Hielscher Ultralydsteknologi

Ultrasonic Lyse af E. Coli

  • E. coli-bakterier er de mest anvendte bakterier i mikrobiologi og bioteknologi.
  • Ultralydcelleforstyrrelser leverer pålidelige og reproducerbare resultater for lysis af E. coli.
  • Intense, men alligevel præcist styrbare kavitations- og forskydningskræfter resulterer i fuldstændig afbrydelse og høje udvindingsudbytter (fx proteiner, DNA).

Celleforstyrrelse ved kavitation

Escherichia coli-bakterier lyseres pålideligt ved anvendelse af ultralydvævshomogenisatorer.Ultralyd sonde-type homogenisatorer arbejder med ca. 20.000 cykler pr. Sekund (ved 20kHz) og forårsager kavitation i væsker eller supsensioner. Akustiske kavitationsmikroskopiske områder af vakuumlignende tryk og høje temperaturer, der river cellerne væk. Selv om temperaturer kan nå flere tusinde grader Celsius, er kavitationsvolumener så små, at de ikke opvarmer processen betydeligt. Ultralydgenererede akustiske kavitations- og forskydningskræfter perforerer eller bryder cellemembranen af ​​E. coli – afhængigt af enhedens indstilling af ultralydshomogenisatoren.

Fordele ved ultralydslysis

  • præcis kontrol af lysis (intensitet, amplitude, temperatur)
  • optimal tilpasning til specifikke prøver
  • temperaturkontrol
  • for meget små til meget store prøver (μL til liter)
  • ren mekanisk behandling
  • lineær opdeling fra laboratorium til produktion
Den ultrasoniske anordning VialTweeter muliggør samtidig prøveforberedelse på op til 10 hætteglas under samme procesbetingelser. (Klik for større billede!)

VialTweeter til ultralyd lysis

Anmodning om oplysninger




Bemærk vores Fortrolighedspolitik.


Mens kemisk og enzymtisk lysis kan være problematisk – da kemisk lys kan ændre proteinkonstruktioner og indføre renseproblemer, og enzymatisk lysis kræver lange inkubationstider og kan ikke reproduceres – ultralyd forstyrrelse er en sofistikeret, hurtig celleforstyrrelsesmetode.
Ultralydlysis er kun baseret på mekaniske kræfter. Ingen kemikalier tilsættes, sonikering bryder cellevæggen ved forskydningskræfter. Kemiske lysis kan ændre proteinstruktur og indføre rensningsproblemer. Enzymatisk afbrydelse kræver lange inkubationstider og kan ikke reproduceres. Ultralydcelleforstyrrelser af E.coli bakterieceller er hurtig, enkel, pålidelig og reproducerbar. Det er derfor Hielscher ultralydsenheder anvendes i biologiske og biokemiske laboratorier rundt om i verden til prøveforberedelse, præ-ananlytik, in-vitro diagonstics og manifold assays.

Generelle anbefalinger

UP400St ultralydator med flowreaktorSonikering er den mest populære teknik til lysering af meget små, mellemstore og store mængder cellesuspensioner – fra pico-liter op til 100L / time (ved hjælp af en ultralydsstrømcelle). Celler lyseres ved væskeskær og kavitation. DNA skæres også under sonikering, så det er ikke nødvendigt at tilføje DNase til cellesuspensionen.
Temperaturregulering:
Ved at forkøle prøven og holde prøven under sonikering på is, kan prøveens termiske nedbrydning af prøven let forhindres.
Ideelt set bør prøverne holdes iskold under lysis, men for de fleste prøver er det tilstrækkeligt, hvis temperaturen ikke stiger over temperaturen af kulturen eller vævs kilden. Derfor anbefales det, at holde suspensionen på is og til sonikeres med flere korte ultralyd pulser af 5-10 sek og pauser på 10-30 sek. Under pauserne kan varmen sprede sig for at genetablere en lav temperatur. For større celleprøver er forskellige flowcelle reaktorer med køle jakker tilgængelige.

Protokoller til fremstilling af E. coli lysater

Ekspressionsanalyse og oprensning af rekombinant protein

E. coli-pellet blev sonikeret med et ultralydsystem UP100H (Hielscher). Til dette formål blev cellepellet resuspenderet i afkølet lysisbuffer (50 mM Tris-HCI pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) og afkølet på is i 10 minutter. Derefter soniceredes cellesuspension med 10 korte udbrud på 10 s efterfulgt af interval på 30 s til afkøling. Endelig blev celleaffald fjernet ved ultracentrifugering ved 4 ° C i 15 minutter ved 14000 omdr./min. Til bekræftelse af rPR-ekspression blev supernatanten kørt på 12% polyacrylamidgel og analyseret ved SDS-PAGE og Western blotting. Oprensning af rPR blev gjort under anvendelse af Ni2 + +-NTA harpiks (Invitrogen, USA) ifølge producentens vejledning. I denne fase blev oprindelig oprensningsmetode anvendt. Renheden af ​​det oprensede protein blev vurderet ved anvendelse af elektroforese på 12% polyacrylamidgelen og efterfølgende Coomassie-blåfarvning. Oprenset proteinkoncentration blev målt ved Micro BCA proteinassay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al., 2016)

Ultralyds-celle disruptor UP100H (100W) til lyse, cellesprængning og DNA klipning.

ultralydshomogenisator UP100H 100W

Cellevækst, tværbinding og fremstilling af E. coli-celleekstrakter

For SeqA og RNA polymerase ChIP-Chip E. coli MG1655 eller MG1655 ΔseqA blev dyrket ved 37 ° C til en OD600 af på ca. 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2% glucose), før 27 μl formaldehyd (37%) pr. ml medium blev tilsat (slutkoncentration 1%). Tværbinding blev udført ved langsom rystning (100 rpm) ved stuetemperatur i 20 minutter efterfulgt af quenching med 10 ml 2,5 M glycin (slutkoncentration 0,5 M). Til varmechokforsøg blev E. coli MG1655 dyrket i 65 ml LB-medium ved 30 ° C til en OD600 af på ca. 0,3. Derefter blev 30 ml kultur overført til en forvarmet kolbe ved 43 ° C, og resten blev holdt ved 30 ° C. Tværbinding og quenching var som beskrevet ovenfor, bortset fra at celler blev holdt ved 30 eller 43 ° C i 5 minutter før yderligere langsom rystning ved stuetemperatur. Celler blev opsamlet ved centrifugering og vasket to gange med koldt TBS (pH 7,5). Efter resuspension i 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozym) og inkubering ved 37 ° C i 30 minutter efterfulgt af tilsætning af 4 ml IP buffer blev celler soniceret på is med 12 gange 30 sek og 30 sek bryder ved en UP400St ultralyd processor (Hielscher Ultrasonics GmbH) med 100% effekt. Efter centrifugering i 10 minutter ved 9000 g blev 800 μl alikvoter af supernatanten opbevaret ved -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Overproduktion og oprensning af enzymer.

Til overproduktion af decahistidin (His10) -tagne proteiner blev E. coli BL21 (DE3) transformeret med pET19b-konstruktioner. En overnight preculture blev høstet ved centrifugering, og 1% blev anvendt til at inokulere en ekspressionskultur. Celler, der bærer pET19mgtB, blev dyrket ved 22 ° C indtil en optisk densitet ved 600 nm (OD600 af) på 0,7. Kulturen blev overført til 17 ° C og induceret af 100 μM IPTG. Efter 16 timer blev kulturen høstet ved centrifugering ved 7.500 x g ved 4 ° C. Celler blev resuspenderet i 50 mM phosphatpufret saltopløsning (PBS) med 0,3 M NaCl ved pH 7,4 og forstyrret ved ultralydbehandling med en S2 mikrotips sonotrode ved UP200St ultralydapparat (Hielscher, Teltow, Tyskland) ved en cyklus på 0,5 og en amplitud på 75%.
Overproduktionen af ​​decahistidin-mærket GtfC blev induceret ved 37 ° C ved en OD600 af på 0,6 med 100 μM IPTG. Celler blev derefter inkuberet i 4 timer, høstet og lyseret som angivet ovenfor for MgtB.
Råcelleekstrakter blev centrifugeret ved 15.000 x g og 4 ° C for at sedimentere cellernes affald. De klarede ekstrakter blev fyldt på 1 ml HisTrap FF-rå kolonner ved anvendelse af et ÄKTAprime Plus-system (GE Healthcare). Enzymerne blev oprenset ifølge producentens protokol for gradienteluering af His-mærket proteiner. Elutede proteinopløsninger blev dialyseret to gange imod 1000 volumener 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl ved 4 ° C. Oprensningen blev analyseret med 12% SDS-PAGE. Koncentrationen af ​​protein blev bestemt ved Bradford-metoden under anvendelse af Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Tyskland). (Rabausch et al., 2013)

Ekstraktion af protein fra E. coli-bakterier
Et agnprotein af interesse (i dette tilfælde, MTV1 af Arabidopsis thaliana) fusioneres til en GST-tag og udtrykkes i BL21 Escherichia coli (E. coli) celler.
1. Tag en pellet af GST-MTV1 og GST (svarende til 50 ml bakteriekultur) og resuspender hver i 2,5 ml iskold ekstraktionsbuffer.
2. Brug en ultralydapparat UP100H (udstyret med MS3 mikrotip-sonotrode til små volumener (2-5 ml)) for at forstyrre bakteriecellerne, indtil de lyseres, hvilket er indikeret ved reduceret opacitet og forøget viskositet. Dette skal udføres på is, og det anbefales at sonikere i intervaller (fx 10 sek sonicating efterfulgt af 10 sek på is og så videre). Omhu skal tages for ikke at sonikere med for høj intensitet. Hvis der opdages skumdannelse eller dannelsen af ​​et hvidt bundfald, skal intensiteten sænkes.
3. Overfør den lyserede bakterieopløsning til 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge ved 4 ° C, 16.000 xg i 20 minutter.

Allicin-modificerede Proteiner i E. coli

Den VialTweeter er en komfortabel ultrasonicator for lille prøve homogeniseringBestemmelse af sulfhydrylindhold ved 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) assay
En overnightcultur fra E. coli MG1655 blev anvendt til at inokulere MOPS minimal medium (1: 100). Kulturen blev dyrket aerobt, indtil en A600 på 0,4 blev nået. Kulturen blev opdelt i tre 15 ml kulturer til stressbehandling. En ubehandlet kultur fungerede som en negativ kontrol. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid blev tilsat til en af ​​de resterende to kulturer hver. Kulturer blev inkuberet i 15 minutter. 5 ml af hver kultur blev høstet ved centrifugering (8,525 x g, 4 ° C, 10 minutter). Celler blev vasket to gange med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, opbevares anaerobt inden brug) og centrifugeret (13.000 x g, 4 ° C, 10 min). Celler blev resuspenderet i lysebuffer (PBS med 6 mM guanidinium HCI, pH 7,4) før afbrydelse ved 4 ° C ved ultralydbehandling (VialTweeter ultralydapparat, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Celleaffald blev pelleteret ved centrifugering (13.000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatanten blev overført til en 3,5 ml QS-makrokuvette (10 mm) med en magnetisk omrørerstang og blandet med 1 ml lysisbuffer. Ekstinktion af prøverne blev overvåget ved 412 nm med et Jasco V-650 spektrofotometer udstyret med den PSC-718 temperaturstyrede celleholder (Jasco) ved stuetemperatur. 100 μl af en 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoesyre) opløsning blev tilsat. Ekstinktion blev overvåget, indtil den nåede mætning. Beregning af thiolkoncentration blev udført under anvendelse af udstødningskoefficienten e412 af = 13.700 M-1 Cm-1 for thio-2-nitrobenzoesyre (TNB). Cellulære thiolkoncentrationer blev beregnet ud fra et volumen af ​​E. coli-celler på 6,7 x 10-15 liter og en celletæthed på A600 af = 0,5 (svarende til 1 × 108 celler ml-1 kultur). (Müller et al., 2016)

In vivo glutathionbestemmelse

E. coli MG1655 blev dyrket i MOPS minimal medium i et totalt volumen på 200 ml indtil en A600 af på 0,5 blev nået. Kulturen blev opdelt i 50 ml kulturer til stressbehandling. Efter 15 min inkubering med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimethylsulfoxid (kontrol) blev høstede celler ved 4 000 g ved 4 ° C i 10 minutter. Celler blev vasket to gange med KPE-buffer forud for resuspension af pellets i 700 μl KPE-buffer. Til deproteinering blev 3001 af 10% (w / v) sulfosalicylsyre tilsat før afbrydelse af celler ved ultralydbehandling (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanter blev opsamlet efter centrifugering (30 minutter, 13.000 g, 4 ° C). Sulfosalicylsyrekoncentrationer blev reduceret til 1% ved tilsætning af 3 volumener KPE-buffer. Målinger af total glutathion og GSSG blev udført som beskrevet ovenfor. Celleglutathionkoncentrationer blev beregnet ud fra et volumen af ​​E. coli-celler på 6,7×10-15 liter og en celletæthed på A600 af 0.5 (svarende til 1×108 celler ml-1 kultur). GSH-koncentrationer blev beregnet ved subtraktion af 2 [GSSG] fra total glutathion. (Müller et al., 2016)

Ultralydsforstyrrelser til cellelys og ekstraktion af biologisk materiale (Klik for større billede!)

Probe-typen ultralydsapparat UP400St

Ekspression af humant mAspAT i E. coli

Ultralydcelleforstyrrelser UP400St (400W) til ekstraktion af intracellulær materiale (fx proteiner, organeller, DNA, RNA etc.)Den enkle koloni af E. coli BL21 (DE3) indeholdt ekspressionsvektoren i 30 ml Luria-Bertani (LB) medium indeholdende 100 μg / ml ampicillin og dyrket derefter ved 37 ° C indtil den optiske densitet (OD600 af) nået 0,6. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 minutter og resuspenderet i 3 l frisk LB medium indeholdende 100 μg / ml ampicillin.
Efterfølgende blev proteinekspression induceret med 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 20 timer ved 16 º C. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 8.000 x g i 15 minutter og vasket med puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Tilnærmet 45g (vådvægt) celler blev opnået fra 3 L kultur. Efter centrifugering blev cellepellets resuspenderet i 40 ml (i 1 L kultur) iskold ekstraktionsbuffer A, og lyseret ved ultralydbehandling ved iskold temperatur under anvendelse af en UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Tyskland). Cellelysen blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 min for at separere opløselige (supernatant) og udfældede (pellet) fraktioner. (Jiang et al. 2015)

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige forarbejdningskapacitet hos vores ultralydapparater:

Batch Volumen Strømningshastighed Anbefalede enheder
0.5 til 1,5 ml na VialTweeter
1 til 500 ml 10 til 200 ml / min UP100H
10 til 2000 ml 20 til 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 til 20L 0.2 til 4L / min UIP2000hdT
10 til 100 l 2 til 10 l / min UIP4000
na 10 til 100 l / min UIP16000
na større klynge af UIP16000

Kontakt os! / Spørg Os!

Brug venligst nedenstående formular, hvis du ønsker at anmode om yderligere oplysninger om ultralydshomogenisering. Vi vil være glade for at tilbyde dig en ultralyds-system opfylder dine krav.









Bemærk venligst, at vores Fortrolighedspolitik.


Litteratur / Referencer



Fakta Værd at vide

E coli

Escherichia coli (E. coli) er en gram-negativ, fakultativt anaerob, stangformet, coliform bakterie af slægten Escherichia, som almindeligvis findes i tyndtarmen af ​​varmblodede organismer (endotermer). Der er et stort antal E. coli-stammer (eller undertyper) med forskellige egenskaber. De fleste E. coli-stammer er harmløse for mennesker, fx B- og K-12-stammer, der almindeligvis anvendes til forskningsapplikationer i laboratorier. Men nogle stammer er skadelige og kan forårsage alvorlig sygdom.
E. coli spiller en vigtig rolle i moderne bioteknologi og industriel mikrobiologi, da bakterierne er nemme at manipulere. Fælles laboratorieapplikationer, der ofte involverer anvendelse af E. coli, fx at skabe rekombinant deoxyribonukleinsyre (DNA) eller at fungere som en modelorganisme.
E. coli er en meget alsidig vært til produktion af heterologe proteiner, og mangfoldige proteinekspressionssystemer er tilgængelige til fremstilling af rekombinante proteiner i E. coli. Ved anvendelse af plasmider, der tillader højproteinprotein, kan gener introduceres i bakterierne, hvilket muliggør fremstilling af sådanne proteiner i store mængder i industrielle fermenteringsprocesser.
E. coli anvendes som cellefabrikker til fremstilling af insulin. Yderligere anvendelser omfatter anvendelsen af ​​modificerede E. coli-celler til udvikling og fremstilling af vacciner og immobiliserede enzymer til fremstilling af biobrændstoffer såvel som til bioremediering.
Stammen K-12 er en mutant form af E. coli, der overtrykker enzymet Alkalphosphatase (ALP). Denne mutation opstår på grund af en defekt i genet, som konstant koder for enzymet. Hvis et gen producerer et produkt uden nogen hæmning, er dette kendt som konstitutiv aktivitet. Denne specifikke mutantform anvendes til isolering og oprensning af ALP-enzymet.

Ultralyd DNA Shearing

Ultrasoniske forskydningskræfter er en almindeligt anvendt metode til at skille fra cellen og bryde DNA-strenge i stykker. Akustisk kavitation bryder cellevæggene og membraner til at udtrække DNA fra celler og generere fragmenter på ca. 600 – 800 bp i længde, som er ideel til analyse.
Klik her for at lære mere om ultralyd homogenisatorer til DNA-fragmentering!