Ultralydslyse af Drosophila melanogaster-prøver

Drosophila melanogaster er meget udbredt i laboratorier som modelorganisme. Derfor skal præanalytiske præparationstrin såsom lysis, celleforstyrrelse, proteinekstraktion og DNA-klipning af Drosophila melanogaster-prøver udføres hyppigt. Ultralydsdismembratorer er pålidelige og effektive og kan bruges til at udføre forskellige opgaver såsom lysis, proteinekstraktion eller DNA-fragmentering med lethed ved kun at justere ultralydsprocesparametre. Ultralydshomogenisatorer er derved fleksible værktøjer med en bred vifte af anvendelser.

Ultralydslyse og proteinekstraktion

Lysis, celleopløselighed, vævshomogenisering og proteinekstraktion er typiske opgaver for ultralydsdismembratorer i biologiske laboratorier. Ultralydsdismembratorer og celleforstyrrende stoffer er velegnede til at homogenisere dyrevæv, insekter (f.eks. Drosophila melanogaster, C. elegans) eller planteprøver. Efterfølgende anvendelser af ultralydbehandling er lysering af cellesuspensioner og pellets samt ekstraktion af intracellulære proteiner.
Ultralydslyse og proteinekstraktion er meget pålidelige og reproducerbare processer, som kan udføres på grundlag af etablerede protokoller. Da ultralydsprocesintensiteten kan justeres nøjagtigt via sonikeringsparametre såsom amplitude, cyklus / pulstilstand, temperatur og prøvevolumen, kan når de er bevist, kan protokoller gentages med det samme resultat igen og igen.

Ultralyds-DNA og RNA-fragmentering

Efter cellelyse og proteinekstraktion er et almindeligt påkrævet trin i prøveforberedelsen klipning og fragmentering af DNA, RNA og kromatin, f.eks. før kromatinimmunpræcipitation (ChIP). DNA- og RNA-fragmentering kan pålideligt opnås ved at bryde de kovalente bindinger, der holder DNA'et sammen af fysiske kræfter. Ved hjælp af fysisk klipning, såsom sonikering, brydes først DNA-strengene, derefter fragmenteres DNA'et i mindre stykker.
Ultralyd DNA-fragmentering er pålidelig og effektiv til at klippe DNA til en målrettet længde, f.eks. 500bp (basepar). De største fordele ved ultralyds-DNA-fragmentering inkluderer den præcise kontrol af ultralydsprocesparametrene og intensiteten. Ultralydsprocesparametrene kan justeres ved at indstille sonikeringsintensitet, cyklusser og tid præcist. Dette gør det muligt at skabe ønskede DNA-størrelser, og den målrettede DNA-længde kan pålideligt produceres såvel som reproduceres. Ultralyd DNA-klipning er også ideel til at skabe DNA-fragmenter med høj molekylvægt.

Protokoller til ultralydslyse af Drosophila melanogaster

Nedenfor kan du finde forskellige protokoller for ultralydassisteret lys, proteinekstraktion og DNA- eller kromatinfragmentering af Drosophila-prøver.

Ultralydslyse til tværbindende immunpræcipitation (CLIP) analyse

CLIP-analyse blev udført som tidligere rapporteret med nogle ændringer. Ca. 20 mg æggestokke fra 0 til 1 dag gamle vildtypehunner blev UV-tværbundet (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseret på is i 1 ml RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccharose, 1 mM DTT, 1× EDTA-fri komplette proteasehæmmere, 1 mM PMSF) suppleret med 300 U RNAseOUT og placeret på is i 30 minutter. Homogenatet blev sonikeret på is, ved 80% effekt, fem gange i 20 s udbrud med en 60 s hvile imellem ved hjælp af Hielscher ultralydsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) og centrifugeret (16000 × g i 5 minutter ved 4 °C). Opløseligt ekstrakt blev forclearet med 20 μl Protein-G dynaperler i 20 minutter ved 4°C. Efter fjernelse af prøver til immunoblotting og kvantificering af RNA-input (1 %) blev HP1 immunpræcipiteret med anti-HP1 9A9-antistof fra 450 μl præclearet ekstrakt ved inkubation i 4 timer med 50 μl Protein-G dynabeads. Immunpræcipitater blev vasket 4 gange med RCB. For at eluere de immunpræcipiterede RNA'er blev de pelleterede perler kogt i 100 μL UltraPure DEPC-behandlet vand i 5 min. 900 μL Qiazol-reagens blev tilsat supernatanten genfundet til RNA-præparation. Det oprensede RNA blev brugt som en skabelon til at syntetisere cDNA ved hjælp af oligo dT, tilfældige hexamere og SuperScript revers transkriptase III i henhold til producentens protokol.
(Cassale et al. 2019)

Ultralydslyse til kromatinimmunudfældningsanalyse

Kromatinimmunpræcipitation blev udført efter den metode, der er beskrevet af Menet med mindre modifikationer. Ca. 20 mg æggestokke fra 0- til 1-dag gamle vildtypehunner blev homogeniseret i 1 ml NEB-buffer (10 mM HEPES-Na ved pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na ved pH 8, 0,5 mM EDTA-Na ved pH 8, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-fri komplette proteasehæmmere) med en homogenisator / nedsænkningsdispergor 1 min (ved 3000 rpm). Homogenatet blev overført til en forkølet glasdunkel, og 15 fulde slag blev påført med en stram støder. Frie kerner blev derefter centrifugeret ved 6000xg i 10 minutter ved 4°C. De kerneholdige pellets blev resuspenderet i 1 ml NEB og centrifugeret ved 20000 × g i 20 minutter på saccharosegradient (0,65 ml 1,6 M saccharose i NEB, 0,35 ml 0,8 M saccharose i NEB). Pelleten blev resuspenderet i 1 ml NEB og formaldehyd til en endelig koncentration på 1 %. Kerner blev tværbundet i 10 minutter ved stuetemperatur og slukket ved tilsætning af 1/10 vol 1.375 M glycin. Kernerne blev indsamlet ved centrifugering ved 6000 × g i 5 min. Kerner blev vasket to gange i 1 ml NEB og resuspenderet i 1 ml lysisbuffer (15 mM HEPES-Na ved pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ved pH 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % Na deoxycholat, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroylsarcosin og 1× EDTA-fri komplette proteasehæmmere). Kerner blev sonikeret ved hjælp af en Hielscher ultralydsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) seks gange i 20 s på og 1 min på is. Sonikerede kerner blev centrifugeret ved 13000 × g i 4 minutter ved 4 °C. Størstedelen af sonikeret kromatin var 500 til 1000 basepar (bp) i længden. For hver immunpræcipitation blev 15 μg kromatin inkuberet i nærvær af 10 μg HP1 9A9 monoklonalt antistof (3 timer ved 4 °C i et roterende hjul). Derefter blev 50 μl dynabeads protein G tilsat, og inkubationen blev fortsat natten over ved 4°C. Supernatanterne blev kasseret, og prøverne blev vasket to gange i Lysis Buffer (hver vask 15 minutter ved 4 °C) og to gange i TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ved pH 8). Kromatin blev elueret fra perler i to trin; først i 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ved pH 8) ved 65°C i 15 minutter, efterfulgt af centrifugering og genvinding af supernatanten. Perlemateriale blev genekstraheret i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det kombinerede eluat (200 μl) blev inkuberet natten over ved 65 °C for at vende tværbindinger og behandlet med 50 μg/ml RNaseA i 15 minutter ved 65 °C og med 500 μg/ml proteinase K i 3 timer ved 65 °C. Prøverne blev ekstraheret med phenol-chloroform og udfældet ethanol. DNA blev resuspenderet i 25 μl vand. For at maksimere de molekylære analyser med DNA immunudfældet, blev kandidatgener amplificeret parvis gennem en optimeret duplex-PCR-protokol ved at bruge to forskellige sæt primere med lignende smeltetemperaturer i en enkelt reaktion.
(Casale et al. 2019)
 

Højtydende ultralydscelleafbrydere til biologiske prøver

Hielscher Ultrasonics er din mangeårige partner, når det kommer til højtydende ultralydapparater til celleforstyrrelse, lysis, proteinekstraktion, DNA-, RNA- og kromatinfragmentering samt andre præanalytiske prøveforberedelsestrin. Hielscher tilbyder en omfattende portefølje af ultralydslaboratoriehomogenisatorer og prøveforberedelsesenheder og har den ideelle ultralydsenhed til din biologiske anvendelse og krav.
Klassisk sonde-type ultralydsapparat med mikrospids som f.eks. UP200St (200W; se billedet til venstre) eller en af ultralydsprøveforberedelsesenhederne VialTweeter eller UP200St_TD_CupHorn med VialHolder er foretrukne modeller i forsknings- og analyselaboratorier. Den klassiske ultralydssonde er ideel, når der tilberedes færre prøver skal lyseres, ekstraheres eller fragmenteres. Prøveforberedelsesenhederne VialTweeter og UP200St_TD_CupHorn giver mulighed for samtidig sonikering af henholdsvis op til 10 eller 5 hætteglas.
Hvis der skal behandles et stort antal prøver (f.eks. 96-brønds plader, mikrotiterplader osv.), UIP400MTP er den ideelle sonikeringsopsætning. UIP400MTP fungerer som en større kophorn, der er fyldt med vand og har plads nok til at rumme mikrobrøndplader. Drevet af en 400 watt kraftig ultralydsprocessor leverer UIP400MTP en meget ensartet og intens sonikering af multi-brøndplader for at forstyrre celler, lyse prøver, opløse pellets, ekstrahere proteiner eller forskydning af DNA.

Præcis styring via Smart Software

Alle Hielscher sonikeringsløsninger fra 200 watt og opefter er udstyret med en digital farveberøringsskærm og en intelligent software. Via den smarte dataprotokol gemmes alle ultralydsprocesparametre automatisk som CSV-fil på et indbygget SD-kort, så snart ultralydsapparatet startes. Dette gør forskning og protokol så meget mere bekvemt. Efter sonikeringsforsøgene eller prøveforberedelsen kan du blot gennemgå sonikeringsparametrene for hver sonikeringskørsel og sammenligne dem.
Via den intuitive menu kan adskillige parametre forudindstilles før sonikering: For eksempel for at kontrollere temperaturen i prøven og for at forhindre dens termiske nedbrydning kan en øvre grænse for prøvetemperatur indstilles. En pluggbar temperatursensor, der følger med ultralydsenheden, giver ultralydsprocessoren feedback om den faktiske sonikeringstemperatur. Når den øvre temperaturgrænse er nået, holder ultralydsenheden pause, indtil den nedre grænse for det indstillede ∆T er nået, og begynder derefter automatisk at sonikere igen.
Hvis sonikering med en bestemt energiindgang er påkrævet, kan du forudindstille den endelige ultralydsenergi for sonikeringskørslen. Ultralydspulsering og cyklustilstand kan naturligvis også indstilles individuelt.
For at genbruge dine mest succesrige sonikeringsparametre kan du gemme forskellige sonikeringstilstande (f.eks. Sonikeringstid, intensitet, cyklustilstand osv.) Som forudindstillede tilstande, så de let og hurtigt kan startes igen.
For mere betjeningskomfort kan alle digitale ultralydsenheder betjenes via browserfjernbetjening i enhver almindelig browser (f.eks. InternetExplorer, Safari, Chrome osv.). LAN-forbindelsen er en simpel plug-n-play-opsætning og kræver ingen yderligere softwareinstallation.
Vi hos Hielscher ved, at en vellykket sonikering af biologiske prøver kræver præcision og repeterbarhed. Derfor designede vi vores ultralydapparater som smarte enheder med alle funktioner, der muliggør en effektiv, pålidelig, reproducerbar og bekvem prøveforberedelse.

Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssystemer fra ultralydsmikrospidser og klassiske ultralydshomogenisatorer til MultiSample ultralydapparater til bekvem, pålidelig forberedelse af adskillige prøver: