Ultralydsprøveforberedelse til ELISA-analyser

Assays som f.eks. ELISA anvendes i vid udstrækning til in vitro-diagnostik, sygdomsrelateret proteinpåvisning og kvalitetskontrol (f.eks. overvågning af fødevareallergener). Ultralydsprøveforberedelse er en hurtig, pålidelig og reproducerbar teknik til at lyse celle og isolere intracellulære proteiner, DNA, RNA og organeller. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til bekvem fremstilling af enkeltprøver, flere hætteglas samt til mikrotiterplader og 96-brønds plader.

ELISA – Enzymbundet immunosorbentanalyse

ELISA står for enzym-linked immunosorbent assay og er en meget anvendt biokemisk analyseteknik i kategorien ligandbindende assays. I ELISA tilsættes en flydende prøve på en stationær fast fase med særlige bindingsegenskaber. Normalt påføres den stationære faste fase som belægning på en brøndplade eller ELISA-plade. Derefter tilsættes forskellige flydende reagenser sekventielt, inkuberes og vaskes, så der til sidst sker en optisk ændring (f.eks. farveudvikling ved produktet af en enzymatisk reaktion) i den endelige væske i brønden. Den optiske ændring gør det muligt at måle mængden af analysanden ved hjælp af en såkaldt kvantitativ “læsning". Til den kvantitative aflæsning bruges et spektrofotometer, fluorometer eller luminometer til at detektere og måle intensiteten af det transmitterede lys. Detektionsfølsomheden påvirkes af forstærkningen af signalet under de analytiske reaktioner. Da enzymreaktioner er godt undersøgt og pålidelige amplifikationsprocesser, bruges enzymer til at skabe signalet. Enzymerne er knyttet til detektionsreagenserne i faste proportioner for at muliggøre nøjagtig kvantificering, hvilket også forklarer navnet "enzymbundet" immunosorbentassay.
Da ELISA-assays udføres i mikrotiterplader / 96-brønds plader, er det kendt som pladebaseret assay-teknik og bruges f.eks. i klinisk in vitro-diagnostik, forskning, lægemiddeludvikling mv. til påvisning og kvantificering af antistoffer, peptider, proteiner og hormoner.
ELISA-teknikken bruges ofte som et diagnostisk værktøj inden for medicin, bioteknologi, plantepatologi og er også en vigtig kvalitetskontrolmåling i flere brancher.

Ultralydsprøveforberedelse før ELISA

Før ELISA-analysen kan udføres, kræver prøverne forberedelsestrin såsom cellelyse og ekstraktion af intracellulære proteiner, DNA, RNA osv. Fordelen ved ultralydscellelyse og proteinisolering er dens høje effektivitet, pålidelighed og reproducerbarhed. Alle disse faktorer er vigtige for at opnå diagnostik og forskningsresultater af høj kvalitet

Protokol for præ-ELISA ultralydscellelyse

• For cellekulturer: Før ultralydscellelysen centrifugeres celler i 5 minutter ved 270 x g i en mikrocentrifuge. Fjern supernatanten ved aspiration og resuspender celler i 30 – 100 μL RIPA-buffer. Inkuber derefter cellepelleten på is i 30 min.
• Nu er celleprøven klar til ultralydslys:
  Brug en sonde-type ultralydsapparat (f.eks. UP200Ht med S26d2-sonde) eller en ultralyds-multiprøveenhed (f.eks. VialTweeter til samtidig sonikering af op til 10 hætteglas eller UIP400MPT til mikrotiterplader / 96-brønds plader) afhængigt af mængden af prøver, du har brug for at forberede.
  Til sonde-type sonde-type sonikering af en enkelt prøve skal du placere cellerne i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
• Indstil din ultralydsvarighed, samlede energiindgang, cyklustilstand og / eller temperaturgrænser i ultralydsapparatets digitale menu. Dette sikrer meget pålidelig sonikering og repeterbarhed.
• Indsæt sonotroden og tænd for ultralydsenheden. Flyt forsigtigt mikrospidsen af ultralydssonden gennem prøven for at sonikere prøven ensartet.
  For de fleste celler vil ultralydslyse blive afsluttet efter 2-4 cyklusser på 10 sek sonikering.
• Efter sonikering skal du fjerne sonotroden fra prøven. Prøverne skal inkuberes på is i 5 min. Centrifuger derefter ved 10.000 x g i 20 minutter for at pellere affaldet. Overfør supernatanterne til et nyt mikrocentrifugerør. Mærk analytterne og opbevar ved -20°C.
• Ultralyd sonotroden kan rengøres ved at tørre den ordentligt af med alkohol eller sonikere i et bæger fyldt med alkohol, f.eks. 70% ethanol. Alle ultralydssonder fremstillet af titanium er autoklaverbare.

• Skyl vævet med iskold PBS (0,01 M, pH=7,4) for at fjerne overskydende hæmolyseblod grundigt.
• Vej vævet (nyre, hjerte, lunge, milt osv.) og macerer det i små stykker, som homogeniseres i PBS. Mængden af PBS, der kræves, er relateret til vævets vægt. Som tommelfingerregel kræver 1 g væv ca. 9 ml PBS. Det anbefales at tilføje noget proteasehæmmer til PBS. (RIPA eller hypotonisk lysebuffer indeholdende protease- og fosfatasehæmmercocktail kan bruges alternativt.)
• Afhængig af vævets størrelse kan en kort hvirvelbehandling (ca. 1-2 min. på 15 sek. impulser) være nyttig til at forbehandle vævet.
• Monter en mikrospids, f.eks. S26d2, på din ultralydsapparat. Anbring prøverøret med vævet i et isbad.
• Soniker prøven med din ultralydsapparat, f.eks. UP200St (80% amplitude) i 1 min. i pulstilstand (15 sek tændt, 15 sek pause). Opbevar prøven i isbadet.
• Homogenaterne centrifugeres derefter for at opnå specifikke puljer (cytosoliske, nukleare, mitokondrielle eller lysosomale) for at berige proteinet til analyse. Ved centrifugering af prøven i 5 minutter ved 5000×g udtages supernatanten.

Pålidelig temperaturkontrol under sonikering

Temperatur er en afgørende procespåvirkende faktor, der er særlig vigtig for behandling af biologiske prøver, f.eks. for at forhindre termisk nedbrydning af proteiner. Som alle mekaniske prøveforberedelsesteknikker skaber sonikering varme. Temperaturen på prøverne kan dog kontrolleres godt, når du bruger Hielscher Ultrasonics-enhederne. Vi præsenterer dig forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen på dine prøver, mens du forbereder dem med en sonde-type ultralydsapparat eller VialTweeter præanalytisk.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Alle Hielscher digitale ultralydsprocessorer er udstyret med en intelligent software og en tilsluttbar temperatursensor. Sæt temperatursensoren i ultralydsenheden (f.eks. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) og indsæt spidsen af temperaturføleren i et af prøverørene. Via digitalt farvet berøringsdisplay kan du indstille i menuen på ultralydsprocessoren et specifikt temperaturområde for din prøvesonikering. Ultralydsapparatet stopper automatisk, når den maksimale temperatur er nået, og holder pause, indtil sample temperaturen er nede til den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. Med hensyn til ultralydsenheden VialTweeter kan titaniumblokken, der holder prøverørene, forkøles. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også forkøles.
3. Brug et isbad eller tøris til at afkøle under sonikering. Placer din sample rør (r) under sonikering i et isbad. Til VialTweeteren skal du bruge en lav bakke fyldt med tøris og placere VialTweeteren på tørisen, så varmen hurtigt kan forsvinde.

Kunder over hele verden bruger Hielscher sonde-ultralydapparater såvel som multi-sample sonikeringsenhederne VialTweeter og UIP400MTP til deres daglige prøveforberedelsesarbejde i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Den intelligente software og temperaturstyring af Hielscher-processorerne, temperaturen kontrolleres pålideligt og varmeinduceret prøvenedbrydning undgås. Ultralydsprøveforberedelse med Hielscher ultralydsløsninger giver meget pålidelige og reproducerbare resultater!