Cellelyse af BL21-celler ved ultralyd

BL21-celler er en stamme af E. coli, der anvendes i vid udstrækning i forskningslaboratorier, bioteknologi og industriel produktion på grund af deres evne til at udtrykke proteiner meget effektivt. Celleopbrydning, lyse og proteinekstraktion med ultralyd er den almindelige metode til at isolere og opsamle målproteinerne fra BL21-cellernes indre. Ultralydsbehandling opbryder cellen fuldstændigt og frigiver alle indkapslede proteiner, så 100% af proteinet bliver tilgængeligt.

BL21-celler til proteinekspression

BL21 er en kemisk kompetent E. coli-bakteriestamme, der er velegnet til transformation og proteinekspression på højt niveau ved hjælp af et T7 RNA-polymerase-IPTG-induktionssystem. BL21-celler muliggør højeffektiv proteinekspression af ethvert gen, der er under kontrol af en T7-promotor. E. coli-stammen BL21(DE3) er en T7 RNA-polymerasebaseret proteinproduktionsstamme, som kombineres med T7-promotorbaserede ekspressionsvektorer og anvendes i vid udstrækning i laboratorier og industrien til at producere rekombinante proteiner. I BL21(DE3) transskriberes ekspressionen af det gen, der koder for det rekombinante protein, af den kromosomalt kodede T7 RNA-polymerase (T7 RNAP), som transskriberer otte gange hurtigere end konventionel E. coli RNAP. Dette gør stammen BL21(DE3) yderst effektiv og til et af de mest foretrukne cellesystemer til proteinekspression.

Protokol for ultralydslyse og proteinekstraktion fra BL21-celler

Cellelyse af BL21-celler udføres oftest ved hjælp af ultralydsbehandling i kombination med natriumlauroylsarcosinat (også kendt som sarkosyl) som lysebuffer. Fordelene ved celleopbrydning og proteinekstraktion med ultralyd ligger i pålideligheden, reproducerbarheden samt den enkle, sikre og hurtige betjening af ultralydsapparater. Protokollen nedenfor giver en trinvis vejledning i ultralydslyse af BL21-celler:

• For at fjerne chaperonproteinerne blev BL21-bakteriepellets resuspenderet i 50 ml iskold natrium-Tris-EDTA-buffer (STE) (bestående af 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl tilsat 100 mM PMSF).
• Derefter tilsættes 500 ul lysozym (10 mg/ ml), og cellerne inkuberes på is i 15 min.
• Efterfølgende tilsættes 500 ul DTT og 7 ml sarkosyl (10% (w/v) fremstillet i STE-buffer).
• Det er afgørende at holde alle oprensningsbuffere iskolde og holde prøverne på is hele tiden. Alle oprensningstrin bør om muligt udføres i kølerummet.



• Til ultralydslyse og proteinekstraktion sonikeres prøverne i VialTweeter MultiSample Ultrasonicator i 4 x 30 sek. ved 100% amplitude med et interval på 2 min mellem hver sonikering. Alternativt kan en ultralydshomogenisator af probetypen med mikrospids, f.eks. UP200Ht med S26d2 (3 x 30 sek., 2 min. pause mellem ultralydscyklusserne, 80% amplitude), anvendes.
• Til yderligere oprensningstrin skal prøverne holdes på is eller alternativt opbevares ved -80°C indtil videre behandling.

Ultralydslyse under præcis temperaturkontrol

Præcis og pålidelig temperaturkontrol er afgørende ved håndtering af biologiske prøver. Høje temperaturer igangsætter termisk induceret proteinnedbrydning i prøverne.
Som alle mekaniske teknikker til prøveforberedelse udvikler sonikering varme. Prøvernes temperatur kan dog kontrolleres godt ved brug af VialTweeter. Vi præsenterer forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen i dine prøver, mens du forbereder dem til analyse med VialTweeter og VialPress.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydsprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med intelligent software og en temperaturføler, der kan tilsluttes. Tilslut temperaturføleren til UP200St, og før temperaturfølerens spids ind i et af prøverørene. Via den digitale farveberøringsskærm kan du i menuen på UP200St indstille et bestemt temperaturområde for sonikeringen af dine prøver. Ultralydsapparatet stopper automatisk, når den maksimale temperatur nås, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er faldet til den nedre værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. Blokken til VialTweeter kan forkøles. Sæt blokken til VialTweeter (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titanblokken, hvilket hjælper med at forsinke temperaturstigningen i prøven. Om muligt kan selve prøven også forkøles.
3. Brug tøris til køling under sonikering. Brug en lav bakke fyldt med tøris, og anbring VialTweeter på isen, så varmen hurtigt kan afledes.

Kunder over hele verden bruger VialTweeter og VialPress til deres daglige prøveforberedelse i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Med den intelligente software og temperaturkontrol i processoren UP200St styres temperaturen pålideligt, og varmeinduceret nedbrydning af prøverne undgås. Prøveforberedelse med ultralyd ved hjælp af VialTweeter og VialPress giver yderst pålidelige og reproducerbare resultater!
 

Find den optimale ultralydscelleopbryder til din lyseanvendelse

Hielscher Ultrasonics er en producent med mange års erfaring inden for højtydende ultralydscelleopbrydere og homogenisatorer til laboratorier, bordmodeller og systemer i industriel skala. Størrelsen af din bakteriecellekultur, dit forsknings- eller produktionsmål og mængden af celler, der skal behandles pr. time eller dag, er afgørende faktorer for at finde den rette ultralydscelleopbryder til din anvendelse.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til samtidig sonikering af flere prøver (op til 10 hætteglas med VialTweeter) og store antal prøver (dvs. mikrotiterplader / ELISA-plader med UIP400MTP) samt det klassiske ultralydsapparat af probetypen til laboratorier med forskellige effektniveauer fra 50 til 400 watt og ultralydsprocessorer til fuld industriel anvendelse med op til 16.000watt pr. enhed til kommerciel celleopbrydning og proteinekstraktion i storskalaproduktion. Alle ultralydsapparater fra Hielscher er bygget til drift 24/7/365 under fuld belastning. Robusthed og pålidelighed er centrale egenskaber ved vores ultralydsapparater.
Alle digitale ultralydshomogenisatorer er udstyret med smart software, farveberøringsskærm og automatisk datalogning, som gør ultralydsapparatet til et praktisk arbejdsredskab i laboratorier og produktionsanlæg.
Fortæl os, hvilken type celler, hvilket volumen, hvor ofte og med hvilket mål du skal behandle dine biologiske prøver. Vi anbefaler den ultralydscelleopbryder, der er bedst egnet til dine proceskrav.

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssystemer fra kompakte håndholdte homogenisatorer og MultiSample Ultrasonicators til industrielle ultralydsprocessorer til kommercielle anvendelser:

Litteratur / Referencer

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.