Ultralydslyse af E. coli
- E. coli-bakterier er de mest almindeligt anvendte bakterier inden for mikrobiologi og bioteknologi.
- Ultralydscelleforstyrrende stoffer leverer pålidelige og reproducerbare resultater til lysering af E. coli.
- Intense, men præcist kontrollerbare kavitations- og forskydningskræfter resulterer i fuldstændig forstyrrelse og høje ekstraktionsudbytter (f.eks. proteiner, DNA).
Hvorfor er ultralydscelleforstyrrelse af E. coli den foretrukne metode?
Ultralydshomogenisatorer eller sonde-type ultralydapparater tilbyder flere fordele for E. coli-lyse, da intens ultralyd effektivt forstyrrer cellevægge og membraner. Sonde-type ultralydapparater bruges i vid udstrækning til E. coli-lyse på grund af følgende årsager:
Proteinekstraktion fra E.coli-celler udføres effektivt med ultralydssonde UP200St
Sonde-type ultralydsapparat giver mange fordele for E. coli-lyse. Den pålidelige og præcise kontrol over ultralydsprocesparametre gør det muligt at optimere driftsparametrene såsom effekt, varighed og prøvehåndtering for at opnå de ønskede resultater.
Elektroforetiske analyser af genomisk DNA af E. coli EDL933 udsat for 0 - 15 min ultralydbehandling. L angiver DNA-stigen.
(undersøgelse og billede: ©Basselet et al. 2008)
Celleafbrydelse ved hjælp af ultralydskavitation
Ultralydssonde-type homogenisatorer fungerer med ca. 20.000 cyklusser i sekundet (ved 20kHz) og forårsager kavitation i væsker eller suspensioner. Akustisk kavitation, mikroskopiske områder med vakuumlignende tryk og høje temperaturer, der river celler fra hinanden. Selvom temperaturerne kan nå flere tusinde grader Celsius, er kavitationsvolumenerne så små, at de ikke opvarmer processen væsentligt. Ultralydsgenereret akustisk kavitation og forskydningskræfter perforerer eller bryder cellemembranen i bakterieceller såsom E.coli. Hielscher ultralydapparater tillader præcis kontrol over procesparametre såsom ultralydsintensitet, amplitude, energitilførsel og temperatur. Derved kan ultralydslyseprocessen justeres optimalt til celletypen, cellekulturen og procesmålet.
- Præcis kontrol af lysis (intensitet, amplitude, temperatur)
- pålidelige, reproducerbare resultater
- optimal tilpasning til specifikke prøver
- Temperaturkontrol
- for meget små til meget store prøver (μL til liter)
- Rent mekanisk behandling
- brugervenlig, sikker betjening
- Lineær opskalering fra laboratorium til produktion
VialTweeter til ultralydslyse
Ultralydshomogenisator vs andre lysisteknikker
Mens kemisk og enzymatisk lyse kan være problematisk – Da kemisk lyse kan ændre proteinstrukturer og introducere oprensningsproblemer, og enzymatisk lyse kræver lange inkubationstider og ikke kan reproduceres – Ultralydsforstyrrelse er en sofistikeret, hurtig celleforstyrrelsesmetode.
Ultralydslyse er kun baseret på mekaniske kræfter. Der tilsættes ingen kemikalier, sonikering bryder cellevæggen ved forskydningskræfter. Kemisk lyse kan ændre proteinstrukturen og introducere oprensningsproblemer. Enzymatisk forstyrrelse kræver lange inkubationstider og er ikke reproducerbar. Ultralydscelleforstyrrelse af E.coli-bakterieceller er hurtig, enkel, pålidelig og reproducerbar. Derfor anvendes Hielscher ultralydapparater i biologiske og biokemiske laboratorier rundt om i verden til prøveforberedelse, præ-ananlytika, in vitro-diagonstik og mangfoldige analyser.
Generelle anbefalinger til ultralydslyse
Sonikering er den mest populære teknik til lysning af meget små, mellemstore og store mængder cellesuspensioner – fra pico-liter op til 100L / time (ved hjælp af en ultralydsflowcelle). Celler lyseres ved væskeforskydning og kavitation. DNA klippes også under sonikering, så det er ikke nødvendigt at tilføje DNase til cellesuspensionen.
Temperaturkontrol under ultralyd E.coli-lyse
Ved at forkøle prøven og holde prøven under sonikering på is, kan prøvens termiske nedbrydning af prøven let forhindres.
Ideelt set bør prøverne opbevares iskolde under lyseren, men for de fleste prøver er det tilstrækkeligt, hvis temperaturen ikke stiger over dyrknings- eller vævskildens temperatur. Derfor anbefales det at holde suspensionen på is og at sonikere med flere korte ultralydsimpulser på 5-10 sek og pauser på 10-30 sek. I pauserne kan varmen forsvinde for at genoprette en lav temperatur. Til større celleprøver fås forskellige flowcellereaktorer med kølekapper.
Læs her detaljerede tips og anbefalinger til en vellykket ultralydslys!
Protokoller til ultralydspræparat af E. coli-lysater
Forskere bruger Hielscher ultralydshomogenisatorer til E.coli-celleforstyrrelse. Nedenfor kan du finde forskellige testede og gennemprøvede protokoller til E.coli-lyse ved hjælp af Hielscher ultralydshomogenisatorer til forskellige E. coli-relaterede applikationer.
Cellevækst, tværbinding og fremstilling af E. coli-celleekstrakter ved hjælp af ultralyd
For SeqA- og RNA-polymerase blev ChIP-Chip E. coli MG1655 eller MG1655 ΔseqA dyrket ved 37°C til en OD600 på ca. 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2 % glukose), før der blev tilsat 27 μl formaldehyd (37 %) pr. ml medium (endelig koncentration 1 %). Tværbinding blev udført ved langsom omrystning (100 omdr./min.) ved stuetemperatur i 20 minutter efterfulgt af slukning med 10 ml 2,5 M glycin (slutkoncentration 0,5 M). Til varmechokforsøg blev E. coli MG1655 dyrket i 65 ml LB medium ved 30 °C til en OD600 på ca. 0,3. Derefter blev 30 ml kultur overført til en forvarmet kolbe ved 43 °C, og resten blev opbevaret ved 30 °C. Tværbinding og bratkøling var som beskrevet ovenfor, bortset fra at cellerne blev holdt ved 30 eller 43 °C i 5 minutter, før de blev rystet yderligere langsomt ved stuetemperatur. Celler blev indsamlet ved centrifugering og vasket to gange med kold TBS (pH7,5). Efter resuspension i 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozym) og inkubation ved 37 °C i 30 minutter efterfulgt af tilsætning af 4 ml IP-buffer, blev celler sonikeret på is med 12 gange 30 sek og 30 sek pauser ved hjælp af Hielscher ultralydsprocessor UP400St ved 100% effektindstilling. Efter centrifugering i 10 minutter ved 9000 g blev 800 μl alikvoter af supernatanten opbevaret ved -20°C. (Waldminghaus 2010)
Overproduktion og oprensning af enzymer med en ultralydssonde
Til overproduktion af decahistidin (His10)-mærkede proteiner blev E. coli BL21(DE3) transformeret med pET19b-konstruktioner. En forkultur fra den ene dag til den anden blev høstet ved centrifugering, og 1 % blev brugt til at pode en ekspressionskultur. Celler, der bærer pET19mgtB, blev dyrket ved 22°C indtil en optisk tæthed ved 600 nm (OD600) på 0,7. Kulturen blev overført til 17 °C og induceret af 100 μM IPTG. Efter 16 timer blev kulturen høstet ved centrifugering ved 7.500 × g ved 4°C. Celler blev resuspenderet i 50 mM fosfatbufret saltvand (PBS) med 0,3 M NaCl ved pH 7,4 og forstyrret ved ultralydbehandling med en S2 mikro-tip sonotrode ved Hielscher ultralydsapparat UP200St ved en cyklus på 0,5 og en amplitude på 75%.
Overproduktionen af decahistidin-mærket GtfC blev induceret ved 37 °C ved en OD600 på 0,6 med 100 μM IPTG. Celler blev derefter inkuberet i 4 timer, høstet og lyseret som angivet ovenfor for MgtB.
Råcelleekstrakter blev centrifugeret ved 15.000 × g og 4°C for at sedimentere celleaffaldet. De klarede ekstrakter blev pålagt 1 ml HisTrap FF Crude-kolonner ved hjælp af et ÄKTAprime Plus-system. Enzymerne blev oprenset i henhold til producentens protokol for gradienteluering af His-mærkede proteiner. Eluerede proteinopløsninger blev dialyseret to gange mod 1.000 volumener på 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl ved 4°C. Oprensningen blev analyseret ved 12% SDS-PAGE. Koncentrationen af protein blev bestemt ved Bradford-metoden ved hjælp af Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ultralydsekstraktion af protein fra E. coli-bakterier
Et lokkemad protein af interesse (i dette tilfælde MTV1 af Arabidopsis thaliana) er smeltet sammen med et GST-mærke og udtrykt i BL21 Escherichia coli (E. coli) celler.
- Tag en pellet GST-MTV1 og GST (svarende til 50 ml bakteriekultur) og resuspender hver i 2,5 ml iskold ekstraktionsbuffer.
- Brug en ultralydsapparat UP100H (udstyret med MS3 microtip-sonotrode til små mængder på ca. 2-5 ml) til at forstyrre bakteriecellerne, indtil de lyseres, hvilket er indikeret ved reduceret opacitet og øget viskositet. Dette skal udføres på is, og det anbefales at sonikere i intervaller (f.eks. 10 sek sonikering efterfulgt af 10 sek pause på is og så videre). Man skal passe på ikke at sonikere med for høj intensitet. Hvis der opdages skumdannelse eller dannelse af et hvidt bundfald, skal intensiteten sænkes.
- Overfør den lyserede bakterieopløsning til 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuger ved 4 °C, 16.000 x g i 20 minutter.
Sonde-type ultralydapparater såsom UP400St anvende arbejdsprincippet akustisk kavitation til effektiv lysering af E.coli.
Ekspressionsanalyse og oprensning af rekombinant protein ved hjælp af sonikering
E. coli-pelleten blev sonikeret med Hielscher ultralydsapparat UP100H. Til dette formål blev cellepellet resuspenderet i kølet lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) og afkølet på is i 10 minutter. Derefter blev cellesuspension sonikeret med 10 korte udbrud på 10 s efterfulgt af interval på 30 s til afkøling. Til sidst blev celleaffald fjernet ved ultracentrifugering ved 4°C i 15 minutter ved 14000 rpm. Til bekræftelse af rPR-ekspression blev supernatanten kørt på 12 % polyacrylamidgel og analyseret ved SDS-PAGE og Western blotting. Oprensning af rPR blev udført ved hjælp af Ni2+-NTA-harpiks (Invitrogen, USA) i henhold til producentvejledningen. I denne fase blev der anvendt en naturlig oprensningsmetode. Renheden af det oprensede protein blev vurderet ved hjælp af elektroforese på 12% polyacrylamidgelen og efterfølgende Coomassie blue-farvning. Koncentrationen af renset protein blev målt ved hjælp af Micro BCA-proteinanalysesæt (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultralydshomogenisatorer til E. coli Lysis
Hielscher Ultrasonics designer, fremstiller og leverer højtydende ultralydshomogenisatorer til pålidelig og effektiv lysering af E. coli-bakterier og andre celletyper, væv og cellekulturer.
Den brede portefølje af ultralydssonder såvel som indirekte sonikeringssystemer giver os mulighed for at tilbyde dig den ideelle ultralydsvævshomogenisator til din celleforstyrrelse og ekstraktionsapplikation.
Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Smart software, intuitiv menu, programmerbare indstillinger og automatisk dataprotokol er blot nogle få funktioner i Hielscher ultralydapparater. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i forsknings- og bioteknologiske faciliteter. Selv barske forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydapparater.
Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater:
| Batch volumen | Flowhastighed | Anbefalede enheder |
|---|---|---|
| Multi-brønd / mikrotiterplader | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn til hætteglas eller bægerglas | n.a. | Ultralyd CupHorn |
| ultralyd mikro-flow reaktor | n.a. | GDmini2 |
| op til 10 hætteglas med 0,5 til 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 0.5 til 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 1 til 500 ml | 10 til 200 ml/min | UP100H |
| 10 til 2000 ml | 20 til 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 til 20L | 0.2 til 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 til 100L | 2 til 10 l/min | UIP4000 |
| n.a. | 10 til 100 l/min | UIP16000 |
| n.a. | Større | klynge af UIP16000 |
Kontakt os! / Spørg os!
Yderligere protokoller til ultralyd E. coli Lysis
Allicin-modificerede proteiner i E. coli ved hjælp af en ultralydsvialdiskanthøjttaler
Bestemmelse af sulfhydrylindhold ved 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoesyre) (DTNB) analyse
En E. coli MG1655 natten over kultur blev brugt til at inokulere MOPS minimalt medium (1:100). Kulturen blev dyrket aerobt, indtil en A600 på 0,4 blev nået. Kulturen blev opdelt i tre 15 ml kulturer til stressbehandling. En ubehandlet kultur fungerede som en negativ kontrol. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid blev tilsat til en af de resterende to kulturer hver. Kulturer blev inkuberet i 15 min. 5 ml af hver kultur blev høstet ved centrifugering (8.525 × g, 4°C, 10 min). Cellerne blev vasket to gange med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, opbevaret anaerobt før brug) og centrifugeret (13.000 × g, 4°C, 10 min). Celler blev resuspenderet i lysisbuffer (PBS med 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) før afbrydelse ved 4 °C ved ultralydbehandling (VialTweeter ultralydsapparat, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Celleaffald blev pelleteret ved centrifugering (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatanten blev overført til en 3,5 ml QS-makrokuvette (10 mm) med en magnetisk rørestang og blandet med 1 ml lysisbuffer. Udryddelse af prøverne blev overvåget ved 412 nm med et Jasco V-650 spektrofotometer udstyret med PSC-718 temperaturkontrolleret celleholder ved stuetemperatur. 100 μl af en 3 mM dithiobis(2-nitrobenzoesyre) opløsning blev tilsat. Udryddelsen blev overvåget, indtil den nåede mætning. Beregning af thiolkoncentrationen blev udført ved hjælp af ekstinktionskoefficienten ε412 = 13.700 M-1 centimeter-1 thio-2-nitrobenzoesyre (TNB). Cellulære thiolkoncentrationer blev beregnet ud fra et volumen af E. coli-celler på 6,7 × 10-15 liter og en celletæthed på A600 = 0,5 (svarende til 1 × 108 celler ml-1 kultur). (Müller et al. 2016)
In vivo glutathionbestemmelse ved hjælp af en ultralydscelleknuser
E.coli MG1655 blev dyrket i MOPS minimalt medium i et samlet volumen på 200 ml, indtil en A600 på 0,5 blev nået. Kulturen blev opdelt i 50 ml kulturer til stressbehandling. Efter 15 minutters inkubation med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimethylsulfoxid (kontrol) blev celler høstet ved 4.000 g ved 4°C i 10 minutter. Cellerne blev vasket to gange med KPE-buffer før resuspension af pellets i 700 μl KPE-buffer. Til deproteinering blev 300 l 10% (w / v) sulfosalicylsyre tilsat før forstyrrelse af celler ved ultralydbehandling (3 x 1 min; VialTweeter ultralydsapparat). Supernatanter blev indsamlet efter centrifugering (30 min, 13.000 g, 4°C). Sulfosalicylsyrekoncentrationer blev reduceret til 1 % ved tilsætning af 3 volumener KPE-buffer. Målinger af total glutathion og GSSG blev udført som beskrevet ovenfor. Cellulære glutathionkoncentrationer blev beregnet ud fra et volumen af E. coli-celler på 6,7×10-15 liter og en celletæthed på A600 0,5 (svarende til 1×108 celler ml-1 kultur). GSH-koncentrationer blev beregnet ved subtraktion af 2[GSSG] fra total glutathion. (Müller et al. 2016)
Ekspression af human mAspAT i E. coli ved hjælp af en ultralydshomogenisator
Den enkelte koloni af E. coli BL21 (DE3), der indeholder ekspressionsvektoren i 30 ml Luria-Bertani (LB) medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin, og derefter dyrket ved 37 ° C indtil den optiske tæthed (OD600) til 0,6. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 4.000 × g i 10 minutter og resuspenderet i 3L frisk LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin.
Efterfølgende blev proteinekspression induceret med 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 20 timer ved 16ºC. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 8.000 × g i 15 minutter og vasket med buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Tilnærmede 45 g (vådvægt) celler blev opnået fra 3 L kultur. Efter centrifugering blev cellepillerne resuspenderet i 40 ml (til 1 L kultur) iskold ekstraktionsbuffer A og lyseret ved ultralydbehandling ved iskold temperatur ved hjælp af Hielscher ultralydscelleknuser UP400St. Cellelysen blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter for at adskille opløselige (supernatant) og udfældede (pellet) fraktioner. (Jiang et al. 2015)
Fakta, der er værd at vide
E.coli
Escherichia coli (E. coli) er en gramnegativ, fakultativt anaerob, stavformet, coliform bakterie af slægten Escherichia, der almindeligvis findes i den nedre del af tarmen hos varmblodede organismer (endotermer). Der er et stort antal E. coli-stammer (eller undertyper) med forskellige egenskaber. De fleste E. coli-stammer er uskadelige for mennesker, f.eks. B- og K-12-stammer, som almindeligvis anvendes til forskningsanvendelser i laboratorier. Nogle stammer er dog skadelige og kan forårsage alvorlig sygdom.
E. coli spiller en vigtig rolle i moderne biologisk teknik og industriel mikrobiologi, da bakterierne er lette at manipulere. Almindelige laboratorieanvendelser, der ofte involverer brug af E. coli, f.eks. til at skabe rekombinant deoxyribonukleinsyre (DNA) eller til at fungere som en modelorganisme.
E. coli er en meget alsidig vært til produktion af heterologe proteiner, og mangfoldige proteinekspressionssystemer er tilgængelige til fremstilling af rekombinante proteiner i E. coli. Ved hjælp af plasmider, der tillader høj ekspression af protein, kan gener introduceres i bakterierne, hvilket gør det muligt at producere sådanne proteiner i store mængder i industrielle fermenteringsprocesser.
E.coli bruges som cellefabrikker til at producere insulin. Yderligere anvendelser omfatter anvendelse af modificerede E. coli-celler til udvikling og fremstilling af vacciner og immobiliserede enzymer, til fremstilling af biobrændstoffer samt til bioremediering.
Stammen K-12 er en mutant form af E. coli, der overudtrykker enzymet alkalisk fosfatase (ALP). Denne mutation opstår på grund af en defekt i genet, der konstant koder for enzymet. Hvis et gen producerer et produkt uden hæmning, er dette kendt som konstitutiv aktivitet. Denne specifikke mutantform bruges til isolering og oprensning af ALP-enzymet.
E. coli-bakterier bruges også i vid udstrækning som cellefabrikker. Konstruerede mikrober (f.eks. bakterier) og planteceller kan bruges som såkaldte cellefabrikker. Disse genetisk modificerede celler producerer molekyler, kemikalier, polymerer, proteiner og andre stoffer, som f.eks. anvendes i medicinal-, fødevare- og kemisk industri. For at frigive de molekyler, der produceres i det indre af sådanne biokonstruerede celler, er ultralydslyse en almindelig metode til at forstyrre cellevæggene og overføre målstofferne til den omgivende væske. Læs mere om lysering af biomanipulerede celler!
Ultralyd DNA-klipning
Ultralydsforskydningskræfter er en almindeligt anvendt metode til at frigive molekyler, organeller og proteiner fra cellens indre samt til at bryde DNA-strenge i stykker. Akustisk kavitation bryder cellevæggene og membranerne for at udtrække DNA fra celler og generere fragmenter på omkring 600 – 800 bp i længden, hvilket er ideelt til analyse.
Klik her for at lære mere om ultralydshomogenisatorer til DNA-fragmentering!
Litteratur / Referencer
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.