og billede: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) viste, at når nanostrukturer af plasmid-DNA / ionisk væske (pDNA/IL) blev udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 min og kompleksbundet med det kommercielt tilgængelige kationiske genleveringsmiddel lipofectamine, var andelen af fluorescenspositive celler henholdsvis 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% og 50% (se diagrammet nedenfor). Andelen af fluorescenspositive celler steg, når nanostrukturerne blev udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i 10 og 20 min, og faldt derefter langsomt.

Den ioniske væskes indflydelse [Bmim][PF6] på leveringen af plasmid-DNA til COS7-celler. Nanokomplekser af plasmid-DNA/IL (ionisk væske) blev udsat for ultralydsinducerede forskydningsspændinger i op til 120 minutter og kompleksbundet med LA før levering til COS7-celler. Dataene viser det gennemsnitlige antal (%) GFP-positive HeLa-celler, som blev talt i 10 forskellige mikroskopiske synsfelter, og forsøget blev udført flere gange på tre forskellige dage. (Undersøgelse og diagram: ©Sarker et al., 2019)

Lysatpræparation med ultralyd

Protokol for cellelyse med ultralyd
Start med en beriget celleprøve, der er fremstillet ved hjælp af en celleseparationsmetode (f.eks. immunmagnetisk celleseparation, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering eller immunodensitetsbaseret celleisolering).
Celleprøverne skal indeholde et volumen lysebuffer, der er passende til forsøgets formål og ultralydsapparatet med sonde.
Hypotone buffere foretrækkes, da de fremmer cellelyse med ultralyd. Det er vigtigt, at tilsætningsstoffer og saltkoncentration anvendes på en passende måde.
Vælg dit apparat til cellelyse med ultralyd: Til indirekte sonikering af prøveglas anbefales VialTweeter eller CupHorn. Til multibrøndplader er UIP400MTP det ideelle ultralydsapparat. Til klassisk sonikering med sonde er en ultralydshomogenisator såsom UP100H eller UP200Ht med en mikrospids mest velegnet.
Protokol for sonikering med sonde: Anbring ultralydsapparatets sonde i prøvevolumenet i et mikrocentrifugerør, og sonikér i ca. 10 sekunder. Afhængigt af DNA-prøven kan sonikeringen gentages en eller to gange mere. Den nødvendige tilførsel af ultralydsenergi (Ws/mL) afhænger af prøvens viskositet og DNA-typen. Køling i et isbad og ultralydsapparatets pulstilstand hjælper med at forhindre termisk nedbrydning af prøven.
Efter cellelyse med ultralyd centrifugeres prøven for at udskille bundfaldet af rester (indeholdende ikke-lyserede celler, cellekerner og ikke-lyserede organeller).
Hvis prøven ikke straks behandles videre, kan den kan den opbevares ved en passende temperatur for at bevare dens levedygtighed.

Ultralydsapparater til DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til fragmentering af DNA, RNA og kromatin. Disse forskellige platforme omfatter ultralydssonder (sonotroder), løsninger til indirekte sonikering til samtidig prøvepræparation i flere rør eller multibrøndplader (f.eks. 96-brøndplader og mikrotiterplader), sonoreaktorer og ultralyds-CupHorns. Alle platforme til forskydningsfragmentering af DNA drives af frekvenstilpassede ultralydsprocessorer med høj ydeevne, som kan styres præcist og leverer reproducerbare resultater.

Ultralydsprocessorer til ethvert prøveantal og enhver prøvestørrelse

Med Hielschers ultralydsapparater til flere prøver, VialTweeter (til op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader/multibrøndplader), bliver det let at reducere prøvernes behandlingstid gennem intensiv og præcist styrbar ultralydsbehandling, samtidig med at den ønskede størrelsesfordeling af DNA-fragmenterne og det ønskede udbytte opnås. DNA-fragmentering med ultralyd gør plasmidpræparationens trin effektive, pålidelige og skalerbare. Protokoller kan skaleres lineært fra én til talrige prøver ved at anvende konstante ultralydsparametre.
Ultralydsapparater med sonder med én til fem fingre er ideelle til præparation af et mindre antal prøver. Hielschers laboratorieultralydsapparater fås med forskellige effektniveauer, så du kan vælge det ideelle ultralydsapparat til nedbrydning til din DNA-relaterede anvendelse.