Protokol for SARS-CoV-2 Coronavirus-inaktivering med sonikering

Hielscher VialTweeter er en unik ultralydsenhed med flere prøver, der bruges til at inaktivere coronavirus SARS-COV-2. VialTweeter gør det muligt at forberede op til 10 prøvehætteglas samtidigt og er dermed den ideelle enhed til masseprøvebehandling.

Inaktivering af SARS-CoV-2 Coronavirus med VialTweeter

Efter fjernelse af fikseringsmidlet blev monolag vasket tre gange med fosfatbufret saltvand (PBS), før celler skrabes i 1 ml MEM / 5% FBS og sonikeres (3 × 10 sekunder tændt, 10 sekunder slukket ved 100% effekt og amplitude) ved hjælp af Hielscher ultralydsprocessor UP200St med VialTweeter vedhæftet fil. Supernatanter blev klaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter. 

Læs hele protokollen her for SARS-CoV-2 coronavirus-inaktivering af Welch et al. (2020) nedenfor:

Celler og virus

Vero E6-celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) blev dyrket i modificeret Eagle's minimum essential medium (MEM) suppleret med 10 % (v/v) føtalt kalveserum (FCS). Den anvendte virus var SARS-CoV-2-stamme hCOV-19/England/2/2020, isoleret af PHE fra den første patientklynge i Storbritannien den 29/01/2020. Denne virus blev opnået ved passage 1 og brugt til inaktiveringsundersøgelser ved passage 2 eller 3.
For reagenser og kemikalier, der anvendes til SARS-CoV-2-inaktivering samt fjernelse af reagenscytotoksicitet, se den videnskabelige rapport fra Welch et al. (2020).

Virusinaktivering af vaskemidler – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktiveringsprotokol af Welch et al. 2020

SARS-CoV-2-inaktivering

For kommercielle produkter, viruspræparater (vævskulturvæske, titere fra 1 × 10⁶ til 1 × 10⁸ PFU/ml) blev behandlet i tre eksemplarer med reagenser i koncentrationer og kontakttider, der anbefales i fremstillerens brugsanvisning, hvis sådanne foreligger, eller for koncentrationer og tidspunkter, der specifikt er anmodet om af testlaboratorier. Hvis producenten har angivet et koncentrationsinterval, testes det laveste forhold mellem produkt og prøve (dvs. den laveste anbefalede koncentration af testproduktet). Reagenser fra prøvetransportrør blev testet ved hjælp af et forhold mellem et volumen vævskulturvæske og ti volumener reagens, medmindre producenten specificerede et volumenforhold mellem prøvevæske og reagens. Rengøringsmidler, fikseringsmidler og opløsningsmidler blev testet ved de angivne koncentrationer for de angivne tidspunkter. Alle inaktiveringstrin blev udført ved omgivende stuetemperatur (18 – 25 °C). Til test af alternative prøvetyper blev virus tilsat den angivne prøvematrix i forholdet 1:9 og derefter behandlet med testreagenser som ovenfor. Alle eksperimenter omfattede tredobbelte kontrolprøvebehandlede prøver med et tilsvarende volumen PBS i stedet for testreagens. Umiddelbart efter den krævede kontakttid blev 1 ml behandlet prøve ved hjælp af den passende valgte filtreringsmatrix. Reagensfjernelse til inaktiveringstest blev udført i et større spin-kolonneformat ved hjælp af Pierce 4 ml centrifugeringskolonner til fjernelse af vaskemiddel (Thermo Fisher) eller ved at fylde tomme Pierce 10 ml centrifugekolonner (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20 for at give 4 ml pakkede perler/harpiks. Til oprensning ved hjælp af Amicon-filtre blev 2 × 500 μl-prøver oprenset ved hjælp af to centrifugalfiltre ved hjælp af den tidligere beskrevne metode og derefter samlet sammen. Til formaldehyd og formaldehyd med fjernelse af glutaraldehyd blev der anvendt et filter med 1× 500 μl prøvevolumen, resuspenderet efter behandling i 500 μl PBS og tilsat 400 ul MEM/5 % FBS. Til inaktivering af inficerede Enkeltlag, 12,5 cm² kolber med Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/kolbe i 2,5 ml MEM/5 % FBS) blev inficeret ved MOI 0,001 og inkuberet ved 37 °C/5 % CO₂ i 24 timer. Supernatanten blev fjernet, og cellerne fikserede ved hjælp af 5 ml formaldehyd eller formaldehyd og glutaraldehyd ved stuetemperatur i 15 eller 60 minutter. Fikseringsmidlet blev fjernet, og monolag blev vasket tre gange med PBS, før cellerne blev skrabet i 1 ml MEM / 5% FBS og sonikeret (3 × 10 sekunder tændt, 10 sekunder slukket ved 100% effekt og amplitude) ved hjælp af en UP200St med VialTweeter-vedhæftning (Hielscher ultralydsteknologi). Supernatanter blev klaret ved centrifugering ved 3000 × g i 10 minutter.

Detaljer om det reagens, der anvendes til SARS-CoV-2 coronavirus-inaktivering med ultralyd VialTweeter i henhold til protokollen af Welch et al. 2020

Den fulde protokol inklusive brugen af Hielscher VialTweeter kan findes her:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikerede ultralydsdismembratorer og celleforstyrrende stoffer

Multi-prøve ultralydsapparat VialTweeter er blot en af mange ultralydsløsninger til prøveforberedelse i biologiske, biokemiske og kliniske laboratorier. Hielscher Ultrasonics tilbyder den ideelle ultralydsdismembrator til din applikation, f.eks. cellelyse, celleekstraktion, vævshomogenisering, lysatopløselighed, opløsning, prøveafgasning osv.
Fortæl os, hvor mange prøver du skal behandle i timen og dagen, hvis du foretrækker direkte eller indirekte sonikering, og hvad målet for ultralydsprøvebehandlingen er. Vi vil anbefale dig den bedst egnede ultralydsenhed til din daglige arbejdsrutine!
Hielscher Ultrasonics' digitale ultralydsprocessorer er udstyret med smart software, automatisk dataoptagelse, nemme forudindstillingsmuligheder for temperaturkontrol, sonikeringsvarighed, cyklus / pulstilstand samt prøvebelysning og browserfjernbetjening. Vi stræber efter at gøre vores ultralydsenheder så smarte som muligt, så din forsknings- og arbejdsrutine bliver så bekvem og vellykket som muligt.
Klik her for at finde flere applikationer, herunder protokoller for ultralydsprøveforberedelse med VialTweeter!