Ultralydsproteinekstraktion fra vævs- og cellekulturer
- Proteinekstraktion er et vigtigt prøveforberedelsestrin i proteomics.
- Proteiner kan udvindes fra plante- og dyrevæv, gær og mikroorganismer.
- Sonikering er en pålidelig, effektiv proteinekstraktionsmetode, der giver høje proteinudbytter inden for en kort ekstraktionstid.
Proteinekstraktion fra væv og celler
Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er et vigtigt prøveforberedelsestrin, der udføres under mange biokemiske og analytiske teknikker såsom ELISA, PAGE, Western blotting, massespektrometri eller proteinoprensning. Ultralydscelleafbrydelse, lysis og ekstraktion er en præcist kontrollerbar, ikke-termisk teknik for at sikre høje udbytter af proteiner.
Proteinekstraktion fra celler med ultralydssonde UP200St
- Hurtig
- høje udbytter
- Højeffektive
- Præcis kontrol over parametre
- reproducerbare resultater
- lineær skalerbarhed
Generelle instruktioner til ultralydslyse og proteinekstraktion
- Temperaturkontrol: For at sikre et højt proteinudbytte uden termisk denaturering skal temperaturen under ekstraktionen kontrolleres. Hielschers avancerede ultralydshomogenisatorer – Også kaldet ultralydsdisintegrator eller ultralydsbehandler – kan styres præcist. De leveres med en tilsluttbar temperatursensor. I indstillingsmulighederne for ultralydshomogenisatoren kan der indstilles en maksimal temperatur. Når denne temperatur maks. er nået, stopper ultralydsapparatet automatisk, indtil prøven er kølet af.
- Buffer: Valget af en passende buffer og den rigtige buffervolumen varierer fra væv til væv og skal findes ud af ved trial-and-error-test.
- Isolering / oprensning: Proteinlysater kan indeholde et overskud af biomolekyler såsom DNA eller kulhydrater, som kan fjernes ved proteinudfældning (deoxycholat-trichloreddikesyre) eller bufferudveksling.
Chittapalo og Noomhorm (2009) rapporterede i deres undersøgelse, at proteinudbyttet steg ved hjælp af sonikering, og at ultralydsvævshomogeniserings- og lyseprocessen kan forbedre eksisterende ekstraktionsprocesser betydeligt – der giver mulighed for nye kommercielle udvindingsmuligheder.
Ultralyd CupHorn til samtidig, meget effektiv prøveforberedelse af flere prøver under samme betingelser for proteinisolering og DNA-fragmentering.
Proteinekstraktion fra animalsk væv
Til fremstilling af væv i hele størrelse (f.eks. nyre, hjerte, lunge, muskel osv.) skal vævet dissekeres i meget små stykker med rent værktøj, helst på is og så hurtigt som muligt for at forhindre nedbrydning med proteaser (f.eks. lysisbuffer som f.eks. RIPA eller hypotonisk lysebuffer indeholdende protease- og fosfatasehæmmercocktail). Efter dissekering nedsænkes prøven i flydende nitrogen til snapfrysning. Prøven kan opbevares ved -80°C til senere brug eller opbevares på is til øjeblikkelig homogenisering. Umiddelbart før ultralydsekstraktion tilsættes iskold lysebuffer (med proteasehæmmere DTT, leupeptin og aprotinin) hurtigt i prøverøret (pr. ~ 10 mg væv ca. ~ 600 μL buffer anbefales). Ca. 20-60mg væv anbefales pr. prøveglas.
Ultralydshomogenisering, lysis og ekstraktion udføres med en ultralydshomogenisator såsom UP100H eller UP200Ht, udstyret med en mikro-tip sonotrode. Sonikeringens varighed er 60-90 sek. ved en ultralydscyklustilstand på 15 sek. sonikering og 10 sek. hviletid. Prøven skal opbevares i is hele tiden.
Efter ultralydshomogenisering / ekstraktion centrifugeres lysatet ved 27.000 g i ca. 20 min. Herefter opsamles supernatet, så proteinkoncentrationen kan bestemmes ved et proteinassay som Pierce protein assay BCA.
Proteinekstraktion fra blodserum
For en homogen blanding af serumet og fosfatbufferen hvirvles prøven først før ultralydscellelyse. Til ultralydslysen sonikeres prøven med en ultralydslaboratoriehomogenisator såsom UP100H i 8 cyklusser ved 20% amplitude, for cyklusser på hver 5 sekunder tændt og 15 sekunder slukket. Proteinekstraktion udføres ved sonikering i cyklusser (pulseringstilstand) og ved at placere prøven på is, så en overophedning og termisk nedbrydning af prøven undgås. Da serum indeholder en stor mængde proteiner med høj molekylvægt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G og immunoglobulin A), som forstyrrer adskillelsen af proteiner med lav molekylvægt under IEF, anbefales det at nedbryde dem fra serumet ved hjælp af en udtømningskolonne.
