Ultralydslyse af Drosophila Melanogaster-prøver

Drosophila melanogaster anvendes i vid udstrækning som modelorganisme i laboratorier. Derfor skal præanalytiske prøveforberedelsestrin såsom lyse, celleopbrydning, proteinekstraktion og DNA-fragmentering ved forskydning af Drosophila melanogaster-prøver udføres hyppigt. Ultralydsdisintegratorer er pålidelige og effektive og kan nemt bruges til at udføre forskellige opgaver såsom lyse, proteinekstraktion eller DNA-fragmentering blot ved at justere ultralydsprocessens parametre. Ultralydshomogenisatorer er dermed fleksible redskaber med en bred vifte af anvendelsesmuligheder.

Ultralydslyse og proteinekstraktion

Lyse, cellesolubilisering, vævshomogenisering og proteinekstraktion er typiske opgaver for ultralydsdisintegratorer i biologiske laboratorier. Ultralydsdisintegratorer og celleopbrydere er velegnede til at homogenisere animalsk væv, insekter (f.eks. Drosophila melanogaster, C. elegans) eller planteprøver. Efterfølgende anvendelser af sonikering omfatter lyse af cellesuspensioner og pellets samt ekstraktion af intracellulære proteiner.
Ultralydslyse og proteinekstraktion er meget pålidelige og reproducerbare processer, som kan udføres på grundlag af etablerede protokoller. Da ultralydsprocessens intensitet kan justeres præcist via sonikeringsparametre såsom amplitude, cyklus- / pulstilstand, temperatur og prøvevolumen, kan protokoller, der først har vist sig at fungere, gentages med samme resultat igen og igen.

DNA- og RNA-fragmentering med ultralyd

Efter cellelyse og proteinekstraktion er forskydningsbetinget opbrydning og fragmentering af DNA, RNA og kromatin et almindeligt nødvendigt trin i prøveforberedelsen, f.eks. før kromatinimmunpræcipitation (ChIP). DNA- og RNA-fragmentering kan opnås pålideligt ved hjælp af fysiske kræfter, der bryder de kovalente bindinger, som holder DNA’et sammen. Ved fysisk forskydning, såsom sonikering, brydes først DNA-strengene, hvorefter DNA’et fragmenteres i mindre stykker.
DNA-fragmentering med ultralyd er pålidelig og effektiv til at fragmentere DNA ved forskydning til en bestemt længde, f.eks. 500bp (basepar). De væsentligste fordele ved DNA-fragmentering med ultralyd omfatter den præcise kontrol af ultralydsprocessens parametre og intensitet. Ultralydsprocessens parametre kan justeres ved præcis indstilling af sonikeringsintensitet, cyklusser og tid. Dette gør det muligt at fremstille DNA i ønskede størrelser, og den tilsigtede DNA-længde kan både fremstilles og reproduceres pålideligt. DNA-fragmentering ved forskydning med ultralyd er også ideel til at fremstille DNA-fragmenter med høj molekylvægt.

Protokoller for ultralydslyse af Drosophila melanogaster

Nedenfor finder du forskellige protokoller for ultralydsassisteret lyse, proteinekstraktion og DNA- eller kromatinfragmentering af Drosophila-prøver.

Ultralydslyse til krydsbindingsimmunpræcipitationsanalyse (CLIP)

CLIP-analysen blev udført som tidligere beskrevet med visse ændringer. Cirka 20 mg ovarier fra 0–1 dage gamle vildtypehunner blev UV-krydsbundet (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniseret på is i 1 mL RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sukrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-fri Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) tilsat 300 U RNAseOUT og anbragt på is i 30 min. Homogenatet blev sonikeret på is ved 80% effekt fem gange i intervaller på 20 s med en pause på 60 s imellem ved hjælp af Hielscher ultralydsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) og centrifugeret (16.000 × g i 5 min ved 4°C). Det opløselige ekstrakt blev forhåndsrenset med 20 μl Protein-G dynabeads i 20 min ved 4°C. Efter udtagning af prøver til immunblotting og kvantificering af RNA-input (1%) blev HP1 immunpræcipiteret med anti-HP1 9A9-antistof fra 450 μl forhåndsrenset ekstrakt ved inkubation i 4 h med 50 μl Protein-G dynabeads. Immunpræcipitaterne blev vasket 4 gange med RCB. For at eluere de immunpræcipiterede RNA’er blev de pelleterede beads kogt i 100 μL UltraPure DEPC-behandlet vand i 5 min. 900 μL Qiazol Reagent blev tilsat den opsamlede supernatant til RNA-forberedelse. Det oprensede RNA blev anvendt som skabelon til syntese af cDNA ved hjælp af oligo dT, tilfældige hexamerer og SuperScript revers transkriptase III i henhold til producentens protokol.
(Cassale et al. 2019)

Ultralydslyse til kromatinimmunpræcipitationsanalyse

Kromatinimmunpræcipitation blev udført efter den metode, som Menet har beskrevet, med mindre ændringer. Cirka 20 mg ovarier fra 0–1 dage gamle vildtypehunner blev homogeniseret i 1 mL NEB-buffer (10 mM HEPES-Na ved pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na ved pH 8, 0,5 mM EDTA-Na ved pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-fri Complete Protease Inhibitors) med en homogenisator / nedsænkningsdispergator i 1 min (ved 3000 rpm). Homogenatet blev overført til en forkølet Dounce-homogenisator af glas, og der blev udført 15 fulde stempelbevægelser med et tætsluttende stempel. Frie cellekerner blev derefter centrifugeret ved 6000xg i 10 min ved 4°C. De cellekerneholdige pellets blev resuspenderet i 1 mL NEB og centrifugeret ved 20.000 × g i 20 min på en sukrosegradient (0,65 mL 1,6 M sukrose i NEB, 0,35 mL 0,8 M sukrose i NEB). Pelleten blev resuspenderet i 1 mL NEB og formaldehyd til en slutkoncentration på 1%. Cellekernerne blev krydsbundet i 10 min ved stuetemperatur, og reaktionen blev standset ved tilsætning af 1/10 vol 1,375 M glycin. Cellekernerne blev opsamlet ved centrifugering ved 6000 × g i 5 min. Cellekernerne blev vasket to gange i 1 mL NEB og resuspenderet i 1 mL lysebuffer (15 mM HEPES-Na ved pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ved pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-deoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosin og 1× EDTA-fri Complete Protease Inhibitors). Cellekernerne blev sonikeret ved hjælp af en Hielscher ultralydsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) seks gange med 20 s sonikering og 1 min på is. Sonikerede cellekerner blev centrifugeret ved 13.000 × g i 4 min ved 4°C. Størstedelen af det sonikerede kromatin havde en længde på 500 til 1000 basepar (bp). Til hver immunpræcipitation blev 15 μg kromatin inkuberet i nærvær af 10 μg HP1 9A9-monoklonalt antistof (3 h ved 4°C på et roterende hjul). Derefter blev 50 μl dynabeads protein G tilsat, og inkubationen blev fortsat natten over ved 4°C. Supernatanterne blev kasseret, og prøverne blev vasket to gange i lysebuffer (hver vask i 15 min ved 4 °C) og to gange i TE-buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ved pH 8). Kromatin blev elueret fra beads i to trin; først i 100 μl elueringsbuffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ved pH 8) ved 65°C i 15 min, efterfulgt af centrifugering og opsamling af supernatanten. Beadmaterialet blev ekstraheret igen i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det samlede eluat (200 μl) blev inkuberet natten over ved 65°C for at ophæve krydsbindingerne og behandlet med 50 μg/ml RNaseA i 15 min ved 65°C og med 500 μg/ml proteinase K i 3 h ved 65°C. Prøverne blev ekstraheret med phenol–chloroform og fældet med ethanol. DNA blev resuspenderet i 25 μl vand. For at maksimere de molekylære analyser med immunpræcipiteret DNA blev kandidatgener amplificeret parvis ved hjælp af en optimeret duplex-PCR-protokol med to forskellige primersæt med lignende smeltetemperaturer i en enkelt reaktion.
(Casale et al. 2019)
 

