DNA-fragmentering med ultralyd til næste generations sekventering

Næste generations sekventering (NGS) kræver pålidelig forskydningsbetinget fragmentering og fragmentering af genomisk DNA for at sekventere genomiske DNA-strenge og oprette genombiblioteker. Kontrolleret fragmentering af DNA til DNA-fragmenter er et afgørende trin i prøveforberedelsen, som er nødvendigt, før DNA’et sekventeres. Sonikering har vist sig at være en effektiv og pålidelig teknik til fragmentering af DNA til en bestemt længde. Protokoller til DNA-fragmentering med ultralyd giver reproducerbare fragmenteringsresultater. Ultralydsapparater fra Hielscher kan frembringe en bred vifte af størrelsesfordelinger af genomiske DNA-fragmenter, som kan styres præcist via driftsparametrene. Da systemer fra Hielscher til forskydningsbetinget DNA-fragmentering med ultralyd fås til både enkelte og flere prøveglas samt til mikroplader, bliver prøveforberedelsen særdeles effektiv.

Næste generations sekventering: DNA-fragmentering med ultralyd til biblioteksforberedelse

For at gennemføre næste generations sekventering skal de tre grundlæggende trin (1) biblioteksforberedelse, (2) sekventering og (3) dataanalyse udføres. Under biblioteksforberedelsen fragmenteres DNA, hvorefter fragmentenderne repareres (poleres) ved tilsætning af en enkelt adeninbase, og målfragmenterne omdannes til dobbeltstrenget DNA. Til sidst tilkobles såkaldte adaptere ved ligering, PCR eller tagmentering, så det endelige DNA-produkt i biblioteket kan kvantificeres til sekventering.
DNA-fragmentering ved hjælp af sonikering: Især ved anvendelse af sekventeringsteknologier med korte læsninger såsom Illumina, der ikke uden videre kan læse længere DNA-fragmenter, skal DNA-strengene fragmenteres til en bestemt størrelse, hvilket kan opnås pålideligt ved sonikering.
Sonikering kan anvendes pålideligt til fragmentering af DNA, RNA og kromatin.

Næste generations sekventering – biblioteksforberedelse

DNA-fragmentering med ultralyd anvendes almindeligvis til forberedelse af DNA-sekventeringsbiblioteker til platforme til næste generations sekventering (NGS). Denne teknik bruges til at bryde DNA-molekyler op i mindre fragmenter inden for et ønsket størrelsesinterval, hvilket letter de efterfølgende trin i biblioteksforberedelsen. DNA-fragmentering med ultralyd er typisk nødvendig under biblioteksforberedelsen i NGS-arbejdsgange for at fragmentere genomisk DNA i mindre stykker, der er egnede til efterfølgende behandling og sekventering. Teknikken spiller en afgørende rolle for at sikre sekventeringsforsøgets succes ved at frembringe DNA-fragmenter inden for det passende størrelsesinterval til den specifikke sekventeringsplatform, der anvendes.

Næste generations sekventering – procestrin:

• DNA-fragmentering med ultralyd: Før biblioteket opbygges, fragmenteres det genomiske DNA i mindre, mere håndterbare stykker. Fragmentering med ultralyd indebærer anvendelse af højfrekvente lydbølger til at fragmentere DNA-molekylerne ved forskydning til fragmenter inden for det ønskede størrelsesinterval. Dette trin er afgørende, fordi det hjælper med at sikre, at de sekventeringslæsninger, der senere genereres, har en passende længde til den anvendte sekventeringsplatform. Fragmenternes størrelsesinterval kan tilpasses sekventeringsforsøgets specifikke krav.
• Klonal amplifikation ved PCR: Efter fragmentering med ultralyd gennemgår DNA-fragmenterne endereparation, adapterligering og PCR-amplifikation for at frembringe de endelige DNA-sekventeringsbiblioteker. Disse trin forbereder de fragmenterede DNA-molekyler til sekventeringsprocessen ved at tilføje adaptersekvenser, som er nødvendige for binding til sekventeringsplatformen, og tilvejebringe bindingssteder for primere til PCR-amplifikation.
• DNA-sekventering ved syntese: Når sekventeringsbibliotekerne er forberedt, begynder processen med DNA-sekventering ved syntese (SBS). Under SBS bestemmes DNA-sekvensen ved sekventiel tilsætning af nukleotider til den komplementære streng. Dette trin omfatter cykliske reaktioner med nukleotidinkorporering, billedoptagelse og spaltning, hvilket gør det muligt at bestemme DNA-sekvensen ud fra de fluorescerende signaler, som de inkorporerede nukleotider udsender.
• Massivt parallel sekventering: I det sidste trin sekventeres de rumligt adskilte, amplificerede DNA-skabeloner samtidigt på massivt parallel vis. Denne sekventeringsmetode med høj kapacitet gør det muligt at generere millioner til milliarder af sekventeringslæsninger i en enkelt sekventeringskørsel, hvilket muliggør effektiv og hurtig bestemmelse af DNA-sekvenser.

