Protokol for SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivering med sonikering

Inaktivering af SARS-CoV-2 Coronavirus med VialTweeter

Efter fjernelse af fiksativet blev monolagene vasket tre gange med fosfat-bufferet saltvand (PBS), før cellerne skrabes i 1 ml MEM/5% FBS og sonikeres (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder slukket ved 100% effekt og amplitude) ved hjælp af Hielscher ultralydprocessoren UP200St med VialTweeter Vedhæftet fil. Supernatanter blev afklaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter. 

Læs den fulde protokol her for SARS-CoV-2 coronavirus inaktivering af Welch et al. (2020) nedenfor:

Celler og virus

Vero E6 celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) blev dyrket i modificeret Eagle's minimum væsentlige medium (MEM) suppleret med 10% (v / v) føtal kalv serum (FCS). Anvendt virus var SARS-CoV-2 stamme hCOV-19/England/2/2020, isoleret af PHE fra den første patientklynge i Storbritannien den 29.01.2020. Denne virus blev opnået ved passage 1 og anvendt til inaktiveringsundersøgelser ved passage 2 eller 3.
For reagenser og kemikalier, der anvendes til SARS-CoV-2 inaktivering samt fjernelse af reagens cytotoksicitet henvises til den videnskabelige rapport fra Welch et al. (2020).

Virus inaktivering af rengøringsmidler – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivering protokol af Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Inaktivering

For kommercielle produkter, viruspræparater (vævskulturvæske, titere fra 1 × 10⁶ til 1 × 10⁸ PFU/ml) blev behandlet i tre eksemplarer med reagenser i koncentrationer og for kontakttider, der anbefales i fabrikantens brugsanvisninger, hvis sådanne foreligger, eller for koncentrationer og tidspunkter, som testlaboratorierne specifikt havde anmodet om. Hvis producenten har angivet en række koncentrationer, blev det laveste forhold mellem produkt og prøve testet (dvs. den laveste anbefalede koncentration af testproduktet). Reagenser til transport af prøver blev testet ved hjælp af et forhold på et volumen af vævskulturvæske og ti mængder reagens, medmindre fabrikanten har angivet et volumenforhold mellem prøvevæske og reagens. Vaske- og rengøringsmidler, fiksativer og opløsningsmidler blev testet ved de angivne koncentrationer for de angivne tidspunkter. Alle inaktiveringstrin blev udført ved omgivende rumtemperatur (18 – 25°C). Til testning af alternative prøvetyper blev virustalset til den angivne prøvematrix i et forhold på 1:9 og derefter behandlet med testgenser som ovenfor. Alle forsøg omfattede tre eksemplarer af mock-behandlede prøver med et tilsvarende volumen PBS i stedet for testreageser. Umiddelbart efter den krævede kontakttid blev 1 ml behandlet prøve behandlet ved hjælp af den passende valgte filtreringsmatrix. Reagensfjernelse til inaktiveringstest blev udført i et større spinskolonneformat ved hjælp af Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) eller ved at fylde tomme Pierce 10mL kapacitetscentrifugesøjler (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20 for at give 4 ml pakket perler/harpiks. Til rensning ved hjælp af Amicon-filtre blev 2 × 500 μl prøver renset ved hjælp af to centrifugalfiltre ved hjælp af den tidligere beskrevne metode og derefter samlet sammen. Til formaldehyd og formaldehyd med fjernelse af glutaraldehyd blev der anvendt et filter med 1× 500 μl prøvevolumen, resuspenderet efter forarbejdning i 500μl PBS og tilsat 400ul MEM/5% FBS. Til inaktivering af inficerede monolag, 12,5 cm² flaber af Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/kolbe i 2,5 ml MEM/5% FBS) blev inficeret ved MOI 0,001 og inkuberet ved 37°C/5% CO₂ i 24 timer. Supernatant blev fjernet, og celler fast ved hjælp af 5 ml formaldehyd, eller formaldehyd og glutaraldehyd ved stuetemperatur i 15 eller 60 minutter. Fiksativet blev fjernet, og monolag vaskes tre gange med PBS før skrabning celler i 1mL MEM/5% FBS og sonikeret (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder ud ved 100% magt og amplitude) ved hjælp af en UP200St med VialTweeter vedhæftet fil (Hiel Ultralydscher Technology). Supernatanter blev afklaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter.

Nærmere oplysninger om reagens, der anvendes til SARS-CoV-2 coronavirus inaktivering med ultralyd VialTweeter i henhold til protokollen af Welch et al. 2020

Den fulde protokol, herunder brugen af Hielscher VialTweeter kan findes her:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikerede ultralyddisme og celleforudøre

Den multi-sample ultralydsator VialTweeter er blot en af mange ultralydsløsninger til prøvepræparation i biologiske, biokemiske og kliniske laboratorier. Hielscher Ultrasonics tilbyder den ideelle ultralyddisme til din applikation, fx cellelysis, celleekstraktion, vævshomogenisering, lysatopløserisering, opløsning, afgasning af prøver osv.
Lad os vide, hvor mange prøver du skal behandle i timen og dagen, hvis du foretrækker direkte eller indirekte sonikering, og hvad målet for ultralydprøvebehandlingen er. Vi vil anbefale dig den mest egnede ultralydsenhed til din daglige arbejdsrutine!
Hielscher Ultrasonics digitale ultralydsprocessorer er udstyret med smart software, automatisk dataoptagelse, nemme forindstillingsmuligheder for temperaturstyring, sonikeringsvarighed, cyklus/pulstilstand samt prøvebelysning og browserfjernbetjening. Vi bestræber os på at gøre vores ultralydsenheder så smarte som muligt, så din forsknings- og arbejdsrutine bliver så praktisk og vellykket som muligt.
Klik her, for at finde flere applikationer, herunder protokoller af ultralyd prøve forberedelse med VialTweeter!