Ultralyd prøve Prep til ELISA Assays

Analyser såsom ELISA anvendes i vid udstrækning til in vitro-diagnostik, sygdomsrelateret proteindetektion og kvalitetskontrol (f.eks. overvågning af fødevareallergener). Ultralyd prøvepræparat er en hurtig, pålidelig og reproducerbar teknik til lyse celle og isolere intracellulære proteiner, DNA, RNA og organeller. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til bekvem forberedelse af enkeltprøver, flere hætteglas samt til mikrotiterplader og 96-brøndplader.

Elisa – Enzym-linked immunosorbent analyse

ELISA står for enzym-forbundet immunosorbent analyse og er en udbredt biokemisk analyse teknik af kategorien ligand-bindende analyser. I ELISA tilsættes en flydende prøve til en stationær fast fase med særlige bindingsegenskaber. Normalt påføres den stationære faste fase som belægning på en brøndplade eller ELISA-plade. Derefter tilsættes, inkuberes og vaskes forskellige flydende reagenser sekventielt, så der endelig sker en optisk ændring (f.eks. farveudvikling ved hjælp af produktet af en enzymatisk reaktion) i den endelige væske i brønden. Den optiske ændring gør det muligt at måle analysandens mængde ved hjælp af en såkaldt kvantitativ “læsning". Til kvantitativ aflæsning anvendes et spektrofotometer, fluorometer eller et luminometer til at detektere og måle intensiteten af det transmitterede lys. Detektionens følsomhed påvirkes af forstærkningen af signalet under de analytiske reaktioner. Da enzymreaktioner er godt undersøgt og pålidelige forstærkningsprocesser, bruges enzymer til at skabe signalet. Enzymerne er knyttet til detektionsreagenserne i faste proportioner for at muliggøre nøjagtig kvantificering, hvilket også forklarer navnet "enzymrelateret" immunosorbentanalyse.
Da ELISA-analyser udføres i mikrotiterplader / 96-brøndsplader, er det kendt som pladebaseret analyseteknik og anvendes fx i klinisk in vitro-diagnostik, forskning, lægemiddeludvikling osv.
ELISA-teknikken anvendes ofte som et diagnostisk værktøj inden for medicin, biotek, plantepatologi og er også en vigtig kvalitetskontrolmåling i flere brancher.

Ultralyd prøve Prep før ELISA

Før ELISA-analysen kan udføres, kræver prøverne trin til forberedelse af sådanne cellelys og ekstraktion af intracellulære proteiner, DNA, RNA osv. Fordelen ved ultralydcellelysis og proteinisolering er dens høje effektivitet, pålidelighed og reproducerbarhed. Alle disse faktorer er vigtige for at opnå diagnostik og forskningsresultater af høj kvalitet

Protokol for pre-ELISA ultralydcellelysis

• For cellekulturer: Før ultralydcellelyse, centrifugeceller i 5 minutter ved 270 x g i en mikrocentrifuge. Fjern supernatanten ved aspiration og resuspenderede celler i 30 – 100 μL RIPA-buffer. Derefter inkuberes cellepilpellet på is i 30 min.
• Nu er celleprøven klar til ultralydslysis:
  Brug en ultralydsmaskine af sondetypen (f.eks. Uf200 ः t med S26d2-sonde) eller en ultralyds multiprøveanordning (f.eks.
  Til sonde-type sonikering af en enkelt prøve, placere cellerne i 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
• Forudindstille din ultralydsvarighed, totale energiindgang, cyklustilstand og/eller temperaturgrænser i ultralydsmaskinens digitale menu. Dette sikrer meget pålidelig sonikering og repeterbarhed.
• Indskift sonotrode og tænd ultralydsenheden. Flyt forsigtigt mikrospidsen af ultralydsonden gennem prøven for at sonikere prøven ensartet.
  For de fleste celler, ultralyd lysis vil blive afsluttet efter 2 -4 cyklusser af 10 sek sonikering.
• Efter sonikering fjernes sonotroden fra prøven. Prøverne skal inkuberes på is i 5 min. Derefter centrifuge på 10.000 x g i 20 min at pellet snavs. Overfør supernatanterne til et nyt mikrocentrifugerør. Anlæmmer analytterne, og opbevar ved -20°C.
• Ultralydssonotrode kan rengøres ved at tørre det ordentligt med alkohol eller soniker i et bægerglas fyldt med alkohol, f.eks. Alle ultralydssonder fremstillet af titanium er autoclavable.

For vævshomogenater:

• Skyl vævet med iskold PBS (0,01 M, pH=7,4) for at fjerne overskydende hæmolyseblod grundigt.
• Væv (nyre, hjerte, lunge, milt osv.) vejes og bøvser det i små stykker, som homogeniseres i PBS. Mængden af PBS, der kræves, er relateret til vævets vægt. Som tommelfingerregel kræver 1 g væv ca. 9 ml PBS. Det anbefales at tilføje nogle proteasehæmmer til PBS. (RIPA eller hypotonisk lysis buffer indeholdende protease og fosfatasehæmmer cocktail kan anvendes alternativt.)
• Afhængigt af vævsstørrelsen kan en kort vortexbehandling (ca. 1-2 min. i 15 sek. pulser) være nyttig til forbehandling af vævet.
• Monter en mikrospids, fx S26d2, på din ultralydsmaskine. Prøverøret anbringes med vævet i et isbad.
• Sonikere prøven med din ultralydsudent, fx UP200St (80% amplitude) i 1 min. i pulstilstand (15 sek. på, 15sek pause). Hold prøven i isbadet.
• Homogenaterne centrifugeres derefter for at opnå specifikke puljer (cykliske, nukleare, mitokondrielle eller lysosomale) for at berige proteinet til analyse. Ved centrifugering prøven i 5 minutter ved 5000×g, supernatant hentes.

Pålidelig temperaturkontrol under sonikering

Temperatur er en afgørende procesfaktor, der er særlig vigtig for behandlingen af biologiske prøver, f.eks. Som alle mekaniske prøve forberedelse teknikker, sonikering skaber varme. Men, temperaturen af prøverne kan være godt kontrolleret, når du bruger Hielscher Ultrasonics enheder. Vi præsenterer dig forskellige muligheder for at overvåge og styre temperaturen af dine prøver, mens du forbereder dem med en sonde-type ultralydsværktøj eller VialTweeter pre-analytisk.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Alle Hielscher digitale ultralydsprocessorer er udstyret med en intelligent software og en justerbar temperatursensor. Sæt temperatursensoren i ultralydsenheden (f.eks. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP), og sæt spidsen af temperaturføleren i et af prøverørene. Via digital farvet touch-display kan du i menuen på ultralydsprocessoren angive et specifikt temperaturområde til din prøvesonication. Ultralydsonicatoren stopper automatisk, når max temperaturen er nået, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er nede på den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Så starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. Med hensyn til ultralyd multi-prøve enhed VialTweeter, titanium blok, som holder prøven rør, kan forkøles. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotrode uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også afkøles på forhånd.
3. Brug et isbad eller tøris til afkøling under sonikering. Placer prøverøret(e) under sonikering i et isbad. Brug en lavvandet bakke fyldt med tøris til VialTweeteren, og anslænk VialTweeteren på tørisen, så varmen hurtigt kan spredes.

Kunder over hele verden bruger Hielscher sonde-ultrasonicators samt multi-prøve sonikering enheder VialTweeter og UIP400MTP for deres daglige prøve forberedelse arbejde i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Den intelligente software og temperaturkontrol af Hielscher processorer, temperatur er pålideligt kontrolleret og varme-induceret prøve nedbrydning undgås. Ultralyd prøve forberedelse med Hielscher ultralydsløsninger leverer meget pålidelige og reproducerbare resultater!