Plasmidforberedelse ved hjælp af ultralydbehandling
Ultralydbehandling er en pålidelig teknik til at fragmentere plasmid-DNA. Præcist kontrollerbar amplitude, pulseringstilstand og temperaturkontrol er de vigtigste funktioner i en ultralydsapparat til ikke-skadelig plasmidfragmentering. Derudover hjælper brugen af visse midler med at beskytte mod plasmidnedbrydning. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til kontrolleret plasmidfragmentering fra enkelte hætteglas, samtidig sonikering af adskillige prøver såvel som plader med flere brønde. Lær mere om vellykket ultralydsplasmidfragmentering!

Den UIP400MTP Giver mulighed for præcist kontrolleret ultralydbehandling af plader med flere brønde. En af anvendelserne af UIP400MTP er fragmentering af plasmid-DNA for at opnå fragmenter af en specifikt målrettet længde.
Plasmidklipning ved hjælp af ultralydbehandling
Når DNA-prøver udsættes for ultralydsbølger, skaber de ultralydsgenererede vibrationer akustisk kavitation i væsken, der skærer eller bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt via mekaniske kræfter. Sonikering er den mest udbredte metode til bulk DNA-forskydningseksperimenter, herunder applikationer, såsom kromatinimmunudfældning (ChIP), for hvilke små fragmentstørrelser er helt afgørende for at opnå høj opløsning. (jf. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) er en specifik form for DNA, der er kendetegnet ved sin ringform og findes i bakterier og nogle eukaryoter.
Supercoiled pDNA er den ønskede form for plasmid-DNA, da det viser de bedste resultater i down-stream-processer såsom automatiseret sekventering og transfektion. Ultralydbehandling er velegnet til at fragmentere pDNA, herunder supercoiled pDNA, med succes.
Thompson et al. (2008) viste, at plasmidsonikering, som er kendt for at fragmentere supercoiled DNA, er en effektiv måde at forbedre sekvens phred20 læselængder til det punkt, at de ikke adskiller sig signifikant fra Beckman Coulters kontrolskabelon eller enzymatisk lineariserede plasmider.
- Præcist kontrollerbar
- Reproducerbare resultater
- Justerbar til mål-DNA-fragmentlængder
- Temperaturkontrol
- Skalerbar til enhver stikprøvestørrelse
brug af plasmid Vektorer
Plasmider bruges ofte som værktøjer til at klone, overføre og manipulere gener. Når plasmider bruges eksperimentelt til disse formål, kaldes de vektorer. DNA-fragmenter eller gener kan indsættes i en plasmidvektor, hvilket skaber et såkaldt rekombinant plasmid. Plasmidvektorer bruges som bærere til at drive rekombinant DNA ind i en værtscelle og er en nøglekomponent i molekylær kloning.
“Ikke-virale vektorer undersøges grundigt for deres potentielle anvendelse i genterapi til behandling af forskellige komplicerede sygdomme. Ikke-virale vektorer beskytter plasmid-DNA mod fysisk, kemisk og enzymatisk nedbrydning og leverer DNA-molekylet til målstedet. For eksempel danner kationiske liposomer, chitosan og andre positivt ladede nanopartikler komplekser med plasmid-DNA gennem elektrostatiske interaktioner. Imidlertid er de let dannede kationiske liposomer/plasmid-DNA-komplekser relativt store (dvs. 300-400 nm) og heterogene i naturen, hvilket gør dem vanskelige at bruge i farmaceutiske applikationer. De store og heterogene plasmid-DNA / liposomer, plasmid-DNA / aerosoler og plasmid-DNA / peptidkomplekser kan reduceres til mindre og homogene partikler ved hjælp af ultralydbehandling.” (Sarker et al., 2019)
Et fremtrædende eksempel på brugen af plasmidvektorer er CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9-systemet leveres typisk til celler som et enkelt stort plasmid eller flere mindre plasmider, der koder for en målsekvens, en CRISPR-guide og Cas9.
Ultralydsforberedelse af DNA-belastede PLGA-nanopartikler ved nanoudfældning
Jo et al. (2020) brugte poly(mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) for at danne en nanopartikelbærer til levering af et model CRISPR-Cas9-plasmid til primære knoglemarvsafledte makrofager. Til nanoudfældning af PLGA-nanopartikler blev PLGA med to forskellige slutgrupper (ester- og amingrupper) brugt med det formål, at de positivt ladede aminendestykker øger indkapslingseffektiviteten og belastningen på grund af ladningsinteraktionerne mellem den og den negativt ladede rygrad i DNA'et. I et 50 ml polypropylen konisk centrifugerør blev 100 mg Pluronic F127 opløst i 20 ml autoklaveret DI-vand ved hvirvelblanding efterfulgt af 30 minutters skånsom sonikering ved hjælp af et ultralydsbad (se CupHorn). En autoklaveret magnetisk omrøringsstang blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved 600 RPM i 30 minutter, mens de andre opløsninger blev lavet. Laboratorieudstyr af plast blev brugt i stedet for glas overalt for at minimere uspecifik adsorption af DNA. Opløsninger af PLGA opløst i DMF (44,48 mg/ml) og TIPS-pentacen opløst i THF (0,667 mg/ml) blev fremstillet separat. PLGA'en blev efterladt i ro til våd i DMF i 30 minutter, før den blev sonikeret i 30 minutter. (for fuld protokol se Jo et al., 2020)
- Ekstraktion af DNA
- Indkapsling af DNA
- Spredning af nanopartikelbelagt DNA
- Levering af plasmid-DNA til celler
Plasmid DNA-beskyttelse under sonikering
DNA, herunder plasmider og supercoiled plasmider, er meget følsomme nedbrydninger. Alle tilgængelige fragmenteringsmetoder er kendt for visse ulemper. Ultralyd DNA-fragmentering er en af de foretrukne metoder, da kontrolleret sonikering i kombination med beskyttelsesforanstaltninger gør det muligt at reducere forskydnings- og varmeinduceret skade på DNA-strenge.
Udover indstillinger med lav amplitude, pulseringstilstand og temperaturkontrol under ultralyds-DNA-klipning viste brugen af visse midler signifikant beskyttende effekt mod DNA-nedbrydning. For eksempel beskytter forskellige polymerer, peptider og lipider plasmid-DNA'et under ultralydbehandling.

Stabiliteten af plasmid-DNA og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser mod ultralydsforskydningsspænding blev undersøgt ved hjælp af agarosegelelektroforeseanalyse. Både plasmid-DNA- og plasmid-DNA/IL-nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsspænding på forskellige tidspunkter. Plasmid-DNA'et blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30 og 40 minutter. Imidlertid blev plasmid-DNA/IL-nanokomplekserne udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter.
(studie og billede: ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) viste, at når plasmid-DNA / ionisk væske (pDNA/IL) nanostrukturer blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter og kompleksbundet med det kommercielt tilgængelige kationiske genleveringsmiddel lipofectamin, var procentdelen af fluorescerende positive celler 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, henholdsvis 65 % og 50 % (se diagrammet nedenfor). Procentdelen af fluorescerende positive celler steg, når nanostrukturerne blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i 10 og 20 minutter, og faldt derefter langsomt.

Indflydelse af ionisk væske [Bmim][PF6] på leveringen af plasmid-DNA til COS7-celler. Plasmid DNA / IL (ionisk væske) nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsspænding i op til 120 minutter og kompleksbundet med LA, før de blev leveret til COS7-celler. Dataene viser det gennemsnitlige antal (%) af GFP-positive HeLa-celler talt i 10 forskellige mikroskopiske felter, og eksperimentet blev udført flere gange på tre forskellige dage. (Studie og diagram: ©Sarker et al., 2019)

Plasmid-DNA kan beskyttes ved at tilføje et middel før ultralydsfragmentering: Sonikering-induceret nedbrydning af nøgent pDNA (A) og af pDNA formuleret med 1,5 mM CaCl2 og 20% (v / v) t-butanol (B)
Prøver blev sonikeret med en 20W sonde i op til 120s, som angivet på toppen af hver bane. Bane H svarer til Hyperladder I-markøren ™️. OC- og SC-plasmidbåndene er angivet.
(studie og billeder: ©Wu et al., 2009)
Ultralyd lysat forberedelse
Ultralyd cellelyseprotokol
Start med en beriget prøve af celler, der blev fremstillet via en celleseparationsmetode (f.eks. immunomagnetisk celleseparation, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), tæthedsgradientcentrifugering, immuntæthedscelleisolering).
Celleprøverne skal vise et volumen af en lysisbuffer, der er passende til forsøgsmålet og sonde-type ultralydsapparat.
Hypotoniske buffere foretrækkes, da de forbedrer ultralydscellelyse. Det er vigtigt, at tilsætningsstoffer og saltkoncentration anvendes på en hensigtsmæssig måde.
Vælg din ultralydslyseringsenhed: Til indirekte sonikering af hætteglas anbefales VialTweeter eller CupHorn. Til multiwell-plader er UIP400MTP den ideelle ultralydsapparat. Og klassisk sonde-type sonde-type sondebehandling, en ultralydshomogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospids er bedst egnede.
Protokol for sonde-type sonikering: Placer ultralydssonden i sample volumen i et mikrocentrifugerør og soniker i ca. 10 sekunder. Afhængigt af DNA-prøven kan sonikeringen gentages en eller to gange mere. Den krævede ultralydsenergiindgang (Ws / ml) afhænger af prøvens viskositet og DNA-type. Afkøling via isbad og pulseringstilstand af ultralydsapparatet hjælper med at forhindre, at prøven nedbrydes termisk.
Efter ultralydslyse centrifugeres prøven for at adskille pilleaffald (indeholdende ulyserede celler, kerner og ulyserede organeller)
Hvis prøven ikke straks behandles yderligere, kan den opbevares ved en passende temperatur for at bevare dens levedygtighed.
Ultralydapparater til DNA-fragmentering
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til DNA-, RNA- og kromatinfragmentering. Disse forskellige platforme inkluderer ultralydssonder (sonotroder), indirekte sonikeringsopløsninger til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multi-brøndplader (f.eks. 96-brønds plader, mikrotiterplader), sonoreaktorer og ultralyd cuphorns. Alle platforme til DNA-klipning drives af frekvenstunede, højtydende ultralydsprocessorer, som er præcist kontrollerbare og leverer reproducerbare resultater.
Ultralydsprocessorer til ethvert prøveantal og størrelse
Med Hielschers multi-sample ultralydapparater VialTweeter (til op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader / multiwell-plader) bliver det let muligt at reducere prøvebehandlingstiden på grund af intens og præcist kontrollerbar ultralydbehandling, samtidig med at der opnås den ønskede DNA-fragmentstørrelse, fordeling og udbytte. Ultralyd DNA-fragmentering gør plasmidforberedelsestrin effektive, pålidelige og skalerbare. Protokoller kan skaleres lineært fra en til adskillige prøver ved at anvende konstante ultralydsparametre.
Sonde ultralydapparater med en til fem fingre er ideelle til fremstilling af mindre prøvenumre. Hielschers laboratorie ultralydapparater fås med forskellige effektniveauer, så du kan vælge den ideelle ultralydsforstyrrer til din DNA-relaterede applikation.

Ultralydsenheden til forberedelse af flere prøver VialTweeter giver mulighed for samtidig sonikering af op til 10 hætteglas. Med clamp-on-enheden VialPress, kan op til 4 ekstra rør presses foran for intens sonikering.
Præcis processtyring
Præcist kontrollerbare sonikeringsindstillinger er afgørende, da udtømmende sonificering kan ødelægge DNA, RNA og kromatin, men utilstrækkelig ultralydsklipning resulterer i for lange DNA- og kromatinfragmenter. Hielschers digitale ultralydapparater kan let indstilles til præcis sonikeringsparameter. Specifikke sonikeringsindstillinger kan også gemmes som programmeret indstilling til hurtig gentagelse af den samme procedure.
Al sonikering protokolleres automatisk og gemmes som CSV-fil på et indbygget SD-kort. Dette giver mulighed for nøjagtig dokumentation af udførte forsøg og gør det muligt at revidere sonikeringskørsler let.
Via browserfjernbetjening kan alle digitale ultralydapparater betjenes og overvåges via enhver standardbrowser. Installation af yderligere software er ikke påkrævet, da LAN-forbindelsen er en meget enkel plug-n-play-opsætning.
Højeste brugervenlighed under ultralyd DNA-forberedelse
Alle Hielscher ultralydapparater er designet til at levere højtydende ultralyd, samtidig med at de altid er meget brugervenlige og nemme at betjene. Alle indstillinger er velstrukturerede i en overskuelig menu, som nemt kan tilgås via farvet touch-display eller browserfjernbetjening. Den smarte software med programmerbare indstillinger og automatisk dataoptagelse sikrer optimale sonikeringsindstillinger for pålidelige og reproducerbare resultater. Den rene og brugervenlige menugrænseflade gør Hielscher ultralydapparater til brugervenlige og effektive enheder.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores laboratorie ultralydapparater til cellelyse og DNA-fragmentering:
Batch volumen | Flowhastighed | Anbefalede enheder |
---|---|---|
plader med flere bønde | Nielsen | UIP400MTP |
hætteglas, små bægerglas | Nielsen | Ultralyd CupHorn |
op til 10 hætteglas | Nielsen | VialTweeter |
1 til 500 ml | 10 til 200 ml/min | UP100H |
10 til 2000 ml | 20 til 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
Kontakt os! / Spørg os!
Litteratur / Referencer
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Fakta, der er værd at vide
Hvad er plasmider?
Et plasmid er et lille cirkulært DNA-molekyle, der er fysisk adskilt fra kromosomalt DNA og replikerer uafhængigt. Plasmider er ofte forbundet med gener, der bidrager til en organismes overlevelse og giver specifikke fordele, f.eks. antibiotikaresistens. Plasmider findes oftest som små cirkulære, dobbeltstrengede DNA-molekyler i bakterier; Imidlertid er plasmider nogle gange til stede i arkæer og eukaryote organismer. Plasmider er vigtige værktøjer inden for molekylærbiologi, genetik, biokemi og biovidenskab. Plasmider, der er kendt som vektorer inden for genteknologi, bruges til at replikere eller udtrykke visse gener. Den målrettede ændring af en vektor kaldes vektordesign.
GFP-analyse i celleforskning
Grønt fluorescerende protein (GFP) er en alsidig biologisk markør til overvågning af fysiologiske processer, visualisering af proteinlokalisering og påvisning af transgen ekspression in vivo. GFP kan exciteres af 488 nm laserlinjen og detekteres optimalt ved 510 nm.

Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.