Hvordan fungerer DNA-fragmentering med ultralyd?

Sonikering, også kendt som akustisk prøvebehandling, er en udbredt metode til at fragmentere DNA. Ved forskydningsbetinget DNA-fragmentering med ultralyd udsættes prøverne for ultralydsbølger under kontrollerede forhold. Funktionsprincippet for DNA-fragmentering med ultralyd bygger på de vibrationer og den kavitation, som ultralydsbølgerne frembringer. De forskydningskræfter, der opstår som følge af ultralydsbetinget (akustisk) kavitation, bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt. Sonikeringsindstillinger såsom intensitet (amplitude, varighed), pulseringstilstand og temperatur muliggør præcis DNA-fragmentering til en bestemt ønsket længde af DNA-fragmenterne. Mens DNA ofte reduceres til 100 til 600 bp ved sonikering, kan længere DNA-fragmenter på op til 1300 bp opnås, når der anvendes mildere ultralydsbetingelser.

Temperaturstyring til forebyggelse af DNA-nedbrydning

DNA’ets dobbeltstrengede molekylære struktur er meget følsom over for forhøjede temperaturer, så præcis temperaturstyring under prøveforberedelsen er en afgørende faktor for pålidelige analyseresultater.
Uanset om du bruger ultralydsapparater med probe fra Hielscher, VialTweeter eller UIP400MTP – sikres kontinuerlig temperaturovervågning og -styring af en tilslutningsbar temperaturføler og apparatets intelligente software. For at holde temperaturen inden for et bestemt interval kan du indstille en øvre og en nedre temperaturgrænse. Ultralydsapparatet holder derfor pause, så snart denne temperaturgrænse overskrides, og fortsætter automatisk sonikeringen, når temperaturen er faldet med en indstillet ∆T.
Den avancerede software i ultralydsapparater fra Hielscher sikrer, at de ideelle prøvebehandlingsbetingelser opretholdes pålideligt.

DNA-fragmentering af store prøveantal med ultralydsapparatet UIP400MTP til multibrøndsplader

Prøveantallet inden for biovidenskab er steget betydeligt i løbet af det seneste årti. Det betyder, at meget store antal prøver (f.eks. 384, 1536 eller 3456 brønde pr. mikroplade) skal behandles under prøveforberedelse og analyse under konsekvent ens betingelser for at opnå sammenlignelige og valide resultater. Med UIP400MTP følger Hielscher Ultrasonics tendensen til behandling af store prøveantal. UIP400MTP er et ultralydsapparat til prøveforberedelse med mikroplader. UIP400MTP kan behandle plader med 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 eller 3456 brønde. Afhængigt af mikropladetypen kan hver brønd typisk rumme prøvevolumener fra nogle snese nanoliter til flere milliliter. UIP400MTP anvendes bredt inden for biovidenskabelig forskning og bruges meget ofte til prøveforberedelse før assays såsom ELISA (enzymkoblet immunadsorptionsanalyse) eller PCR, før proteinanalyse samt til kromatinforberedelse før CHiP og CHiP-seq, identifikation af histonmodifikationer og andre analytiske behandlinger (f.eks. gelelektroforese og massespektrometri).
Læs mere om behandling af PCR-plader med høj prøvekapacitet!

VialTweeter til prøveforberedelse af op til 10 prøveglas

VialTweeter er et udbredt laboratorieultralydsapparat VialTweeter, der muliggør effektiv og bekvem sonikering af op til 10 prøveglas samtidigt. Da prøveglassene og reagensglassene (f.eks. Eppendorf-prøveglas, kryoprøveglas og centrifugerør) sonikeres indirekte, undgås enhver krydskontaminering. Da hver prøve tilføres den samme ultralydsintensitet, er alle sonikeringsresultater homogene og reproducerbare. VialTweeter har alle de intelligente funktioner, som vores øvrige digitale apparater har (f.eks. intelligent menu, programmerbare indstillinger, temperaturstyring, fjernbetjening osv.), så den højeste brugerkomfort sikres.

