Protokol til inaktivering af coronavirus SARS-CoV-2 ved sonikering

Hielscher VialTweeter er en unik ultralydsenhed til klargøring af flere prøver, som bruges til at inaktivere coronavirus SARS-COV-2. VialTweeter gør det muligt at klargøre op til 10 prøveglas samtidigt og er dermed den ideelle enhed til behandling af store mængder prøver.

Inaktivering af coronavirus SARS-CoV-2 med VialTweeter

Efter fjernelse af fikseringsmidlet blev monolagene vasket tre gange med fosfatbufferet saltvand (PBS), hvorefter cellerne blev skrabet af og overført til 1mL MEM/5% FBS og sonikeret (3 × 10 sekunder til, 10 sekunder fra ved 100% effekt og amplitude) med Hielschers ultralydsprocessor UP200St med VialTweeter -tilbehør. Supernatanterne blev klaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter.

Læs hele protokollen til inaktivering af coronavirus SARS-CoV-2 af Welch et al. (2020) nedenfor:

Celler og virus

Vero E6-celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) blev dyrket i modificeret Eagles minimum essential medium (MEM) tilsat 10% (v/v) føtalt kalveserum (FCS). Den anvendte virus var SARS-CoV-2-stammen hCOV-19/England/2/2020, som PHE isolerede fra den første patientklynge i Storbritannien den 29/01/2020. Denne virus blev modtaget ved passage 1 og anvendt til inaktiveringsstudier ved passage 2 eller 3.
Se den videnskabelige rapport af Welch et al. (2020) for oplysninger om reagenser og kemikalier anvendt til inaktivering af SARS-CoV-2 samt fjernelse af reagensernes cytotoksicitet.

Virusinaktivering med detergenter – protokol til inaktivering af coronavirus SARS-CoV-2 af Welch et al. 2020

Inaktivering af SARS-CoV-2


For kommercielle produkter blev viruspræparater (vævskulturvæske med titre fra 1 × 10⁶ til 1 × 10⁸ PFU/ml) behandlet i triplikat med reagenser ved de koncentrationer og kontakttider, der blev anbefalet i producentens brugsanvisning, hvor sådanne forelå, eller ved koncentrationer og tider, som testlaboratorier specifikt havde anmodet om. Når producenten angav et koncentrationsinterval, blev det laveste forhold mellem produkt og prøve testet (dvs. den laveste anbefalede koncentration af testproduktet). Reagenser til prøvetransportrør blev testet med et forhold på én volumendel vævskulturvæske til ti volumendele reagens, medmindre producenten havde angivet et volumenforhold mellem prøvevæske og reagens. Detergenter, fikseringsmidler og opløsningsmidler blev testet ved de angivne koncentrationer i de angivne tidsrum. Alle inaktiveringstrin blev udført ved den omgivende rumtemperatur (18 – 25°C). Ved test af alternative prøvetyper blev virus tilsat den angivne prøvematrix i forholdet 1:9, hvorefter prøven blev behandlet med testreagenser som ovenfor. Alle forsøg omfattede kontrolprøver i triplikat, som blev skinbehandlet med et tilsvarende volumen PBS i stedet for testreagenset. Umiddelbart efter den krævede kontakttid blev 1mL behandlet prøve behandlet med den passende valgte filtreringsmatrix. Fjernelse af reagenser til inaktiveringstest blev udført i et større centrifugeringskolonneformat med Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) eller ved at fylde tomme Pierce-centrifugeringskolonner med en kapacitet på 10mL (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20, så der blev opnået 4mL pakkede kugler/harpiks. Ved oprensning med Amicon-filtre blev 2 × 500μl prøver oprenset med to centrifugeringsfiltre efter den tidligere beskrevne metode og derefter samlet. Ved fjernelse af formaldehyd og formaldehyd med glutaraldehyd blev ét filter anvendt med et prøvevolumen på 1× 500μl; efter behandlingen blev prøven resuspenderet i 500μl PBS og tilsat 400ul MEM/5% FBS. Til inaktivering af inficerede monolag blev der anvendt kolber på 12,5 cm² med Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/kolbe i 2,5mL MEM/5% FBS) blev inficeret ved MOI 0,001 og inkuberet ved 37°C/5% CO₂ i 24 timer. Supernatanten blev fjernet, og cellerne blev fikseret med 5mL formaldehyd eller formaldehyd og glutaraldehyd ved stuetemperatur i 15 eller 60 minutter. Fikseringsmidlet blev fjernet, og monolagene blev vasket tre gange med PBS, før cellerne blev skrabet over i 1mL MEM/5% FBS og sonikeret (3 × 10 sekunder tændt, 10 sekunder slukket ved 100% effekt og amplitude) ved hjælp af en UP200St med VialTweeter tilbehør (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanter blev klaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter.


Oplysninger om det reagens, der blev anvendt til inaktivering af coronavirus SARS-CoV-2 med ultralydsenheden VialTweeter ifølge protokollen af Welch et al. 2020

Hele protokollen, inklusive brugen af Hielscher VialTweeter, findes her:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Avancerede ultralydsdisintegratorer og celleopbrydere

Ultralydsenheden VialTweeter til behandling af flere prøver er blot én af mange ultralydsløsninger til prøveklargøring i biologiske, biokemiske og kliniske laboratorier. Hielscher Ultrasonics tilbyder den ideelle ultralydsdisintegrator til din anvendelse, f.eks. cellelyse, celleekstraktion, vævshomogenisering, solubilisering af lysat, opløsning, afgasning af prøver osv.
Fortæl os, hvor mange prøver du skal behandle pr. time og pr. dag, om du foretrækker direkte eller indirekte sonikering, og hvad formålet med ultralydsbehandlingen af prøverne er. Vi anbefaler den bedst egnede ultralydsenhed til dit daglige arbejde!
Hielscher Ultrasonics’ digitale ultralydsprocessorer er udstyret med intelligent software, automatisk dataregistrering, nemme muligheder for forudindstilling af temperaturstyring, sonikeringsvarighed og cyklus-/pulstilstand samt prøvebelysning og fjernstyring via browser. Vi bestræber os på at gøre vores ultralydsenheder så intelligente som muligt, så din forskning og dit daglige arbejde bliver så bekvemt og vellykket som muligt.
Klik her for at finde flere anvendelser, herunder protokoller til prøveklargøring med ultralyd med VialTweeter!