Proteinekstraktion fra plantevæv
Frisk, blødt plantevæv, f.eks. Mos osv., Kan let forstyrres ved blot at placere det hakkede prøvemateriale i lysisbuffer til sonikering. Hårdt, ligenøst plantevæv, såsom frø, grannåle osv., skal males tørt. Nogle hårde, træagtige plantematerialer skal fryses og formales i flydende nitrogen, før de ekstraheres ved sonikering. For plantecellekultursuspensioner er en ultralydsbehandling mellem 30 og 150 sekunder i en lysebuffer for det meste tilstrækkelig. Hårdere materiale såsom græskarkerner kræver en mere intens sonikering som beskrevet nedenfor.
Protokol til ultralydsekstraktion af albumin fra græskarkerner
Til ultralydsproteinekstraktion af albumin fra finmalet græskarfrøpulver tilsættes 10 g affedtet græskarfrøpulver og 100 ml deioniseret vand som opløsningsmiddel i et 250 ml glasbæger. Proteinekstraktionen består i to trin: Først sonikeres prøven med en sonde-type ultralydsapparat UP400St (400W, 24kHz) udstyret med sonotrode S24d7. Glasbægeret anbringes i et koldt vandbad under ultralydshomogeniseringen. Den tilsluttelige temperatursensor og temperaturkontrolindstillinger på ultralydsapparatet UP400St sikrer, at prøvetemperaturen altid holdes under 30 °C. Ved den præcise temperaturkontrol under sonikering undgås en denaturering af albumin. For det andet blev ekstraktionen udført med en mixer ved 200 rpm hastighed og ved 30°C. Derefter overføres bægerglasset til en termostatisk ryster. Globulin fjernes via dialyse med destilleret vand. Efter globulinfjernelsen kan proteinekstraktet udtages til bestemmelse af albuminprofilen og justeres efterfølgende til pI=3,0 ved hjælp af 0,1 M HCl til albuminkoagulation. Den faste fase adskilles ved centrifugering ved 5000 g, 20 °C og opløses i deioniseret vand. Albuminkoagulation udføres to gange for at øge proteinforholdet i albuminkoncentratet.
Ultralyd alkalisk proteinekstraktion til fremstilling af proteinkoncentrat fra risklid viser, at ultralydsbehandlingen resulterer i højere proteinudbytte i en betydeligt kortere ekstraktionstid – sammenlignet med konventionelle ekstraktionsmetoder.
Prøveforberedelsesprotokol for funktionelt iNOS-enzym
For at opnå fuldt funktionelt iNOS-enzym (f.eks. til lægemiddelscreening) anbefales følgende protokol: Cellesuspensionen skal placeres på is og sonikeres med en UP100H ved 10 μm amplitude ved cyklustilstand på 5 sek. sonikering og 25 sek. hvile på is. Proceduren skal gentages ca. 3 gange. Hviletiden mellem sonikeringscyklusser reducerer temperaturstigningen og vil derfor reducere risikoen for denaturering.
ultralydsproteinopløselighed
Sonikering kan fremskynde proteinopløselighedsprocessen, som normalt kræver flere timer. For ikke at overophede prøven og forhindre proteinnedbrydning og modifikationer i opløsninger, der indeholder urinstof, bør ultralydsudbruddene ikke vare længere end få sekunder.
Ultralydsapparat UP200Ht med 2 mm mikrotip S26d2 til sonikering af små prøver.
Ultralydsudstyr til proteinekstraktion
Hielscher Ultrasonics tilbyder en bred vifte af ultralydshomogenisatorer til opløsning af celler, væv, bakterier, mikroorganismer, gær og sporer.
Hielscher lab ultralydapparater er kraftfulde og nemme at betjene. De er bygget til 24/7-drift og er designet som robuste og effektive laboratorie- og bordenheder. For alle enheder kan energiudgangen og amplituden styres præcist. Det brede udvalg af tilbehør åbner yderligere opsætningsmuligheder. De digitale ultralydapparater såsom VialTweeter, UP200Ht, UP200St og UP400St har en integreret temperaturkontrol og et indbygget SD-kort til automatisk dataoptagelse.
Til indirekte, krydskontamineringsfri og samtidig sonikering af flere prøver tilbyder vi VialTweeter eller ultralyd CupHorn.
Tabellen nedenfor giver dig et overblik over vores ultralydapparater til prøveforberedelse, celleforstyrrelse og ekstraktion. Klik på enhedstypen for at få flere oplysninger om hver ultralydshomogenisator. Vores veluddannede og mangeårige erfarne tekniske personale vil med glæde hjælpe dig med at vælge den bedst egnede ultralydsapparat til din prøveforberedelse!
| Batch volumen | Flowhastighed | Anbefalede enheder |
|---|---|---|
| op til 10 hætteglas eller rør | n.a. | VialTweeter |
| multiwell / mikrotiter plader | n.a. | UIP400MTP |
| flere rør / kar | n.a. | Cuphorn |
| 1 til 500 ml | 10 til 200 ml/min | UP100H |
| 10 til 1000 ml | 20 til 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 til 2000 ml | 20 til 400 ml/min | UP400St |
Afhængigt af din applikation, materiale og prøvevolumen vil vi anbefale dig den bedst egnede opsætning til din prøveforberedelse. Kontakt os i dag!
Kontakt os! / Spørg os!
Hielscher digitale ultralydapparater har en browserfjernbetjening og automatisk dataprotokol på et integreret SD-kort.
VialTweeter til indirekte sonikering.
Fakta, der er værd at vide
Proteomics
Proteomics er det forskningsfelt, der undersøger proteiner og proteomet. Proteiner udfylder en lang række vitale funktioner i organismer. Proteomet er hele sættet af proteiner udtrykt af et genom, celle, væv eller organisme på et bestemt tidspunkt. Proteomet varierer med tiden og forskellige krav eller belastninger, som en celle eller organisme gennemgår. Mere specifikt er det sættet af udtrykte proteiner i en given type celle eller organisme på et givet tidspunkt under definerede betingelser. Udtrykket er en blanding af proteiner og genom. Proteomics er studiet af proteomet.
protein
Proteiner er store biomolekyler, såkaldte makromolekyler – som er sammensat af en eller flere lange kæder af aminosyrerester. Proteiner er til stede i alle organismer af både vegetabilsk og animalsk oprindelse, og de er afgørende for de fleste af de biologiske funktioner. Da proteiner indeholder mange biologiske oplysninger, ekstraheres de til analytiske formål, f.eks. til proteomisk forskning. Den vigtigste funktion, der udføres af proteiner, omfatter katalyse af metaboliske reaktioner, DNA-replikation, respons på stimuli og transport af molekyler fra et sted til et andet. Proteiner adskiller sig primært fra hinanden i deres sekvens af aminosyrer, som er dikteret af nukleotidsekvensen af deres gener, og som normalt resulterer i, at protein foldes ind i en specifik tredimensionel struktur, der bestemmer dens aktivitet. Proteiner er – Udover peptider – en af de vigtigste komponenter i mad. Derfor er proteomics et kraftfuldt værktøj inden for fødevarevidenskab til at optimere processer, fødevaresikkerhed og ernæringsvurdering.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction er en præanalytisk procedure til adskillelse og prækoncetratering af analytter. I kombination med ultralydbehandling kan udvinding af skypunkter intensiveres, hvilket gør processen mere effektiv, hurtigere og miljøvenlig. Ved ultralydbehandling er cloudpoint-ekstraktion en betydeligt mere effektiv metode til analytforberedelse. Læs mere om ultralydassisteret udtrækning af tågepunkter!Gel elektroforese
Gelelektroforese er den vigtigste metode til separation og analyse af makromolekyler såsom DNA, RNA og proteiner samt deres fragmenter, baseret på deres størrelse og ladning. Det bruges i klinisk kemi til at adskille proteiner efter ladning og/eller størrelse (IEF-agarose, i det væsentlige størrelsesuafhængig) og i biokemi, molekylærbiologi og proteomik til at adskille en blandet population af DNA- og RNA-fragmenter efter længde, til at estimere størrelsen af DNA- og RNA-fragmenter eller til at adskille proteiner efter ladning.
cellekulturer
Cellekultur er den kontrollerede vækstproces, hvorved celler dyrkes under kontrollerede forhold. Cellekulturbetingelserne varierer for hver celletype. Generelt består miljøet i en cellekultur af et passende kar (f.eks. petriskål) med substrat eller medium, der leverer de essentielle næringsstoffer (aminosyrer, kulhydrater, vitaminer, mineraler), vækstfaktorer, hormoner og gasser (CO2, O2), og regulerer det fysiokemiske miljø (pH-buffer, osmotisk tryk, temperatur). De fleste celler har brug for en overflade eller et kunstigt substrat, mens andre cellekulturer kan dyrkes frit flydende i dyrkningsmedium (suspensionskultur, cellesuspension).
Massekulturer af dyrecellelinjer anvendes i industriel produktion af virale vacciner og andre bioteknologisk afledte produkter. Humane stamceller dyrkes for at udvide antallet af celler og differentiere cellerne til forskellige somatiske celletyper til transplantationsformål.
Vævsprøver
Udtrykket væv beskriver et cellulært mellemprodukt, hvor cellematerialet befinder sig på et organisatorisk niveau mellem celler og et komplet organ. I væv samles lignende celler fra samme oprindelse, der tilsammen udfører en bestemt funktion. Ved den funktionelle gruppering af flere væv dannes de komplekse strukturer af organer.
Væv udtages til forskning i biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokemi, immunhistokemi samt til at dyrke og udvinde DNA. Det kan skelnes mellem dyr (underopdeling: pattedyrvæv) og plantevæv. Dyrevæv er grupperet i de fire grundlæggende typer bindevæv, muskelvæv, nervevæv og epitelvæv. Plantevæv er opdelt i følgende tre vævssystemer: epidermis, jordvæv og vaskulært væv.
Vævsprøver kan fremstilles af dyre- eller plantedele, f.eks. knogler, muskler, blade osv.
Kropsvæsker
Blod, serum, plasma, cerebrospinalvæske, spyt og ledvæske er kropsvæsker, som tilbyder en god kilde til diagnostisk relevant information. Derfor er en sofistikeret forberedelse af kropsvæskeprøver til analyse vigtig. Den første vanskelighed er forbundet med det brede dynamiske område af komponenter, der findes i kropsvæsker.
Bestemmelse af proteinkoncentration
Bradford-assay, Lowry-assay og bicinchoninsyre (BCA) assay er almindelige assays til at bestemme koncentrationen af proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) er en af de hyppigst anvendte proteinstandarder.
Lysis buffer
Lysebuffer skal vælges i overensstemmelse med cellematerialet eller vævet (vævskultur, plante, bakterier, svampe osv.), og om cellerne er i en struktur og typen af struktur. En bred vifte af lysisbuffere til ekstraktion af proteiner, membraner og organeller er formuleret med et eller flere rengøringsmidler. Vaskemidlet vælges normalt via trial-and-error-test eller – hvis tilgængelig – i henhold til en eksisterende proteinekstraktionsprotokol. Vaskemidlet skal være kompatibelt med vævskilden og proteinerne. Generelt vælges det mildeste vaskemiddel, der virker for et specifikt væv / protein, for at opretholde ekstraktets maksimale funktionalitet. I tilfælde af ekstraktion af membraner og organeller holder et mildt rengøringsmiddel desuden membranen intakt. Almindeligt anvendte rengøringsmidler i lysisbuffere er for det meste ikke-ioniske eller zwitterioniske, f.eks. CHAPS, deoxycholat, Triton™ X-100, NP40 og Tween 20.
F.eks. kan væv som hjerne, lever, tarm, nyre, milt osv. blot bufferes med RIPA – proteasehæmmere og DTT (f.eks. til gelelektroforese) bør dog inkluderes.
Lysisbuffer til skeletmuskelvæv (iskoldt): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol suppleret med protease- og fosfatasehæmmercocktail
Tabel over fælles buffere og deres pH-område. Generelt anvendes disse buffere normalt i koncentrationer på 20-50 mM.
| buffer | pH-område |
|---|---|
| Citronsyre – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumcitrat – Citronsyre | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetat – eddikesyre | 3.6 – 5.6 |
| Cacodylicsyre natriumsalt – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdihydrogenphosphat – dinatriumhydrogenphosphat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPPER – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolaminhydrochlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricin – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natriumtetraborat – borsyre | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
De fleste buffere viser en pH-afhængighed af temperaturen. Dette gælder især for Tris-buffere. pKa ændres fra 8,06 ved 25°C til 8,85 ved 0°C.
(pH og pKa i en buffer: pH måler koncentrationen af hydrogenioner i en vandig opløsning. pKa (= syredissociationskonstant) er et beslægtet, men mere specifikt mål, idet det hjælper med at forudsige, hvordan et molekyle vil opføre sig ved en bestemt pH-værdi.)
TRIzol
TRIzol er en kemisk opløsning, der bruges til at ekstrahere RNA/DNA/protein under guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-ekstraktionen. Brugen af ultralydassisteret TRIzol-ekstraktion resulterer i høje DNA-, RNA- og proteinudbytter fra den samme prøve og udmærker sig derved ved andre ekstraktionsmetoder.
Litteratur/Referencer
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.