Prober med flere fingre til mikrobrøndsplader

Prober med flere fingre fås til ultralydshomogenisatorerne med probe UP200Ht og UP200St. Proberne med 4 eller 8 fingre er en bekvem mulighed for at sonikere flere prøver samtidigt under samme betingelser. Sonotroden MTP-24-8-96 er eksempelvis en probe med otte fingre, som er ideel til integration i automatiserede systemer eller til effektiv manuel prøveforberedelse i multibrøndspladers brønde. Sonotroden med flere fingre er ideel til automatisering i laboratorier, hvor der hovedsageligt behandles bægerglas og reagensglas med en standardultralydssonotrode. Proberne med flere fingre og standardproberne kan hurtigt udskiftes med hinanden inden for få minutter, så ultralydsapparatet med én probe omdannes til et ultralydsapparat til sønderdeling med flere prober.

Ultralydsapparater fra Hielscher til DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til fragmentering af DNA, RNA og kromatin. Disse forskellige platforme omfatter ultralydsprober (sonotroder), løsninger til indirekte sonikering til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multibrøndsplader (f.eks. 96-brøndsplader og mikrotiterplader), sonoreaktorer og ultralyds-cuphorns. Alle platforme til forskydningsbetinget DNA-fragmentering drives af frekvensafstemte ultralydsprocessorer med høj ydeevne, som kan styres præcist og giver reproducerbare resultater.

Ultralydsprocessorer til alle prøveantal og -størrelser

Med Hielschers ultralydsapparater til flere prøver, VialTweeter (til op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader/ multibrøndsplader), er det nemt at reducere prøvebehandlingstiden ved hjælp af intens sonikering, der kan styres præcist, samtidig med at den ønskede størrelsesfordeling og det ønskede udbytte af DNA-fragmenter opnås. DNA-fragmentering med ultralyd gør prøveforberedelsen effektiv, pålidelig og skalerbar. Protokoller kan skaleres lineært fra én til talrige prøver ved anvendelse af konstant kontrolleret ultralyd.
Ultralydsapparater med prober med én til fem fingre er ideelle til forberedelse af mindre prøveantal. Hielschers laboratorieultralydsapparater fås i forskellige størrelser, så vi kan anbefale det ideelle apparat til din anvendelse og dine krav.

Præcis processtyring

Sonikeringsindstillinger, der kan styres præcist, er afgørende, da omfattende sonikering kan ødelægge DNA, RNA og kromatin, mens utilstrækkelig forskydningsbetinget fragmentering med ultralyd resulterer i for lange DNA- og kromatinfragmenter. Hielschers digitale ultralydsapparater kan nemt indstilles til præcise sonikeringsparametre. Specifikke sonikeringsindstillinger kan også gemmes som programmerede indstillinger til hurtig gentagelse af samme procedure.
Alle sonikeringer logges automatisk og gemmes som en CSV-fil på et indbygget SD-kort. Dette muliggør nøjagtig dokumentation af udførte forsøg og gør det nemt at gennemgå sonikeringskørsler.
Alle digitale ultralydsapparater kan betjenes og overvåges via fjernbetjening i enhver standardbrowser. Installation af yderligere software er ikke nødvendig, da en LAN-forbindelse muliggør en meget enkel plug-and-play-opsætning.


Den højeste brugervenlighed ved prøveforberedelse med ultralyd

Alle ultralydsapparater fra Hielscher er konstrueret til at levere ultralyd med høj ydeevne, samtidig med at de altid er meget brugervenlige og nemme at betjene. Alle indstillinger er velstrukturerede i en overskuelig menu, som er let tilgængelig via en farveberøringsskærm eller fjernbetjening i en browser. Den intelligente software med programmerbare indstillinger og automatisk dataregistrering sikrer optimale sonikeringsindstillinger til pålidelige og reproducerbare resultater. Den overskuelige og brugervenlige menugrænseflade gør ultralydsapparater fra Hielscher til brugervenlige og effektive apparater.
Tabellen nedenfor giver en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores laboratorieultralydsapparater, som er ideelle til prøveforberedelsesopgaver såsom DNA- og RNA-fragmentering, cellelyse samt proteinekstraktion: