Drosophila melanogaster er meget udbredt i laboratorier som model organisme. Derfor skal præanalyserede forberedelsestrin som lysis, celleforstyrrelser, proteinekstraktion og DNA-klipning af Drosophila melanogasterprøver ofte udføres. Ultralydsdismembratorer er pålidelige og effektive og kan bruges til at udføre forskellige opgaver som lysis, proteinudvinding eller DNA-fragmentering på lethed ved kun at justere ultralydsprocesparametre. Ultralyd homogenisatorer er dermed fleksible værktøjer med en bred vifte af applikationer.

Ultralydlysis og proteinekstraktion

Lysis, celleopløserisering, vævshomogenisering og proteinekstraktion er typiske opgaver for ultralyddismembratorer i biologiske laboratorier. Ultralyddisme og celleforstyrrende stoffer er velegnede til at homogenisere animalsk væv, insekter (f.eks. Drosophila melanogaster, C. elegans) eller planteprøver. Efterfølgende anvendelser af ultralydbehandling er lysis af celle suspensioner og pellets samt ekstraktion af intracellulære proteiner.
Ultralydlysis og proteinekstraktion er yderst pålidelige og reproducerbare processer, som kan udføres på grundlag af etablerede protokoller. Da ultralydsprocesintensiteten kan justeres nøjagtigt via sonikeringsparametre som amplitude, cyklus- og pulstilstand, temperatur og prøvevolumen, kan de afprøvede protokoller gentages med det samme resultat igen og igen.

Ultralyd-DNA og RNA-fragmentering

Efter celle lysis og proteinekstraktion er et almindeligt påkrævet trin i prøveforberedelsen klipning og fragmentering af DNA, RNA og chromatin, f.eks. før chromatin immunoprecipitation (ChIP). DNA- og RNA-fragmentering kan opnås pålideligt ved at bryde de kovalent bindinger, der holder DNA'et sammen af fysiske kræfter. Ved hjælp af fysisk klipning såsom sonikering, i første omgang DNA-strengene er brudt, så DNA er fragmenteret i mindre stykker.
Ultralyd DNA fragmentering er pålidelig og effektiv i klipning DNA til en målrettet længde, fx 500bp (base par). De store fordele ved ultralyd DNA fragmentering omfatter den præcise kontrol af ultralyd procesparametre og intensitet. Ultralydsprocesparametrene kan justeres ved at justere sonikeringsintensiteten, cyklusser og tiden præcist. Dette gør det muligt at skabe ønskede DNA størrelser og den målrettede DNA længde kan pålideligt produceres samt gengives. Ultralyd DNA klipning er også ideel til at skabe høj molekylvægt DNA fragmenter.

Protokoller for ultralyd lysis af Drosophila melanogaster

Nedenfor kan du finde forskellige protokoller for ultralyd-assisteret lysis, protein ekstraktion, og DNA eller kromatin fragmentering af Drosophila prøver.

Ultralydlysis til krydsbinding af immunoprecipitation (CLIP) Analyse

CLIP assay blev udført som tidligere rapporteret med nogle ændringer. Ca. 20 mg æggestokke fra 0- til 1-dages gamle hundyr af vildtypen blev UV-krydskædede (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseret på is i 1 mL RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccharose, 1 mM DTT, 1× EDTA-fri Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) suppleret med 300 U RNAseOUT og lagt på is i 30 min. Homogenatet blev sonikeret på is, ved 80% effekt, fem gange i 20 s brister med en 60 s hvile i mellem ved hjælp af Hielscher Ultralyd Processor UP100H (100 W, 30 kHz) centrifugeret (16000 × g i 5 min. ved 4°C). Opløseligt ekstrakt blev forklaret med 20 μl Protein-G dynabeads i 20 min ved 4°C. Efter fjernelse af prøver til immunblæseri og kvantisering af RNA-input (1%) blev HP1 immunoprecipiteret med anti-HP1 9A9 antistof fra 450 μl foraflæst ekstrakt ved inkubation i 4 timer med 50 μl Protein-G dynabeader. Immunoprecipitatter blev vasket 4 gange med RCB. For at elute de immunafciperede RNA'er blev de pelleterede perler kogt i 100 μL UltraPure DEPC-behandlet vand i 5 min. 900 μL Qiazol Reagens blev tilsat supernatanten til RNA-præparatet. RNA renset blev brugt som en skabelon til at syntetisere cDNA ved hjælp af oligo dT, tilfældige hexamers og SuperScript omvendt transskription III i henhold til producentens protokol.
(Cassale et al. 2019)

