Plasmid Forberedelse ved hjælp af ultralydbehandling

Ultralydbehandling er en pålidelig teknik til at fragmentere plasmid-DNA. Præcist kontrollerbar amplitude, pulsationstilstand og temperaturregulering er de vigtigste funktioner i en ultralydsapparat til ikke-skadelig plasmidfragmentering. Derudover hjælper brugen af visse midler med at beskytte mod nedbrydning af plasmid. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til kontrolleret plasmidfragmentering fra enkelte hætteglas, samtidig sonikering af adskillige prøver samt plader med flere brønde. Lær mere om vellykket ultralyd plasmid fragmentering!

Anmodning om oplysninger




Bemærk vores Fortrolighedspolitik.


Ultralyd DNA fragmentering er en pålidelig og effektiv teknik, der almindeligvis anvendes i Next Generation Sekventering (NGS)

The UIP400MTP giver mulighed for præcist kontrolleret ultralydbehandling af plader med flere brønde. En af anvendelserne af UIP400MTP er fragmenteringen af plasmid-DNA for at opnå fragmenter af en specifikt målrettet længde.

Plasmidforskydning ved hjælp af ultralydbehandling

Når DNA-prøver udsættes for ultralydbølger, skaber de ultralydsgenererede vibrationer akustisk kavitation i væsken, der skærer eller bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt via mekaniske kræfter. Sonikering er den mest anvendte metode til bulk DNA-forskydningseksperimenter, herunder applikationer, såsom Kromatin Immunoprecipitation (ChIP), for hvilke små fragmentstørrelser er helt afgørende for at opnå høj opløsning. (jf. Tseng et al., 2012)
Plasmid DNA (pDNA) er en specifik form for DNA, der er kendetegnet ved sin ringform og findes i bakterier og nogle eukaryoter.
Supercoiled pDNA er den ønskede form for plasmid-DNA, da det viser de bedste resultater i nedstrømsprocesser såsom automatiseret sekventering og transfektion. Ultralydbehandling er velegnet til fragment pDNA, herunder supercoiled pDNA, med succes.
Thompson et al. (2008) demonstrerede, at plasmid sonikering, som er kendt for at fragmentere supercoiled DNA, er en effektiv måde at forbedre sekvens phred20 læselængder til det punkt, at de ikke er signifikant forskellige fra Beckman Coulters kontrolskabelon eller enzymatisk lineariserede plasmider.

Fordele ved ultralyd DNA fragmentering

  • Præcist styrbar
  • Reproducerbare resultater
  • Justerbar til at målrette DNA-fragmentlængder
  • temperaturkontrol
  • Skalerbar til enhver prøvestørrelse
Videoen viser ultralydsprøveforberedelsessystemet UIP400MTP, som giver mulighed for pålidelig prøveforberedelse af alle standard multi-brøndplader ved hjælp af højintensiv ultralyd. Typiske anvendelser af UIP400MTP omfatter celle lysis, DNA, RNA, og kromatin klipning samt proteinudvinding.

Ultralydsdronning UIP400MTP til multi-well plade sonikering

Anvendelse af plasmidvektorer

Plasmider bruges ofte som værktøjer til at klone, overføre og manipulere gener. Når plasmider anvendes eksperimentelt til disse formål, kaldes de vektorer. DNA-fragmenter eller gener kan indsættes i en plasmidvektor, hvilket skaber et såkaldt rekombinant plasmid. Plasmidvektorer bruges som køretøjer til at drive rekombinant DNA ind i en værtscelle og er en nøglekomponent i molekylær kloning.
“Ikke-virale vektorer undersøges grundigt for deres potentielle anvendelse i genterapi til behandling af forskellige komplicerede sygdomme. Ikke-virale vektorer beskytter plasmid-DNA mod fysisk, kemisk og enzymatisk nedbrydning og leverer DNA-molekylet til målstedet. For eksempel danner kationiske liposomer, chitosan og andre positivt ladede nanopartikler komplekser med plasmid-DNA gennem elektrostatiske interaktioner. Imidlertid er de let dannede kationiske liposomer / plasmid DNA-komplekser relativt store (dvs. 300-400 nm) og heterogene i naturen, hvilket gør dem vanskelige at anvende i farmaceutiske applikationer. De store og heterogene plasmid DNA / liposomer, plasmid DNA / aerosoler og plasmid DNA / peptider komplekser kan reduceres til mindre og homogene partikler ved hjælp af ultralydbehandling.” (Sarker et al., 2019)
Et fremtrædende eksempel på brugen af plasmidvektorer er CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9-systemet leveres typisk til celler som et enkelt stort plasmid eller flere mindre plasmider, der koder for en målsekvens, en CRISPR-guide og Cas9.

