Prøveforberedelse med ultralyd til ELISA-analyser

Analyser som ELISA anvendes i vid udstrækning til in vitro-diagnostik, påvisning af sygdomsrelaterede proteiner og kvalitetskontrol (f.eks. overvågning af fødevareallergener). Prøveforberedelse med ultralyd er en hurtig, pålidelig og reproducerbar teknik til at lysere celler og isolere intracellulære proteiner, DNA, RNA og organeller. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til nem forberedelse af enkeltprøver, flere prøveglas samt mikrotiterplader og plader med 96 brønde.

ELISA – enzymkoblet immunosorbentassay

ELISA står for enzymkoblet immunosorbentassay og er en udbredt biokemisk analyseteknik inden for kategorien af ligandbindingsanalyser. Ved ELISA tilsættes en væskeprøve til en stationær fast fase med særlige bindingsegenskaber. Normalt påføres den stationære faste fase som en belægning på en brøndplade eller ELISA-plade. Derefter tilsættes forskellige flydende reagenser sekventielt, inkuberes og vaskes, så der til sidst sker en optisk ændring (f.eks. farveudvikling som følge af produktet fra en enzymatisk reaktion) i den endelige væske i brønden. Den optiske ændring gør det muligt at måle mængden af analytten ved en såkaldt kvantitativ ”aflæsning”. Til den kvantitative aflæsning anvendes et spektrofotometer, fluorometer eller luminometer til at registrere og måle intensiteten af det transmitterede lys. Detektionens følsomhed påvirkes af signalets forstærkning under de analytiske reaktioner. Da enzymreaktioner er velundersøgte og pålidelige forstærkningsprocesser, anvendes enzymer til at generere signalet. Enzymerne er koblet til detektionsreagenserne i faste forhold for at muliggøre præcis kvantificering, hvilket også forklarer betegnelsen ”enzymkoblet” immunosorbentassay.
Da ELISA-analyser udføres i mikrotiterplader / plader med 96 brønde, er teknikken kendt som en pladebaseret analyseteknik og anvendes f.eks. inden for klinisk in vitro-diagnostik, forskning, lægemiddeludvikling osv. til at påvise og kvantificere antistoffer, peptider, proteiner og hormoner.
ELISA-teknikken anvendes ofte som et diagnostisk værktøj inden for medicin, bioteknologi og plantepatologi og er også en vigtig kvalitetskontrolmåling i flere industrier.

Prøveforberedelse med ultralyd før ELISA

Før ELISA-analysen kan udføres, skal prøverne gennemgå forberedelsestrin såsom cellelyse og ekstraktion af intracellulære proteiner, DNA, RNA osv. Fordelen ved cellelyse og proteinisolering med ultralyd er den høje effektivitet, pålidelighed og reproducerbarhed. Alle disse faktorer er vigtige for at opnå diagnostik og forskningsresultater af høj kvalitet

Protokol for cellelyse med ultralyd før ELISA

• For cellekulturer: Før cellelysen med ultralyd centrifugeres cellerne i 5 min ved 270 x g i en mikrocentrifuge. Fjern supernatanten ved aspiration, og resuspender cellerne i 30 – 100 μL RIPA-buffer. Inkuber derefter cellepelleten på is i 30 min.
• Nu er celleprøven klar til ultralydslyse:
  Brug en ultralydsenhed med sonde (f.eks. UP200Ht med S26d2-sonde) eller en ultralydsenhed til flere prøver (f.eks. VialTweeter til samtidig sonikering af op til 10 prøveglas eller UIP400MPT til mikrotiterplader / plader med 96 brønde), afhængigt af hvor mange prøver du skal forberede.
  Til sonikering af en enkelt prøve med sonde placeres cellerne i 1,5 mL mikrocentrifugerør.
• Indstil på forhånd varigheden af ultralydsbehandlingen, den samlede energitilførsel, cyklustilstanden og/eller temperaturgrænserne i ultralydsenhedens digitale menu. Dette sikrer yderst pålidelig sonikering og repeterbarhed.
• Indfør sonotroden, og tænd ultralydsenheden. Bevæg forsigtigt ultralydssondens mikrospids gennem prøven for at sonikere prøven ensartet.
  For de fleste celler vil ultralydslysen være afsluttet efter 2–4 cyklusser med 10 sekunders sonikering.
• Fjern sonotroden fra prøven efter sonikering. Prøverne bør inkuberes på is i 5 min. Centrifuger derefter ved 10.000 x g i 20 min for at danne en pellet af cellefragmenterne. Overfør supernatanterne til et nyt mikrocentrifugerør. Mærk analytterne, og opbevar dem ved -20°C.
• Ultralydssonotroden kan rengøres ved at tørre den grundigt af med alkohol eller ved at sonikere den i et bægerglas fyldt med alkohol, f.eks. 70% ethanol. Alle ultralydssonder fremstillet af titanium kan autoklaveres.

• Skyl vævet med iskold PBS (0,01M, pH=7,4) for grundigt at fjerne overskydende hæmolyseret blod.
• Vej vævet (nyre, hjerte, lunge, milt osv.), og findel det i små stykker, som homogeniseres i PBS. Det nødvendige volumen PBS afhænger af vævets vægt. Som tommelfingerregel kræver 1g væv ca. 9mL PBS. Det anbefales at tilsætte en proteasehæmmer til PBS. (Alternativt kan der anvendes RIPA eller hypoton lysebuffer med en blanding af protease- og fosfatasehæmmere.)
• Afhængigt af vævets størrelse kan en kort vortexbehandling (ca. 1–2 min. i pulser på 15 sekunder) være nyttig til forbehandling af vævet.
• Monter en mikrospids, f.eks. S26d2, på din ultralydsenhed. Placer prøverøret med vævet i et isbad.
• Soniker prøven med din ultralydsenhed, f.eks. UP200St (80% amplitude), i 1 min. i pulstilstand (15 sekunder aktiv, 15 sekunders pause). Hold prøven i isbadet.
• Homogenaterne centrifugeres derefter for at opnå specifikke fraktioner (cytosoliske, nukleære, mitokondrielle eller lysosomale) med henblik på at opkoncentrere proteinet til analyse. Ved at centrifugere prøven i 5 minutter ved 5000×g udvindes supernatanten.

Pålidelig temperaturkontrol under sonikering

Temperaturen er en afgørende faktor, der påvirker processen, og som er særligt vigtig ved behandling af biologiske prøver, f.eks. for at forhindre termisk nedbrydning af proteiner. Som alle mekaniske teknikker til prøveforberedelse genererer sonikering varme. Prøvernes temperatur kan dog kontrolleres godt ved brug af enhederne fra Hielscher Ultrasonics. Vi præsenterer forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere dine prøvers temperatur, mens du forbereder dem præanalytisk med en ultralydsenhed med sonde eller VialTweeter.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Alle digitale ultralydsprocessorer fra Hielscher er udstyret med intelligent software og en temperaturføler, der kan tilsluttes. Tilslut temperaturføleren til ultralydsenheden (f.eks. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikeringsenheden UIP400MTP til plader med flere brønde), og indfør temperaturfølerens spids i et af prøverørene. Via den digitale berøringsskærm i farver kan du i ultralydsprocessorens menu indstille et specifikt temperaturinterval for sonikeringen af dine prøver. Ultralydsenheden stopper automatisk, når den maksimale temperatur nås, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er faldet til den nedre værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne intelligente funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. På ultralydsenheden VialTweeter til flere prøver kan titaniumblokken, som holder prøverørene, forkøles. Placer blokken til VialTweeter (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken og dermed forsinke temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også forkøles.
3. Brug et isbad eller tøris til afkøling under sonikering. Placer dine prøverør i et isbad under sonikeringen. Til VialTweeter bruges en lav bakke fyldt med tøris, og VialTweeter placeres på tørisen, så varmen hurtigt kan bortledes.

Kunder verden over anvender ultralydsenheder med sonde fra Hielscher samt sonikeringsenhederne VialTweeter og UIP400MTP til flere prøver til deres daglige prøveforberedelse i biologiske, biokemiske, medicinske og kliniske laboratorier. Med den intelligente software og temperaturkontrol i processorerne fra Hielscher styres temperaturen pålideligt, og varmeinduceret nedbrydning af prøverne undgås. Prøveforberedelse med ultralyd ved hjælp af ultralydsløsninger fra Hielscher giver yderst pålidelige og reproducerbare resultater!
Læs mere om sonikering med høj prøvekapacitet ved hjælp af sonikeringsenheden UIP400MTP til plader med flere brønde til analyser!