Cellelyse af BL21-celler ved ultralydbehandling
BL21-celler er en stamme af E. coli, der er meget udbredt i forskningslaboratorier, bioteknologi og industriel produktion på grund af deres evne til at udtrykke proteiner meget effektivt. Ultralydscelleforstyrrelse, lysis og proteinekstraktion er den almindelige metode til at isolere og indsamle de målrettede proteiner fra det cellulære indre af BL21-celler. Ultralydbehandling forstyrrer cellen fuldstændigt og frigiver alle indespærrede proteiner, hvilket gør 100% af proteinet tilgængeligt.
BL21-celler til proteinekspression
BL21-celle er en kemisk kompetent E. coli-bakteriestamme, der er velegnet til transformation og proteinekspression på højt niveau ved hjælp af et T7 RNA-polymerase-IPTG-induktionssystem. BL21-celler tillader højeffektiv proteinekspression af ethvert gen, der er under kontrol af en T7-promotor. E. coli-stammen BL21(DE3) er en T7 RNA-polymerase-baseret proteinproduktionsstamme kombineret med T7-promotorbaserede ekspressionsvektorer og anvendes i vid udstrækning i laboratorier og industri til fremstilling af rekombinante proteiner. I BL21(DE3) transskriberes ekspressionen af genet, der koder for det rekombinante protein, af den kromosomalt kodede T7 RNA-polymerase (T7 RNAP), som transskriberer otte gange hurtigere end konventionelt E. coli RNAP. Dette gør stammen BL21(DE3) meget effektiv og gør den til et af de mest foretrukne proteinekspressionscellesystemer.
Protokol for ultralydslyse og proteinekstraktion fra BL21-celler
Cellelyse af BL21-celler udføres for det meste ved hjælp af ultralydbehandling i kombination med natriumlaurylsarcosinat (også kendt som sarkosyl) som lysbuffer. Fordelene ved ultralydscelleafbrydelse og proteinekstraktion ligger i pålideligheden, reproducerbarheden samt enkel, sikker og hurtig betjening af ultralydapparater. Protokollen nedenfor giver en trin-for-trin retning for ultralyd BL21-cellelyse:
- For at fjerne chaperonproteinerne blev BL21-bakteriepiller resuspenderet i 50 ml iskold natrium-Tris-EDTA (STE) buffer (bestående af 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl suppleret med 100 mM PMSF).
- De 500 ul lysozym (10 mg/ml) tilsættes, og cellerne inkuberes på is i 15 minutter.
- Derefter tilsættes 500 ul DTT og 7 ml sarkosyl (10 % (w/v) opgjort i STE-buffer).
- Det er vigtigt at holde alle rensningsbuffere iskolde og at holde prøverne på is hele tiden. Alle rensningstrin skal udføres i kølerummet, hvis det er muligt.
- Til ultralydslyse og proteinekstraktion sonikeres prøverne i VialTweeter MultiSample Ultralydsapparat i 4 x 30 sek ved 100% amplitude med et 2 minutters interval mellem hver sonikering. Alternativt en sonde-type ultralydshomogenisator med mikrospids f.eks. UP200Ht med S26d2 (3 x 30 sek., 2 min. pause mellem ultralydscyklusser, 80% amplitude) kan bruges.
- Ved yderligere rensningstrin skal prøverne opbevares på is eller alternativt opbevares ved -80 °C indtil videre forarbejdning.
Ultralyd celle disruptor UP200St med mikrospids S26d2 til lysis og proteinekstraktion
Ultralydslysis under forudgående temperaturkontrol
Den præcise og pålidelige temperaturkontrol er afgørende ved håndtering af biologiske prøver. Høje temperaturer initierer termisk induceret proteinnedbrydning i prøver.
Som alle mekaniske prøveforberedelsesteknikker skaber sonikering varme. Temperaturen på prøverne kan dog kontrolleres godt, når du bruger VialTweeter. Vi præsenterer dig for forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen på dine prøver, mens du forbereder dem med VialTweeter og VialPress til analyse.
- Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydsprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med en intelligent software og en tilsluttelig temperatursensor. Sæt temperatursensoren i UP200St, og indsæt spidsen af temperatursensoren i et af sample rør. Via digitalt farvet berøringsdisplay kan du indstille i menuen på UP200St et specifikt temperaturområde for din sample sonikering. Ultralydsapparatet stopper automatisk, når den maksimale temperatur er nået, og holder pause, indtil sample temperaturen er nede til den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
- VialTweeter-blokken kan forkøles. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også forkøles.
- Brug tøris til at afkøle under sonikering. Brug en lav bakke fyldt med tøris, og placer VialTweeteren på isen, så varmen hurtigt kan forsvinde.
Kunder over hele verden bruger VialTweeter og VialPress til deres daglige prøveforberedelsesarbejde i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Den intelligente software og temperaturstyring af UP200St-processoren, temperaturen kontrolleres pålideligt og varmeinduceret prøvenedbrydning undgås. Ultralydsprøveforberedelse med VialTweeter og VialPress giver meget pålidelige og reproducerbare resultater!
Find den optimale ultralydsforstyrrer til din lysisapplikation
Hielscher Ultrasonics er mangeårig erfaren producent af højtydende ultralydscelleforstyrrere og homogenisatorer til laboratorier, bordplade og industrielle skalasystemer. Din bakterielle cellekulturstørrelse, dit forsknings- eller produktionsmål og mængden af celle, der skal behandles pr. time eller dag, er vigtige faktorer for at finde den rigtige ultralydscelleforstyrrer til din applikation.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til samtidig sonikering af multiprøver (op til 10 hætteglas med VialTweeter) og masseprøver (dvs. mikrotiterplader / ELISA-plader med UIP400MTP) samt den klassiske sonde-type laboratorie-ultralydsapparat med forskellige effektniveauer fra 50 til 400 watt til fuldt industrielle ultralydsprocessorer med op til 16.000 watt pr. Enhed til kommerciel celleafbrydelse og proteinekstraktion i stor produktion. Alle Hielscher ultralydapparater er bygget til 24/7/365 drift under fuld belastning. Robusthed og pålidelighed er kernefunktioner i vores ultralydsenheder.
Alle digitale ultralydshomogenisatorer er udstyret med smart software, farvet berøringsdisplay og automatisk dataprotokol, som gør ultralydsenheden til et praktisk arbejdsredskab i laboratorie- og produktionsfaciliteter.
Fortæl os, hvilken slags celler, hvilken volumen, med hvilken frekvens og med hvilket mål du skal behandle dine biologiske prøver. Vi vil anbefale dig den bedst egnede ultralydscelleforstyrrer til dine proceskrav.
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssystemer fra kompakte håndholdte homogenisatorer og MultiSample ultralydsapparater til industrielle ultralydsprocessorer til kommercielle applikationer:
| Batch volumen | Flowhastighed | Anbefalede enheder |
|---|---|---|
| 96-brønds / mikrotiterplader | n.a. | UIP400MTP |
| 10 hætteglas à 0,5 til 1,5 ml | n.a. | VialTweeter på UP200St |
| 001 til 250 ml | 5 til 100 ml/min | UP50H |
| 001 til 500 ml | 10 til 200 ml/min | UP100H |
| 10 til 2000 ml | 20 til 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 til 20L | 0.2 til 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 til 100L | 2 til 10 l/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 til 100 l/min | UIP16000 |
| n.a. | Større | klynge af UIP16000 |
Kontakt os! / Spørg os!
UIP400MTP plade sonicator til celleafbrydelse med høj kapacitet i 96-brønds plader
ultralydsapparat UP200Ht med 2 mm mikrotip S26d2 til sonikering af små prøver
Læs mere om, hvordan du kan bruge din ultralydsvævshomogenisator til effektiv og pålidelig fremstilling af bufferopløsninger!
Fakta, der er værd at vide
Escherichia coli-bakterier
Escherichia coli er en bakterietype, der er ikke-sporedannende, gramnegativ og er kendetegnet ved sin form af en lige stang. E.coli-bakterier er til stede i miljøet, fødevarer og tarme hos mennesker og dyr. E. coli er normalt bevægelig ved brug af peritrichous flageller, men der er også ikke-bevægelige typer. E.coli er såkaldte fakultativt anaerobe kemoorganotrofe organismer, hvilket betyder, at de er i stand til både respiratorisk og fermentativ metabolisme. De fleste E.coli-typer er godartede og opfylder nyttige funktioner i kroppen, f.eks. at undertrykke væksten af skadelige bakteriearter, syntetisere vitaminer osv.
Escherichia coli-bakterieceller af den såkaldte B-type er en særlig kategori af E.coli-stammer, som er meget udbredt i forskning til at undersøge mekanismer som bakteriofagfølsomhed eller restriktionsmodifikationssystemer. Desuden er E.coli-bakterier værdsat som en pålidelig arbejdshest til proteinekspression i bioteknologiske og biovidenskabelige laboratorier. For eksempel bruges E.coli til at syntetisere forbindelser som proteiner og oligosaccharider i industriel skala. På grund af specifikke egenskaber som proteasemangel, lav acetatproduktion ved et højt niveau af glukose og forbedret permeabilitet er E. coli B-celler de hyppigst anvendte værtsceller til produktion af genetisk modificerede proteiner.
Rekombinant protein
Rekombinante proteiner (rProt) får betydelig betydning i mangfoldige grene, herunder inden for kemisk produktion, farmaceutisk, kosmetisk, human- og dyremedicin, landbrug, fødevarer samt affaldsbehandlingsindustrier.
Produktionen af rekombinant protein kræver brug af et ekspressionssystem. Som udtrykscellesystemer til produktion af rekombinant DNA kan både prokaryote og eukaryote celler anvendes. Mens bakterieceller er mest udbredt til proteinekspression på grund af faktorer som lave omkostninger, nem skalerbarhed og enkle medieforhold, er pattedyr, gær, alger, insekter og cellefrie systemer etablerede alternativer. Proteintypen, den funktionelle aktivitet samt det krævede udbytte af udtrykt protein påvirker udvælgelsen af det cellesystem, der anvendes til proteinekspression.
For at udtrykke rekombinant protein skal en bestemt celle transfekteres med en DNA-vektor, der indeholder skabelonen for rekombinant DNA. De celler, der transfekteres med skabelonen, dyrkes derefter. Som en konsekvens af den cellulære mekanisme transskriberer og oversætter cellerne proteinet af interesse og producerer derved det målrettede protein.
Da de udtrykte proteiner er fanget i den cellulære matrix, skal cellen lyseres (forstyrres og brydes) for at frigive proteinerne. I et efterfølgende oprensningstrin adskilles og renses proteinet.
Det første rekombinante protein, der blev anvendt i behandlingen, var rekombinant humant insulin i 1982. I dag produceres mere end 170 typer rekombinant protein på verdensplan til medicinske behandlinger. Almindeligt anvendte rekombinante proteiner, der anvendes i medicin, er f.eks. rekombinante hormoner, interferoner, interleukiner, vækstfaktorer, tumornekrosefaktorer, blodkoagulationsfaktorer, trombolytiske lægemidler og enzymer til behandling af større sygdomme som diabetes, dværgvækst, myokardieinfarkt, kongestiv hjertesvigt, cerebral apopleksi, multipel sklerose, neutropeni, trombocytopeni, anæmi, hepatitis, leddegigt, astma, Crohns sygdom og kræftbehandlinger. (jf. Phuc V. Pham, i Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Litteratur / Referencer
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter soniker til samtidig sonikering af 10 prøver, f.eks. for at forstyrre BL21-celler
Højtydende ultralyd! Hielschers produktsortiment dækker hele spektret fra den kompakte laboratorieultralydsapparat over bordenheder til fuldindustrielle ultralydssystemer.