Højtydende ultralydscelleopbrydere til biologiske prøver

Hielscher Ultrasonics er din partner med mange års erfaring, når det gælder højtydende ultralydsapparater til celleopbrydning, lyse, proteinekstraktion, DNA-, RNA- og kromatinfragmentering samt andre præanalytiske prøveforberedelsestrin. Med et omfattende udvalg af ultralydshomogenisatorer til laboratorier og prøveforberedelsesenheder har Hielscher det ideelle ultralydsapparat til din biologiske anvendelse og dine krav.
Et klassisk ultralydsapparat af sondetypen med mikrospids såsom UP200St (200W; se billedet til venstre) eller en af ultralydsprøveforberedelsesenhederne VialTweeter eller UP200ST_TD_CupHorn med VialHolder er foretrukne modeller i forsknings- og analyselaboratorier. Den klassiske ultralydssonde er ideel, når færre prøver skal lyseres, ekstraheres eller fragmenteres. Prøveforberedelsesenhederne VialTweeter og UP200St_TD_CupHorn muliggør samtidig sonikering af henholdsvis op til 10 eller 5 prøveglas.
Hvis et stort antal prøver (f.eks. 96-brøndsplader, mikrotiterplader osv.) skal behandles, er UIP400MTP den ideelle sonikeringsopstilling. UIP400MTP fungerer som et større CupHorn, som fyldes med vand og har tilstrækkelig plads til mikrobrøndsplader. Drevet af en kraftig ultralydsprocessor på 400 watt leverer UIP400MTP en meget ensartet og intens sonikering af multibrøndsplader for at opbryde celler, lysere prøver, solubilisere pellets, ekstrahere proteiner eller fragmentere DNA ved forskydning.

Præcis styring via intelligent software

Alle Hielscher sonikeringsløsninger fra 200 watt og opefter er udstyret med en digital farveberøringsskærm og intelligent software. Via den intelligente datalogning gemmes alle ultralydsprocessens parametre automatisk som en CSV-fil på et indbygget SD-kort, så snart ultralydsapparatet startes. Dette gør forskning og dokumentation meget mere bekvemt. Efter sonikeringsforsøgene eller prøveforberedelsen kan du nemt gennemgå sonikeringsparametrene for hver sonikeringskørsel og sammenligne dem.
Via den intuitive menu kan adskillige parametre forudindstilles før sonikering: For eksempel kan der indstilles en øvre grænse for prøvetemperaturen for at styre temperaturen i prøven og forhindre dens termiske nedbrydning. En tilslutbar temperatursensor, som følger med ultralydsenheden, giver ultralydsprocessoren feedback om den faktiske sonikeringstemperatur. Når den øvre temperaturgrænse nås, holder ultralydsapparatet pause, indtil den nedre grænse for det indstillede ∆T nås, og begynder derefter automatisk at sonikere igen.
Hvis sonikering med en bestemt energitilførsel er nødvendig, kan du forudindstille den samlede ultralydsenergi ved sonikeringskørslens afslutning. Ultralydspulsering og cyklustilstand kan naturligvis også indstilles individuelt.
For at genbruge dine mest vellykkede sonikeringsparametre kan du gemme forskellige sonikeringstilstande (f.eks. sonikeringstid, intensitet, cyklustilstand osv.) som forudindstillede tilstande, så de nemt og hurtigt kan startes igen.
For at gøre betjeningen mere bekvem kan alle digitale ultralydsenheder betjenes via browserfjernstyring i enhver almindelig browser (f.eks. InternetExplorer, Safari, Chrome osv.). LAN-forbindelsen er en enkel plug-n-play-opsætning og kræver ingen yderligere softwareinstallation.
Hos Hielscher ved vi, at vellykket sonikering af biologiske prøver kræver præcision og gentagelighed. Derfor har vi designet vores ultralydsapparater som intelligente enheder med alle de funktioner, der muliggør effektiv, pålidelig, reproducerbar og bekvem prøveforberedelse.

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydssystemers omtrentlige behandlingskapacitet, fra ultralydsmikrospidser og klassiske ultralydshomogenisatorer til MultiSample-ultralydsapparater til bekvem, pålidelig forberedelse af mange prøver: