Prøve forberedelse med ultralyd VialTweeter

Prøvepræparat før analyse kan kræve forskellige præanalytiske processer såsom vævshomogenisering, lysis, ekstraktion af proteiner, DNA, RNA, organeller og andre intracellulære stoffer, opløsning og afgasning. VialTweeter er en unik ultralydsenhed, der forbereder flere prøverør samtidigt under nøjagtig de samme forhold. På grund af indirekte sonikering af lukkede reagensglas undgås krydskontaminering og tab af prøver.

Forberedelse af ultralyds prøve

Ultralydbehandling er en almindelig teknik til prøvebehandling for at gøre prøven klar til analyser såsom polymerer kædereaktion (PCR), Western Blots, assays, molekylær sekventering, kromatografi osv. Ultralydbehandling er en teknik, der i vid udstrækning anvendes i laboratorier til behandling af prøver, der er præanalytisk. En stor fordel ved sonikering er, at arbejdsprincippet af ultralyd er baseret på rent mekaniske kræfter. Ultralydlysis og celleforstyrrelser opnås ved sonomekaniske forskydningskræfter, hvilket giver ultralydbehandling den fordel, at de opløsningsmidler, der anvendes til proteinekstraktion, også kan anvendes under lysis. Ultralydcelleforryddelsesmidler såsom VialTweeter bryder cellevæggene / membranerne og fremmer masseoverførsel mellem celleinteriør og opløsningsmiddel. Derved overføres analysanden (f.eks. DNA, RNA, proteiner, organeller osv.) effektivt fra cellematrixen til opløsningsmidlet. Det betyder, at trinene til dæmpning og ekstraktion overlapper med ultralydcelleafbrydelsesprocessen, hvilket gør ultralydslyse meget effektiv. Desuden kræver ultralydsprøveforberedelse ikke rengøringsmidler og andre lysis reagenser, som kan ændre og ødelægge lysatets struktur og er kendt for de efterfølgende problemer med rensning. En anden lysis metode, den enzymatiske afbrydelse kræver lange inkubationstider og leverer ofte ikke-reproducerbare resultater. Ultralyd prøve forberedelse overvinder almindelige problemer i prøvepræparat såsom væv homogenisering, celleforstyrrelser, lysis, protein ekstraktion og lysat opløselighed. Da intensiteten af ultralydsbehandling kan styres nøjagtigt og justeres til den biologiske prøve, undgås nedbrydning og prøvetab. Automatisk overvåget og kontrolleret prøvetemperatur, pulstilstand og sonikeringsvarighed sikrer optimale resultater.

VialTweeter er især praktisk til laboratoriearbejde, der kræver samtidig forberedelse af flere prøver under de samme betingelser. VialTweeter er en ultralydsbloksionotrode, der kan rumme op til 10 hætteglas (f.eks. Da ultralydsenergien kobles gennem hætteglassenes vægge i prøvemediet, holder hætteglassene lukket under behandlingen. Derved undgås tab af prøver og krydskontaminering fuldstændigt.

Hætteglas og rør, der passer til VialTweeter

VialTweeter er velegnet til at rumme 10 almindelige koniske eller rundbundede rør såsom Eppendorf, centrifuge, kryohætteglas og forskellige NUNC hætteglastyper, men hullerne kan tilpasses til andre hætteglas og rørstørrelser efter anmodning. Lad os vide, hvilken slags reagensglas du vil bruge, så vi kan ændre din VialTweeter i overensstemmelse hermed. For større reagensglas som Falcon-rør og andre testbeholdere, bægerglas og kar er VialPress en praktisk løsning.

VialTweeter med VialPress

Mens VialTweeter selv med sine 10 rør huller er allerede en unik og yderst funktionel ultralyd enhed, VialPress add-on gør VialTweeter endnu mere alsidig og fleksibel til drift. Den VialPress er et tilbehør til VialTweeter bestående af en klemme-on bar, der gør det muligt at fiksere større prøverør såsom Falcon rør eller andre små til mellemstore testbæger til VialTweeter front. Billedet til venstre viser VialTweeter holder 10 Eppendorf hætteglas i blokken, mens VialPress fikserer en større reagensglas til fronten for sonikering. VialPress er i stand til at rumme op til 5 større reagensglas til intens sonikering.

Protokoller til forberedelse af vialtweeterprøveforberedelse

VialTweeter er almindeligt anvendt til at sonikere biologiske prøver. Før analyse skal prøverne forberedes til biokemiske eller biofysiske analyser og analyser, fx ved lysis, vævshomogenisering, proteinekstraktion, DNA / RNA-klipning, afgasning osv. VialTweeter opfylder disse ultralydsprocesser pålideligt og giver reproducerbare resultater. En almindelig anvendelse af VialTweeter er lysis / celle afbrydelse af pattedyr (mennesker og dyr) væv samt bakterier celler og virale partikler. Vellykket VialTweeter-behandlede biologiske prøver omfatter menneskelige lunge epitelceller, hæmatopoietiske stamceller, myeloid leukæmi celler, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Streptococcus pyogener, Caulobacter halvmåne, Mycoplasma pneumoniae, mykobakterier / Mycobacterium tuberkulose kompleks (MTBC) og mange andre bakterielle, botaniske og mikrobielle celler.
Nedenfor kan du finde et par udvalgte protokoller med VialTweeter.

E.Coli Lysis Med VialTweeter for In-Vivo Glutathion Bestemmelse

Escherichia coli bakterier af stammen MG1655 blev dyrket i MOPS minimal medium i et samlet volumen på 200ml indtil en A600 på 0,5 blev nået. Kulturen blev opdelt i 50 ml kulturer til stressbehandling. Efter 15 min inkubation med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimethylsulfoxid (kontrol) blev cellerne høstet ved 4.000 g ved 4°C i 10 min. Cellerne blev vasket to gange med KPE-buffer, før pellets blev gensuspensioneret i 700μl KPE-buffer. Til deproteinering blev der tilsat 300μl 10 % (w/v) sulfosalicylsyre før afbrydelse af celler ved ultralydbehandling (3 x 1 min; Hættevejslydator). Supernatanter blev indsamlet efter centrifugering (30 min, 13.000 g, 4°C). Koncentrationen af sulfosalicylsyre faldt til 1 % ved tilsætning af 3 volumener KPE-buffer. Målinger af total glutathion og GSSG blev udført som beskrevet ovenfor. Cellulære glutathionkoncentrationer blev beregnet baseret på et volumen af E. coli celler på 6,7×10-15 liter og en celletæthed på A600 0,5 (svarende til 1×108 celler ml-1 kultur). GSH-koncentrationerne blev beregnet ved subtraktion på 2[GSSG] fra total glutathion. (Müller et al. 2016)

Celle lysis med VialTweeter før Grafit Furnace Atomic Absorption Spectrometri

Bacillus subtilis 168 (trpC2) blev udsat for 15 min af antibiotika stress, derefter celler blev høstet ved 3.320 x g, vasket fem gange med 100 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7,5, resuspended i 10 mM Tris, pH 7,5 og forstyrret af ultralydbehandling i en Hielscher VialTweeter instrument. (Wenzel et al. 2014)

Hætteglasprøvepræparat før massespektrometri

De frysetørrede cellepiller i humane CD34􏰀 hæmatopoietiske stamceller/progenitorceller blev resuspenderet i 10μ􏰇l (200μl til bulk HEK293 præparat til peptidfortyndingsserien) på 8 M urea i 100 mM ammonium hydrogencarbonat og lyset hjulpet af sonikering med Hielscher VialTweeter ved en amplitude på 60%, en cyklus på 60% og en varighed på 20'erne i tre gange med mellemliggende køling på is. (Amon et al. 2019)

Prøve preparation protokoller ved hjælp af VialPress

Frisk salat (Lactuca sativa) blev homogeniseret i 0,5 M HEPES buffer (pH 8, KOH justeret) ved et forhold på 1 g plante (frisk vægt) til 200, 100, 50 eller 20 ml bufferopløsning. Forholdet mellem plantmasse til bufferopløsningsvolumen blev varieret for at holde det samlede homogene volumen mellem 3,5 og 12 ml. Forholdet mellem plantmasse til bufferopløsningsvolumen blev varieret for at holde det samlede homogene volumen mellem 3,5 og 12 ml, hvilket gjorde det muligt at homogenisere med sonden. Homogenates gennemgik derefter indirekte ultralydbehandling ved hjælp af en UP200St med VialTweeter udstyret med 200xt VialPress (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i 3 min (80% puls og 100% effekt). Brug af denne enhed undgået forurening. (Laughton et al. 2019)

Pålidelig temperaturkontrol under sonikering med VialTweeter

Temperatur er en afgørende proces-påvirke faktor, der er særligt vigtigt for behandlingen af biologiske prøver. Som alle mekaniske prøve forberedelse teknikker, sonikering skaber varme. Prøverne kan dog kontrolleres godt, når vialTweeter anvendes. Vi præsenterer dig forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen af dine prøver, mens du forbereder dem med VialTweeter og VialPress til analyse.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med en intelligent software og en justerbar temperatursensor. Sæt temperatursensoren i UP200St, og sæt spidsen af temperaturføleren i et af prøverørene. Via digital farvet touch-display kan du i menuen i UP200St angive et specifikt temperaturområde til din prøvesoning. Ultralydsonicatoren stopper automatisk, når max temperaturen er nået, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er nede på den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Så starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. VialTweeter-blokken kan afkøles på forhånd. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotrode uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også afkøles på forhånd.
3. Brug tøris til afkøling under sonikering. Brug en lavvandet bakke fyldt med tøris og læg VialTweeter på tørisen, så varmen hurtigt kan sprede sig.

Kunder over hele verden bruger VialTweeter og VialPress til deres daglige prøveforberedelsesarbejde i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Den intelligente software og temperaturkontrol af UP200St processor, temperaturen er pålideligt kontrolleret og varme-induceret prøve nedbrydning undgås. Ultralyd prøve forberedelse med VialTweeter og VialPress leverer meget pålidelige og reproducerbare resultater!

Tekniske detaljer af VialTweeter

VialTweeter er en bloksnotrod lavet af titanium, der kan rumme op til 10 hætteglas i hullerne i blokken. Derudover kan op til 5 større reagensglas fastspændes til VialTweeter-fronten ved hjælp af VialPress. VialTweeter er konstrueret således, at ultralydsenergien fordeles ensartet i hvert indsat hætteglas for at sikre pålidelige og ensartede sonikeringsresultater. En lille pivot justerer VialTweeter sonotrode til ujævnt terræn og justere reagensglas lodret.

Fordele ved VialTweeter et overblik

• Intensiv lydbehandling af op til 10 hætteglas samtidigt
• Indirekte sonikering ved høj ultralyds intensitet gennem fartøjs væggen i prøven
• Indirekte lydbehandling undgår krydskontaminering og prøvetab
• Reproducerbare resultater på grund af justerbar og kontrollerbar sonikering amplitude
• VialPress giver dig mulighed for at sonikatere større rør
• Justerbar amplitude fra 20 til 100%
• Justerbar pulsfunktion fra 0 til 100%
• autoklaverbar

VialTweeter er drevet af UP200St, en 200 watt kraftfuld ultralydsprocessor. UP200St er udstyret med en intelligent software, der giver mulighed for præcis kontrol over alle vigtige ultralydsprocesparametre som amplitude, sonikeringstid, pulsering og temperatur. Dette gør VialTweeter til et pålideligt værktøj til vellykkede reproducerbare procesresultater i biologiske og biokemiske laboratorier.
Amplitude kan justeres mellem 20 og 100% og giver dermed mulighed for at tilpasse ultralydintensiteten til din prøve. For eksempel kræver klipning og fragmentering af DNA og RNA en mildere amplitude for at forhindre produktion af for små DNA-fragmenter, vævshomogenisering af musehjernen kræver højintensitetssondering. Vælg den ideelle amplitude, lydintensitet og varighed via den smarte og intuitive menu på UP200St-processoren. Menuen og indstillingerne kan nemt tilgås og betjenes via farvet touch display. I indstillingerne kan du forudindstille sonikeringsparametre som amplitude, pulsering/cyklustilstand, sonikeringsvarighed, samlet energiinput og temperaturgrænser. Inden for forskning og produktion er repeterbarheden af forsøg og testresultater afgørende. Det betyder, at den præcise registrering af procesbetingelser og sonikeringsprotokoller er fuldstændig vigtige. Den automatiske dataprotokoller skriver alle sonikeringsdata i en CSV-fil på et integreret SD-kort, så du nemt kan kontrollere og sammenligne forskellige sonikeringskørsler. Alle ultralydsprocesdata kan nemt tilgås og deles som CSV-fil.
Hielscher Ultrasonics bestræber sig på at give dig avanceret teknologi til at lette og forbedre dit forskningsarbejde!