Ultralyd Forberedelse af DNA-belastede PLGA Nanopartikler ved Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) anvendte poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) for at danne en nanopartikelbærer til levering af en model CRISPR-Cas9-plasmid i primære knoglemarvsafledte makrofager. Til nanofældning af PLGA nanopartikler blev PLGA med to forskellige endegrupper (ester- og amingrupper) anvendt med det formål, at de positivt ladede amin-endehætter øger indkapslingseffektiviteten og belastningen på grund af ladningsinteraktionerne mellem den og DNA'ets negativt ladede rygrad. I et 50 ml polypropylen konisk centrifugerør blev 100 mg Pluronic F127 opløst i 20 ml autoklaveret DI-vand ved hvirvelblanding efterfulgt af 30 minutters blid sonikering ved hjælp af et ultralydsbad (se CupHorn). En autoklaveret magnetisk omrøringsstang blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved 600 rpm i 30 minutter, mens de andre opløsninger blev fremstillet. Plastlabware blev brugt i stedet for glasvarer overalt for at minimere uspecifik adsorption af DNA. Opløsninger af PLGA opløst i DMF (44,48 mg/ml) og TIPS-pentacen opløst i THF (0,667 mg/ml) blev fremstillet separat. PLGA blev efterladt stille til våd i DMF i 30 minutter, før den blev sonikeret i 30 min. (for fuld protokol se Jo et al., 2020)

Relaterede applikationer:

  • Ekstraktion af DNA
  • Indkapsling af DNA
  • Spredning af nanopartikelbelagt DNA
  • Levering af plasmid-DNA i celler
UP200St TD_CupHorn til indirekte sonikering af prøver

UP200St CupHorn til indirekte sonikering af prøver, fx til DNA-ekstraktion og fragmentering.

Anmodning om oplysninger




Bemærk vores Fortrolighedspolitik.


Plasmid DNA-beskyttelse under sonikering

DNA, herunder plasmider og superspolerede plasmider, er meget følsom nedbrydning. Alle tilgængelige fragmenteringsmetoder er kendt for visse ulemper. Ultralyd DNA-fragmentering er en af de foretrukne metoder, da kontrolleret sonikering i kombination med beskyttelsesforanstaltninger gør det muligt at reducere forskydnings- og varmeinduceret beskadigelse af DNA-strenge.
Udover indstillinger for lav amplitude, pulseringstilstand og temperaturregulering under ultralyd DNA-forskydning viste brugen af visse midler signifikant beskyttende virkning mod DNA-nedbrydning. For eksempel beskytter forskellige polymerer, peptider og lipider plasmid-DNA'et under ultralydbehandling.

Ioniske væsker kan beskytte plasmid-DNA mod skader under sonikering.

Stabiliteten af plasmid-DNA og plasmid-DNA / IL-nanokomplekser mod ultralydforskydningsstress blev undersøgt ved hjælp af agarosegelelektroforeseassay. Både plasmid-DNA og plasmid-DNA / IL-nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsstress i forskellige tidspunkter. Plasmid-DNA'et blev udsat for ultralydsforskydningsstress i 0, 10, 20, 30 og 40 minutter. Imidlertid blev plasmid DNA / IL nanokomplekser udsat for ultralydsforskydningsstress i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter.
(studie og billede: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) viste, at når plasmid-DNA / ionisk væske (pDNA / IL) nanostrukturer blev udsat for ultralydsforskydningsstress for 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutter og kompleksiseret med det kommercielt tilgængelige kationiske genleveringsmiddel lipofectamin, var procentdelen af fluorescerende positive celler 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, Henholdsvis 65 % og 50 % (se figur nedenfor). Procentdelen af fluorescerende positive celler steg, når nanostrukturerne blev udsat for ultralydsforskydningsstress i 10 og 20 minutter og derefter faldt langsomt.

Ultralydfragmentering af plasmid-DNA

Indflydelse af ionisk væske [Bmim][PF6] på levering af plasmid-DNA til COS7-celler. Plasmid DNA / IL (ionisk væske) nanokomplekser blev udsat for ultralydsforskydningsstress i op til 120 minutter og kompleksiseret med LA, før de leverede til COS7-celler. Dataene viser det gennemsnitlige antal (%) af GFP-positive HeLa-celler talt i 10 forskellige mikroskopiske felter, og eksperimentet blev udført flere gange på tre forskellige dage. (Undersøgelse og diagram: ©Sarker et al., 2019)

Plasmid DNA kan beskyttes ved at tilføje et middel før ultralydsfragmentering.

Plasmid DNA kan beskyttes ved at tilføje et middel før ultralydsfragmentering: Sonikering-induceret nedbrydning af nøgen pDNA (A) og af pDNA formuleret med 1,5 mM CaCl2 og 20% (v / v) t-butanol (B)
Prøver blev sonikeret med en 20W sonde i op til 120'erne, som angivet på toppen af hver bane. Bane H svarer til Hyperladder I-markøren ™️. OC- og SC-plasmidbåndene er angivet.
(undersøgelse og billeder: ©Wu et al., 2009)

Ultralyd lysat forberedelse

Ultralyd celle lysis protokol
Ultralydsenhed UP200Ht med mikrotip S26d2 til ultralyd lysis af biologiske prøverStart med en beriget prøve af celler, der blev fremstillet via en celleseparationsmetode (f.eks. Immunomagnetisk celleseparation, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscelleisolering).
Celleprøverne skal vise et volumen af en lysisbuffer, der er passende for det eksperimentelle mål og sonde-type ultralydsapparat.
Hypotoniske buffere foretrækkes, da de forbedrer ultralydscellelyse. Det er vigtigt, at tilsætningsstoffer og saltkoncentration anvendes på en passende måde.
Vælg din ultralydslyseenhed: Til indirekte sonikering af hætteglas anbefales VialTweeter eller CupHorn. For multiwell-plader er UIP400MTP den ideelle ultralydsapparat. Og klassisk sonde-type sonikering, en ultralyd homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikro-tip er mest egnede.
Protokol til sonde-type sonikering: Placer ultralydsonden i prøvevolumenet i et mikrocentrifugerør og sonikere i ca. 10 sekunder. Afhængigt af DNA-prøven kan sonikeringen gentages en eller to gange mere. Den krævede ultralyd energi input (Ws / ml) afhænger af prøvens viskositet og DNA-type. Køling via isbad og pulsationstilstand af ultralydsapparatet hjælper med at forhindre, at prøven er termisk nedbrudt.
Efter ultralydslyse centrifugeres prøven for at adskille pelletsaffald (indeholdende ulysede celler, kerner og uinlyserede organeller)
Hvis prøven ikke straks behandles yderligere, kan den opbevares ved en passende temperatur for at bevare dens levedygtighed.

Ultralydapparater til DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til DNA, RNA og kromatinfragmentering. Disse forskellige platforme omfatter ultralydsonder (sonotoder), indirekte sonikeringsopløsninger til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multibrøndplader (f.eks. 96-brøndsplader, mikrotiterplader), sonoreactors og ultralyd cuphorns. Alle platforme til DNA-klipning drives af frekvenstunede, højtydende ultralydsprocessorer, som netop kan styres og giver reproducerbare resultater.

Ultralydsprocessorer til et vilkårligt prøvenummer og -størrelse

Med Hielscher's multi-sample ultralydapparater VialTweeter (for op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader / multiwell plader) bliver det let muligt at reducere prøvebehandlingstiden på grund af intens og præcist kontrollerbar ultralydbehandling, samtidig med at man opnår den ønskede DNA-fragmentstørrelsesfordeling og udbytte. Ultralyd DNA-fragmentering gør plasmidforberedelsestrin effektive, pålidelige og skalerbare. Protokoller kan skaleres lineært fra en til adskillige prøver ved at anvende konstante ultralydsparametre.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultralyd multi-prøve forberedelse enhed VialTweeter giver mulighed for samtidig sonikering af op til 10 hætteglas. Med klemme-on enheden VialPress, kan op til 4 ekstra rør presses til fronten for intens sonikering.

præcis kontrol proces

Hielscher ultralydapparater kan fjernstyres via browserkontrol. Sonikeringsparametre kan overvåges og justeres præcist til proceskravene.Præcis kontrollerbare sonikeringsindstillinger er afgørende, da udtømmende sonikering kan ødelægge DNA, RNA og kromatin, men utilstrækkelig ultralydsskæring resulterer i for lange DNA- og kromatinfragmenter. Hielschers digitale ultralydsapparater kan nemt indstilles til præcis sonikeringsparameter. Specifikke sonikeringsindstillinger kan også gemmes som programmeret indstilling for hurtig gentagelse af den samme procedure.
Al sonikering registreres automatisk og gemmes som CSV-fil på et indbygget SD-kort. Dette giver mulighed for nøjagtig dokumentation af udførte forsøg og gør det nemt at revidere sonikeringskørsler.
Via browser fjernbetjening, kan alle digitale ultralydsapparater betjenes og overvåges via enhver standard browser. Installation af yderligere software er ikke påkrævet, da LAN-forbindelsen er en meget enkel plug-n-play-installation.

Højeste brugervenlighed under ultralyd DNA forberedelse

Alle Hielscher ultralydsapparater er designet til at levere ultralyd med høj ydeevne, samtidig med at de altid er meget brugervenlige og nemme at betjene. Alle indstillinger er velstrukturerede i en klar menu, som let kan tilgås via farvet touch-display eller browser fjernbetjening. Den smarte software med programmerbare indstillinger og automatisk dataregistrering sikrer optimale sonikeringsindstillinger for pålidelige og reproducerbare resultater. Den rene og brugervenlige menugrænseflade forvandler Hielscher-ultralydsapparater til brugervenlige og effektive enheder.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores lab ultralydapparater til cellelyse og DNA-fragmentering:

Batch Volumen Strømningshastighed Anbefalede enheder
plader med flere brønde Nielsen UIP400MTP
hætteglas, lille bægerglas Nielsen Ultralyd CupHorn
op til 10 hætteglas Nielsen VialTweeter
1 til 500 ml 10 til 200 ml / min UP100H
10 til 2000 ml 20 til 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St

Kontakt os! / Spørg Os!

Bed om mere information

Brug venligst nedenstående formular til at anmode om yderligere oplysninger om ultralydshomogenisatorer til DNA-ekstraktion og fragmentering, applikationsprotokoller og priser. Vi vil med glæde diskutere din proces med dig og tilbyde dig et ultralydssystem, der opfylder dine krav!









Bemærk venligst, at vores Fortrolighedspolitik.




Litteratur / Referencer

Fakta Værd at vide

Hvad er plasmider?
Et plasmid er et lille cirkulært DNA-molekyle, der er fysisk adskilt fra kromosomalt DNA og replikerer uafhængigt. Plasmider er ofte forbundet med gener, der bidrager til en organismes overlevelse og giver specifikke fordele, f.eks. antibiotikaresistens. Plasmider findes oftest som små cirkulære, dobbeltstrengede DNA-molekyler i bakterier; plasmider er dog undertiden til stede i arkæer og eukaryote organismer. Plasmider er vigtige værktøjer inden for molekylærbiologi, genetik, biokemi og biovidenskab. Kendt som vektorer i genteknologi bruges plasmider til at replikere eller udtrykke visse gener. Den målrettede ændring af en vektor kaldes vektordesign.

GFP-analyse i celleforskning
Grønt fluorescerende protein (GFP) er en alsidig biologisk markør til overvågning af fysiologiske processer, visualisering af proteinlokalisering og påvisning af transgen ekspression in vivo. GFP kan ophidses af 488 nm laserlinjen og detekteres optimalt ved 510 nm.


Højtydende ultralyd! Hielschers produktsortiment dækker hele spektret fra den kompakte lab ultralydsprocessor over bench-top enheder til fuldindustrielle ultralydssystemer.

Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralyd homogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.