Ultralyd DNA-fragmentering til næste generations sekventering
Next Generation Sequencing (NGS) kræver pålidelig klipning og fragmentering af genomisk DNA for at sekventere genomiske DNA-strenge og skabe genombiblioteker. Den kontrollerede fragmentering af DNA til DNA-fragmenter er et vigtigt prøveforberedelsestrin, der kræves, før DNA'et sekventeres. Ultralydbehandling er bevist som effektiv og pålidelig teknik til DNA-fragmentering af en vis længde. Ultralyd DNA-fragmenteringsprotokoller opnår reproducerbare fragmenteringsresultater. Hielscher ultralydapparater er i stand til at producere en bred vifte af genomiske DNA-fragmentstørrelsesfordelinger, der kan kontrolleres præcist via driftsparametrene. Da Hielscher ultralyd DNA-klippesystemer er tilgængelige til enkelt- og flere hætteglas samt til mikroplader, bliver prøveforberedelse yderst effektiv.
Den UIP400MTP plade Sonicator Til prøveforberedelse med høj kapacitet sonikeres prøver ensartet i multi-brønde, mikrotiterplader og 96-brønds plader
- repeterbare/reproducerbare resultater
- Præcist justerbar for at opnå en vis fragmentlængde
- Hurtig behandling
- konsistente DNA-fragmenteringsresultater
- udstyr til prøvemængder (f.eks. flere hætteglas eller mikroplader)
- Høj gennemstrømning
- Præcis temperaturkontrol
- Enkel, brugervenlig betjening
Næste generations sekventering: Ultralyds-DNA-fragmentering til biblioteksforberedelse
For at udføre en næste generations sekventering skal de tre grundlæggende trin (1) biblioteksforberedelse, (2) sekventering og (3) dataanalyse udføres. Under biblioteksforberedelsen fragmenteres DNA, derefter repareres (poleres) fragmentenderne ved at tilføje en enkelt adeninbase, og målfragmenterne omdannes til dobbeltstrenget DNA. Endelig fastgøres såkaldte adaptere ved ligering, PCR eller tagmentation, så det endelige biblioteks-DNA-produkt kan kvantificeres til sekventering.
DNA-fragmentering ved hjælp af sonikering: Især når kortlæsede sekventeringsteknologier som Illumina, der ikke let kan læse længere DNA-fragmenter, skal DNA-stativerne fragmenteres til en vis størrelse, som kan opnås pålideligt ved ultralydbehandling.
Ultralydbehandling kan pålideligt bruges til DNA-, RNA- og kromatinfragmentering.
Næste generations sekventering – Forberedelse af biblioteket
Ultralyds-DNA-fragmentering anvendes almindeligvis til fremstilling af DNA-sekventeringsbiblioteker til næste generations sekventeringsplatforme (NGS). Denne teknik bruges til at bryde DNA-molekyler i mindre fragmenter af et ønsket størrelsesområde, hvilket letter de efterfølgende trin i biblioteksforberedelsen. Ultralyds-DNA-fragmentering er typisk påkrævet under biblioteksforberedelsestrinnet i NGS-arbejdsgange for at fragmentere genomisk DNA i mindre stykker, der er egnede til downstream-behandling og sekventering. Det spiller en afgørende rolle for at sikre sekventeringseksperimentets succes ved at generere DNA-fragmenter af det passende størrelsesinterval til den specifikke sekventeringsplatform, der bruges.
Elektroforetiske analyser af genomisk DNA af E. coli EDL933 udsat for 0 - 15 min ultralydbehandling. L angiver DNA-stigen. (Basselet et al. 2008)
Næste generations sekventering – Proces trin:
- Ultralyd DNA-fragmentering: Før bibliotekskonstruktion fragmenteres det genomiske DNA i mindre, mere håndterbare stykker. Ultralydsfragmentering involverer brug af højfrekvente lydbølger til at skære DNA-molekylerne i fragmenter af det ønskede størrelsesområde. Dette trin er afgørende, fordi det hjælper med at sikre, at de sekventeringslæsninger, der genereres senere, vil være af passende længde til den sekventeringsplatform, der bruges. Fragmenternes størrelsesområde kan justeres baseret på de specifikke krav til sekventeringseksperimentet.
- Klonal amplifikation ved PCR: Efter ultralydsfragmentering gennemgår DNA-fragmenterne slutreparation, adapterligering og PCR-amplifikation for at generere de endelige DNA-sekventeringsbiblioteker. Disse trin forbereder de fragmenterede DNA-molekyler til sekventeringsprocessen ved at tilføje adaptersekvenser, der er nødvendige for binding til sekventeringsplatformen og tilvejebringe primingsteder til PCR-amplifikation.
- DNA-sekventering ved syntese: Når sekventeringsbibliotekerne er forberedt, begynder DNA-sekventering ved syntese (SBS) processen. Under SBS bestemmes DNA-sekvensen ved den sekventielle tilsætning af nukleotider til den komplementære streng. Dette trin involverer cykliske reaktioner af nukleotidinkorporering, billeddannelse og spaltning, hvilket gør det muligt at bestemme DNA-sekvensen baseret på de fluorescerende signaler, der udsendes af de inkorporerede nukleotider.
- Massivt parallel sekventering: I det sidste trin sekventeres de rumligt adskilte, forstærkede DNA-skabeloner samtidigt på en massivt parallel måde. Denne high-throughput sekventeringstilgang muliggør generering af millioner til milliarder af sekventeringslæsninger i en enkelt sekventeringskørsel, hvilket giver mulighed for effektiv og hurtig bestemmelse af DNA-sekvenser.
Hvordan fungerer ultralyd DNA-fragmentering?
Sonikering, også kendt som akustisk prøvebehandling, er en meget brugt metode til at fragmentere DNA. Til ultralyds-DNA-klipning udsættes prøverne for ultralydsbølger under kontrolleret tilstand. Arbejdsprincippet for ultralyds-DNA-fragmentering er baseret på vibrationer og kavitation, der genereres af ultralydsbølgerne. Forskydningskræfterne, der er resultatet af ultralyd (akustisk) kavitation, bryder DNA-molekyler med høj molekylvægt. Indstillingen af sonikering såsom intensitet (amplitude, varighed), pulseringstilstand og temperatur giver mulighed for præcis DNA-fragmentering til en bestemt ønsket længde af DNA-fragmenter. Mens DNA ofte reduceres til 100 til 600 bp ved hjælp af ultralydbehandling, kan der opnås længere DNA-fragmenter på op til 1300 bp, når mildere ultralydsforhold anvendes.
Ultralyd DNA-klipning under ChIP – kromatin immunpræcipitation
Tilpasset fra Jkwchui under CC-BY-SA.03
Temperaturkontrol for at forhindre DNA-nedbrydning
Den dobbeltstrengede molekylære form af DNA er meget følsom over for forhøjede temperaturer, så nøjagtig kontrol over temperaturen under prøveforberedelsestrin er en afgørende faktor for pålidelige analyseresultater.
Uanset om du bruger Hielschers sonde ultralydapparater, VialTweeter eller UIP400MTP – Kontinuerlig temperaturovervågning og -styring sikres på grund af en tilsluttbar temperatursensor og smartenhedssoftwaren. For at holde temperaturen inden for et bestemt interval kan du indstille en øvre og nedre temperaturgrænse. Derfor vil ultralydsapparatet holde pause, så snart denne temperaturgrænse overskrides, og vil automatisk fortsætte med at sonikere, når temperaturen er sænket med et indstillet ∆T.
Den sofistikerede software fra Hielscher ultralydapparater sikrer pålidelig vedligeholdelse af ideelle prøvebehandlingsforhold.
Masseprøve DNA-fragmentering med UIP400MTP Multi-Well Plate ultralydsapparat
Antallet af stikprøver inden for life science er steget markant inden for det sidste årti. Det betyder, at et meget stort antal prøver (f.eks. 384, 1536 eller 3456 brønde pr. mikroplade) skal behandles under prøveforberedelse og analyse under konsekvent lige vilkår for at opnå sammenlignelige og gyldige resultater. Med UIP400MTP følger Hielscher Ultrasonics tendensen med masseprøvebehandling. UIP400MTP er en ultralydsapparat til prøveforberedelse ved hjælp af mikroplader. UIP400MTP kan behandle plader med 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 eller 3456 brønde. Afhængigt af mikropladetypen kan hver brønd typisk indeholde prøvevolumener mellem titusinder af nanoliter til flere milliliter. UIP400MTP er meget almindeligt anvendt i biovidenskabelig forskning og bruges meget almindeligt til prøveforberedelse før analyser såsom ELISA (enzymbundet immunosorbentanalyse) eller PCR, før proteinanalyse samt til kromatinforberedelse før CHiP og CHiP-seq, histonmodifikationsidentifikation og andre analytiske behandlinger (f.eks. gelelektroforese, massespektrometri).
VialTweeter til prøvepraparering af op til 10 hætteglas
VialTweeter er en meget anvendt laboratorie ultralydsapparat VialTweeter, der giver mulighed for effektiv og behagelig sonikering af op til 10 hætteglas samtidigt. Da hætteglassene og reagensglassene (f.eks. Eppendorf hætteglas, kryohætteglas, centrifugerør) sonikeres indirekte, undgås enhver krydskontaminering. Da den samme ultralydsintensitet leveres til hver prøve, er alle sonikeringsresultater homogene og reproducerbare. VialTweeter tilbyder alle smarte funktioner ligesom vores andre digitale enheder (f.eks. smart menu, programmerbare indstillinger, temperaturkontrol, fjernbetjening osv.), så den højeste brugerkomfort sikres.
Flerfingersonder til mikrorørsplader
Fås til ultralydssondehomogenisatorerne UP200Ht og UP200St, multi-finger prober med 4 eller 8 fingre er en behagelig mulighed for at sonikere flere prøver på samme tid under samme forhold. For eksempel er sonotrode MTP-24-8-96 en sonde med otte fingre, som er ideel til integration i automatiserede systemer eller effektiv manuel prøveforberedelse af brønde på plader med flere brønde. Multi-finger sonotroden er ideel til automatiseret til laboratorier, hvor for det meste bægre og reagensglas ved hjælp af en standard ultralydssonotrode behandles. Multi-finger og standard prober kan hurtigt udskiftes inden for få minutter og omdanne enkelt-sonde ultralydsapparat til en multi-probe ultralydsforstyrrer.
Hielscher ultralydapparater til DNA-fragmentering
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsbaserede platforme til DNA-, RNA- og kromatinfragmentering. Disse forskellige platforme inkluderer ultralydssonder (sonotroder), indirekte sonikeringsopløsninger til samtidig prøveforberedelse af flere rør eller multi-brøndplader (f.eks. 96-brønds plader, mikrotiterplader), sonoreaktorer og ultralyd cuphorns. Alle platforme til DNA-klipning drives af frekvenstunede, højtydende ultralydsprocessorer, som er præcist kontrollerbare og leverer reproducerbare resultater.
Ultralydsprocessorer til ethvert prøveantal og størrelse
Med Hielschers multi-sample ultralydapparater VialTweeter (til op til 10 reagensglas) og UIP400MTP (til mikroplader / multiwell-plader) bliver det let muligt at reducere prøvebehandlingstiden på grund af intens og præcist kontrollerbar ultralydbehandling, samtidig med at der opnås den ønskede DNA-fragmentstørrelse, fordeling og udbytte. Ultralyd DNA-fragmentering gør prøveforberedelsen effektiv, pålidelig og skalerbar. Protokoller kan skaleres lineært fra en til adskillige prøver ved at anvende konstant kontrolleret ultralyd.
Sonde ultralydapparater med en til fem fingre er ideelle til fremstilling af mindre prøvenumre. Hielschers laboratorie ultralydapparater fås i forskellige størrelser, så vi kan anbefale dig den ideelle enhed til din applikation og krav.
Præcis processtyring
Præcist kontrollerbare sonikeringsindstillinger er afgørende, da udtømmende sonificering kan ødelægge DNA, RNA og kromatin, men utilstrækkelig ultralydsklipning resulterer i for lange DNA- og kromatinfragmenter. Hielschers digitale ultralydapparater kan let indstilles til præcis sonikeringsparameter. Specifikke sonikeringsindstillinger kan også gemmes som programmeret indstilling til hurtig gentagelse af den samme procedure.
Al sonikering protokolleres automatisk og gemmes som CSV-fil på et indbygget SD-kort. Dette giver mulighed for nøjagtig dokumentation af udførte forsøg og gør det muligt at revidere sonikeringskørsler let.
Via browserfjernbetjening kan alle digitale ultralydapparater betjenes og overvåges via enhver standardbrowser. Installation af yderligere software er ikke påkrævet, da en LAN-forbindelse tillader en meget enkel plug-n-play-opsætning.
Højeste brugervenlighed i ultralydsprøveforberedelse
Alle Hielscher ultralydapparater er designet til at levere højtydende ultralyd, samtidig med at de altid er meget brugervenlige og nemme at betjene. Alle indstillinger er velstrukturerede i en overskuelig menu, som nemt kan tilgås via farvet touch-display eller browserfjernbetjening. Den smarte software med programmerbare indstillinger og automatisk dataoptagelse sikrer optimale sonikeringsindstillinger for pålidelige og reproducerbare resultater. Den rene og brugervenlige menugrænseflade gør Hielscher ultralydapparater til brugervenlige og effektive enheder.
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores laboratorie ultralydapparater, som er ideelle til prøveforberedelsesopgaver såsom DNA- og RNA-fragmentering, cellelyse samt proteinekstraktion:
| Apparat | Effekt [W] | Slags | Volumen [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | til mikroplader | 6 – 3456 brønde | VialTweeter | 200 | til op til 10 hætteglas plus mulighed for clamp-on | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | sonde-type | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | sonde-type | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | sonde-type | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | sonde-type | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | sonde-type | 5.0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | Forureningsfri flowcelle |
Kontakt os! / Spørg os!
Ultralydsenheden til forberedelse af flere prøver VialTweeter giver mulighed for samtidig sonikering af op til 10 hætteglas. Med clamp-on-enheden VialPress, kan op til 4 ekstra rør presses foran for intens sonikering.
Sonotroden MTP-24-8-96 har otte ultralydssonder til sonikering af brønde af mikrotiterplader.
Litteratur / Referencer
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakta, der er værd at vide
Hvad er Next Generation Sequencing?
Næste generations sekventering, også Next Gen Sequencing (NGS), high-throughput sekventering eller andengenerations sekventering, refererer til tilgangen til massiv parallel sekventering, hvor meget store (massive) mængder DNA af millioner af fragmenter sekventeres samtidigt parallelt pr. kørsel.
For at udføre en næste generations sekventering skal de tre grundlæggende trin i
- forberedelse af biblioteket,
- sekventering, og
- Analyse af data
er påkrævet.
Under biblioteksforberedelsen skal DNA-strenge fragmenteres til DNA-fragmenter af en vis længde. Sonikering er en af de foretrukne teknikker til at fragmentere DNA.
Under processen med DNA-sekventering er rækkefølgen af nukleotider i DNA – kendt som nukleinsyresekvens – bestemmes. Nukleinsyresekvensen er sammensat af fire nukleotidbaser - adenin, cytosin, guanin, thymin – hvilken kode til information.
Næste generations sekventering driver forskning inden for biovidenskab og personlig medicin, da DNA- og RNA-sekventering er stærkt udbredt i genomisk forskning, kræftforskning, forskning i sjældne og komplekse sygdomme, mikrobiel forskning, agrigenomics og mange andre forskningsområder.
Næste generations sekventering vs Sanger-sekventering
Mens det med Next Generation Sequencing (NGS) er muligt at sekventere et stort antal genomiske prøver, har Sanger-sekventering (også kendt som kædetermineringsmetode eller First Generation Sequencing) kun evnen til at sekventere små prøvenumre. Sanger-sekventering sekvenserer kun et enkelt DNA-fragment ad gangen og kan udføres på en enkelt dag. På grund af sin nøjagtighed betragtes Sanger-sekventeringen også som guldstandardteknologien, som bruges til at verificere resultater opnået ved næste generations sekventering.
Sanger-sekventering opnår læselængder på ca. 800 bp (typisk 500-600 bp med ikke-beriget DNA). De længere læselængder i Sanger-sekventering viser betydelige fordele i forhold til andre sekventeringsmetoder, især med hensyn til sekventering af gentagne områder af genomet. En udfordring med kortlæste sekvensdata er især et problem ved sekventering af nye genomer (de novo) og ved sekventering af stærkt omarrangerede genomsegmenter, typisk dem, der ses af kræftgenomer eller i kromosomområder, der udviser strukturel variation. [jf. Morozova og Marra, 2008]
DNA – Deoxyribonukleinsyre – Dens former og funktioner
Hver form for DNA har unikke egenskaber og anvendelser, der bidrager til et bredt spektrum af forskningsområder, herunder onkologi, genetik, retsmedicin og evolutionsbiologi. Hielscher sonikere er en yderst effektiv og pålidelig løsning til at isolere og fragmentere DNA og RNA til dine analyseformål. På listen nedenfor forklarer vi dig de specifikke former for DNA og kategoriserer dem baseret på deres biologiske kontekst og funktioner:
- Genomisk DNA (gDNA)
Genomisk DNA (gDNA): Det komplette sæt af DNA i en organisme, herunder både kodende (gener) og ikke-kodende regioner. - Ekstracellulært DNA
Cirkulerende tumor-DNA (ctDNA): Fragmenter af DNA frigivet i blodbanen af tumorceller.
Cellefrit DNA (cfDNA): DNA-fragmenter, der findes frit cirkulerende i blodbanen, stammer fra forskellige væv. - Ekstrakromosomal cirkulær DNA (eccDNA): Cirkulære DNA-molekyler fundet uden for kromosomerne i eukaryote celler.
Viralt DNA: DNA, der stammer fra vira, enten integreret i værtsgenomet eller som episomalt DNA. - mitokondrie-DNA
Mitokondrie-DNA (mtDNA): DNA placeret i mitokondrierne, nedarvet maternalt og involveret i energiproduktion. - plasmid DNA
Plasmid DNA: Små, cirkulære DNA-molekyler, der replikerer uafhængigt af det kromosomale DNA, der almindeligvis findes i bakterier og bruges i genteknologi. - nukleart DNA
Nukleart DNA (nDNA): DNA indeholdt i kernen af eukaryote celler, der udgør størstedelen af genetisk materiale i en organisme. - Enkeltcellet DNA
Enkeltcellet DNA (scDNA): DNA ekstraheret fra en enkelt celle, der bruges til detaljeret genomisk analyse på det enkelte celleniveau. - Rekombinant DNA
Rekombinant DNA (rDNA): DNA-molekyler dannet ved laboratoriemetoder til genetisk rekombination for at samle genetisk materiale fra flere kilder. - Specialiserede formularer
Miljø-DNA (eDNA): DNA indsamlet fra miljøprøver (jord, vand) uden at isolere kildeorganismerne
Gammelt DNA (aDNA): DNA ekstraheret fra gamle prøver, hvilket giver indsigt i evolutionær biologi og gamle befolkninger. - Kromosomalt DNA
Kromosomalt DNA: DNA, der udgør kromosomerne i cellekernen, der omfatter både kodende og ikke-kodende regioner. - Virale og syntetiske former
Viralt DNA: DNA afledt af vira, som enten kan integreres i værtsgenomer eller eksistere som uafhængige enheder.
Syntetisk DNA: Kunstigt syntetiserede DNA-sekvenser skabt gennem kemiske processer, ofte brugt i forskning og bioteknologi.
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.