Ultralyd lysis til chromatin immunoprecipitation assay

Chromatin immunoprecipitation blev udført efter den metode, der er beskrevet af Menet med mindre ændringer. Ca. 20 mg æggestokke fra 0- til 1-dages gamle hundyr af vildtypen blev homogeniseret i 1 mL NEB-buffer (10 mM HEPES-Na ved pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na ved pH 8, 0,5 mM EDTA-Na ved pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- gratis Complete Protease Inhibitors) med en homogenizer / nedsænkningsse> 1 min.)3000 rpm). Homogenatet blev overført til en forkølet glas dounce og 15 fulde slag blev anvendt med en stram pestle. Frie kerner blev derefter centrifuged ved 6000xg i 10 min ved 4 ° C. De kerneholdige pellets blev genbrugt i 1 mL NEB og centrifuged ved 20000 × g i 20 minutter på saccharosegradient (0,65 mL 1,6 M saccharose i NEB, 0,35 mL 0,8 M saccharose i NEB). Pellet blev genbrugt i 1 mL NEB og formaldehyd til en endelig koncentration på 1%. Nuclei blev krydsbundet i 10 minutter ved stuetemperatur og slukket ved at tilføje 1/10 vol 1.375 M glycin. Kernerne blev indsamlet ved centrifugering ved 6000 × g i 5 min. Nuclei blev vasket to gange i 1 mL NEB og opbrugt i 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na ved pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ved pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine og 1× EDTA-fri Complete Protease Inhibitors). Nuclei blev sonikeret ved hjælp af en Hielscher Ultralyd Processor UP100H (100 W, 30 kHz) seks gange i 20 s på og 1 min på is. Sonikerede kerner blev centrifugeret ved 13000 × g i 4 min ved 4°C. Størstedelen af sonikeret kromatin var 500 til 1000 base par (bp) i længden. For hver immunoprecipation blev 15 μg kromatin inkuberet ved tilstedeværelse af 10 μg HP1 9A9 monoklonalt antistof (3 timer ved 4°C i et roterende hjul). Derefter tilsættes 50 μl dynabeads protein G, og inkubationen blev fortsat natten over ved 4°C. Supernatanterne blev kasseret, og prøverne blev vasket to gange i Lysis Buffer (hver vask 15 min ved 4 °C) og to gange i TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ved pH 8). Chromatin blev eluted fra perler i to trin; første i 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ved pH 8) ved 65°C i 15 min. efterfulgt af centrifugering og genvinding af supernatanten. Perler materiale blev genudvundet i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det kombinerede eluat (200 μl) blev inkuberet natten over ved 65°C for at vende krydsforbindelser og behandlet med 50 μg/ml RNaseA i 15 min ved 65°C og med 500 μg/ml Proteinase K i 3 timer ved 65°C. Prøverne blev ekstrakteret fenol-chloroform og ethanol udfældet. DNA blev opsuseret i 25 μl vand. For at maksimere de molekylære analyser med DNA immunrecipiteret blev kandidatgener forstærket parvis gennem en optimeret duplex-PCR-protokol ved hjælp af to forskellige sæt primere med lignende smeltetemperaturer i en enkelt reaktion.
(Casale et al. 2019)
 

Højtydende ultralydcelleforreddere til biologiske prøver

Hielscher Ultrasonics er din længe erfarne partner, når det kommer til højtydende ultralydsenheder til celleforstyrrelser, lysis, proteinekstraktion, DNA, RNA og kromatinfragmentering samt andre præanalytiske prøvepræparationstrin. Hielscher tilbyder en omfattende portefølje af ultralydslabogennatorer og prøveforberedelsesenheder og har den ideelle ultralydsenhed til din biologiske anvendelse og krav.
Klassisk sonde-type ultralydsmaskine med mikro-tip såsom UP200St (200W; se billedet til venstre) eller en af de ultralydsprøveforberedelsesenheder VialTweeter eller UP200ST_TD_CupHorn med VialHolder er foretrukne modeller i forsknings- og analyselaboratorier. Den klassiske ultralydsonde er ideel, når der skal laves færre prøver, skal lyses, udvindes eller fragmenteres. Prøveforberedelsesenhederne VialTweeter og UP200St_TD_CupHorn giver mulighed for samtidig sonikering af op til henholdsvis 10 eller 5 hætteglas.
Hvis der skal forarbejdes høje prøvetal (f.eks. 96-brøndplader, mikrotiterplader osv.), UIP400MTP er den ideelle sonikering setup. UIP400MTP fungerer som et større cuphorn, som er fyldt med vand og har plads nok til at holde mikrobjæmningsplader. Drevet af en 400 watt kraftfuld ultralyd processor, UIP400MTP leverer en meget ensartet og intens sonikering af multi-brønd plader for at forstyrre celler, lyse prøver, opløse pellets, ekstrakt proteiner eller forskydning DNA.

Præcis styring via smart software

Alle Hielscher sonikeringsløsninger fra 200 watt og opefter er udstyret med en digital farvebestændeskærm og en intelligent software. Via smart data protocolling gemmes alle ultralydsprocesparametre automatisk som CSV-fil på et indbygget SD-kort, så snart ultralydspræicatoren er startet. Dette gør forskning og protokolning så meget mere bekvemt. Efter sonikering forsøg eller prøve forberedelse, kan du blot gennemgå sonikering parametre for hver sonikering køre og sammenligne dem.
Via den intuitive menu kan der forudindstilles en lang række parametre før sonikering: For eksempel for at kontrollere temperaturen i prøven og for at forhindre dens termiske nedbrydning kan der indstilles en øvre grænse for prøvetemperaturen. En plug-temperatursensor, der leveres med ultralydsenheden, giver ultralydsprocessorens feedback på den faktiske sonikeringstemperatur. Når den øvre temperaturgrænse er nået, stopper ultralydsenheden, indtil den nedre grænse for sættet ∆T er nået og derefter automatisk sonikere igen.
Hvis sonikering med et bestemt energitilførsel er påkrævet, kan du forudindstille den endelige ultralydsenergi i sonikeringskørslen. Selvfølgelig kan ultralyd pulsering og cyklus mode indstilles individuelt, også.
Hvis du vil genbrug dine mest succesfulde sonikeringsparametre, kan du gemme forskellige sonikeringstilstande (f.eks. sonikeringstid, intensitet, cyklustilstand osv.) som forudindstillede tilstande, så de kan være nemme og hurtigt i gang igen.
For mere operationel bekvemmelighed, kan alle digitale ultralydenheder betjenes via browser fjernbetjening i enhver fælles browser (f.eks InternetExplorer, Safari, Chrome osv.). LAN-forbindelsen er en simpel plug-n-play-opsætning og kræver ingen yderligere softwareinstallation.
Hos Hielscher ved vi, at en vellykket sonikering af biologiske prøver kræver præcision og repeterbarhed. Derfor har vi designet vores ultralydapparater som smarte enheder med alle funktioner, der muliggør en effektiv, pålidelig, reproducerbar og praktisk prøveforberedelse.

Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet af vores ultralydssystemer fra ultralyd mikrospidser og klassiske ultralyd homogenisatorer til MultiSample ultralydsapparater til praktisk, pålidelig forberedelse af adskillige prøver: