Hielscher Ultralydsteknologi

Ultrasonic Protein Udsugning fra væv og cellekulturer

  • Proteinekstraktion er et essentielt prøveforberedelsestrin i proteomics.
  • Proteiner kan ekstraheres fra plante- og dyrevæv, gær og mikroorganismer.
  • Sonication er en pålidelig og effektiv proteinudvindingsmetode, der giver høj proteinudbytte inden for en kort ekstraktionstid.

 

Protein udvinding fra væv og celler

Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er et essentielt prøveforberedelsestrin, der udføres under mange biokemiske og analytiske teknikker, såsom ELISA, PAGE, Vestlig blotting, massespektrometri eller proteinrensning. ultralyd celleforstyrrelse, lysis og ekstraktion er en præcis styrbar teknik til at sikre høje udbytter af proteiner.

Proteinekstraktion fra animalsk væv

Til fremstilling af helformet væv (f.eks. Nyre, hjerte, lunge, muskel osv.) Skal vævet dissekeres i meget små stykker med rene værktøjer, på is og helst så hurtigt som muligt for at forhindre nedbrydning af proteaser (f.eks. lysis buffer såsom RIPA eller hypotonisk lysis buffer indeholdende protease og phosphatase inhibitor cocktail). Efter dissekering sænkes prøven i flydende nitrogen til snapfrysning. Prøven kan opbevares ved -80 ° C til senere brug eller blive bedøvet på is til øjeblikkelig homogenisering. Umiddelbart inden ultralydsekstraktion sættes iskold lyspuffer (med proteasehæmmere DTT, leupeptin og aprotinin) hurtigt i prøverøret (ca. 10 mg væv ca. ~ 600 μl buffer anbefales). Ca.. 20-60 mg væv anbefales pr. Prøverør.
Ultralydshomogenisering, lysis og ekstraktion udføres med en ultralydshomogenisator, såsom Uf200 ः t eller UP200St, udstyret med en mikro-tip sonotrode. Sonikeringstid er 60-90 sek. ved en ultralydcyklus-tilstand på 15 sek. sonikering og 10 sek. hviletid. Prøven skal opbevares i is hele tiden.
Efter ultralydshomogenisering / ekstraktion centrifugeres lysatet ved 27.000 g i ca. 20 min. Derefter opsamles supernatanten, således at proteinkoncentrationen kan bestemmes ved et proteinassay, såsom Pierce proteinassay BCA.

Protein sonikering er en vigtig metode til prøveforberedelse

Ultralyds proteinekstraktion fra celler med UP200St

Anmodning om oplysninger




Bemærk vores Fortrolighedspolitik.


Proteinekstraktion fra blodserum

Til en homogen blanding af serumet og phosphatpufferen virvles prøven først før ultralydcellelys. Til ultralydslysen sonikeres prøven med en ultralyd lab-homogenisator, såsom UP100H i 8 cyklusser ved 20% amplitude, til cykler af hver 5 sekund og 15 sekunder væk. Sonokationen udføres af sonicationg i cyklusser og ved at placere prøven på is, således at en overophedning og termisk nedbrydning af prøven undgås. Da serum indeholder en stor mængde proteiner med højt molekylvægt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G og immunoglobulin A), som forstyrrer adskillelsen af ​​proteiner med lav molekylvægt under IEF, anbefales det at nedbryde dem fra serum ved anvendelse af en udtømningskolonne.

Proteinekstraktion fra plantevæv

Frisk, blødt plantevæv, f.eks. Mos osv. Kan let forstyrres ved simpelthen at placere det hakkede prøveemne i lysisbuffer til sonikering. Tøde, ligenøse plantevæv, såsom frø, grannål osv., Skal jordes tørre. Nogle hårde træagtige plantematerialer skal fryses og formales i flydende nitrogen, før de ekstraheres ved sonikering. For plantecellekulturuspensioner er en ultralydsbehandling mellem 30 og 150 sekunder i en lyseringsbuffer for det meste tilstrækkelig. Hårdere materialer såsom græskarfrø kræver en mere intens lydbehandling som beskrevet nedenfor.

Protokol til ultralydsekstraktion af albumin fra græskarfrø

Ultralydvævshomogenisator UP400St med S24d40 - til proteinudvinding fra plante- og dyrevæv (Klik for større billede!)Til ultralydsproteinekstraktion af albumin fra fintjord græskarfrøpulver tilsættes 10 g fedtet græskarfrøpulver og 100 ml deioniseret vand som opløsningsmiddel i et 250 ml glasbæger. Proteinekstraktionen består i to trin: For det første sonikeres prøven med en ultralydgiver af sonde-typen UP400St (400W, 24kHz) med monteret sonotrode S24d7. Glasbeholderen anbringes i et koldt vandbad under ultralydshomogeniseringen. Indstillingen af ​​ultralydapparatet UP400St Med den tændbare temperaturføler sikres det, at prøvetemperaturen altid holdes under 30 ° C. Ved den præcise temperaturregulering under sonikering undgås en denaturering af albumin. For det andet blev ekstraktionen udført med en blander med 200 omdr./min. Hastighed og ved 30 ° C. Bagefter overføres bægeret til en termostatisk ryster. Globulin fjernes via dialyse med destilleret vand. Efter globulinfjernelsen kan proteinekstrakten samples til bestemmelse af albuminprofilen og justeres efterfølgende til pI = 3,0 under anvendelse af 0,1 M HCI til albuminkoagulation. Den faste fase separeres ved centrifugering ved 5000 g, 20 ° C og genopløses i deioniseret vand. Albuminkoagulation udføres to gange for at øge proteinforholdet i albuminkoncentratet.

Ultralyd alkalisk proteinekstraktion til fremstilling af proteinkoncentrat fra risklid viser, at ultralydsbehandling resulterer i højere proteinudbytte i en signifikant kortere ekstraktionstid – sammenlignet med konventionelle ekstraktionsmetoder.

Ultralyd enhed VialTweeter til proteinudvinding fra vævsprøver (Klik for større billede!)

VialTweeter til indirekte lydbehandling.

Fordele

  • hurtig
  • høje udbytter
  • meget effektiv
  • Præcis kontrol over parametre
  • reproducerbare resultater
  • lineær skalerbarhed

Prøvepræparationsprotokol for funktionelt iNOS-enzym

For at opnå fuldt funktionelt iNOS-enzym (fx til lægemiddel screening) anbefales følgende protokol: Cellesuspensionen skal anbringes på is og sonikat med en UP100H ved 10 μm amplitude ved cyklustilstand på 5 sek. sonikering og 25 sek. hvile på is. Proceduren skal gentages ca. 3 gange. Hviletid mellem sonikationscyklusser reducerer temperaturstigningen og vil derfor reducere risikoen for denaturering.

Ultralydproteinopløseliggørelse

Sonikation kan accelerere proteinopløsningen, som normalt kræver flere timer. For ikke at overophede prøven og forhindre proteinnedbrydning og modifikationer i opløsninger indeholdende urinstof, bør ultralydsbrud ikke vare længere end få sekunder.

Generelle instruktioner

Temperaturregulering: For at sikre et højt proteinudbytte uden termisk denaturering skal temperaturen under ekstraktion kontrolleres. Hielscher's state-of-art ultralyd homogenisatorer – også kaldet ultralydsdesintegrator eller sonificator – netop er styrbar. De kommer med en tilkoblelig temperaturføler. I indstillingsmulighederne i ultralydshomogenisator, kan en maksimal temperatur indstilles. Når denne temperatur max er nået, stopper ultralydsapparat automatisk indtil prøven er afkølet.
Buffer: Valget af en egnet puffer og den rigtige volumen buffer varierer fra væv til væv og skal være regnet ud ved trial-and-error test.
Isolering / oprensning: Proteinlysater kan indeholde et overskud af biomolekyler, såsom DNA eller kulhydrater, som kan fjernes ved proteinpræcipitation (deoxycholat-trichloreddikesyre) eller buffer udveksling.

Chittapalo og Noomhorm (2009) rapporterede, at proteinudbyttet steg ved anvendelse af sonikering, og at ultralydvævshomogeniserings- og lysisprocessen kan forbedre eksisterende udvindingsprocesser signifikant – muliggør nye kommercielle udvindingsmuligheder.

Lydbeskyttelse med Hielscher lydkabinet SPB-L og ultralydsenhed UP200St. (Klik for større billede!)

Ultralydvævshomogenisator UP200St til effektiv proteinekstraktion

Præcis kontrol af ultralydsbehandling (Klik for større billede!)

Browser kontrol til præcis drift og overvågning af sonication processen

Ultralyd udstyr til protein ekstraktion

Hielscher Ultrasonics tilbyder en bred vifte af ultralyd homogenisatorer til disintegration af celler, væv, bakterier, mikroorganismer, gær og sporer.
Hielscher Lab Ultrasonicators er kraftfulde og nemme at betjene. Bygget til 24/7 drift, er de designet som robuste og effektive laboratorie- og bænk-enheder. For alle enheder kan energiproduktionen og amplituden justeres nøjagtigt. Det brede udvalg af tilbehør åbner yderligere opsætningsmuligheder. De digitale enheder som f.eks VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, og UP400St har en integreret temperaturkontrol og et indbygget SD-kort til automatisk dataoptagelse.
For den indirekte, krydsforureningsfri og samtidig lydbehandling af flere prøver, tilbyder vi VialTweeter eller den Ultralyd CupHorn.
Afhængigt af din ansøgning, materiale og prøvevolumen vil vi anbefale dig det mest egnede opsætning til din prøveudgave. Kontakt os i dag!

Kontakt os! / Spørg Os!

Brug venligst nedenstående formular, hvis du ønsker at anmode om yderligere oplysninger om ultralydshomogenisering. Vi vil være glade for at tilbyde dig en ultralyds-system opfylder dine krav.









Bemærk venligst, at vores Fortrolighedspolitik.


Litteratur / Referencer

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultralydassisteret alkaliekstraktion af protein fra affedtet risklid og egenskaber af proteinkoncentraterne. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Effektiv genopretning af proteiner fra multiple source prøver efter trizol eller trizol LS RNA ekstraktion og langtidsopbevaring. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Fakta Værd at vide

proteomics

Proteomics er forskningsfeltet, der undersøger proteiner og proteom. Proteiner fullfil en bred vifte af vitale funktioner inden for organismer. Proteomet er det samlede sæt af proteiner ved et genom, celle, væv eller organisme, udtrykkes på et bestemt tidspunkt. Den proteom varierer med tid og tydelige krav eller understreger, at en celle eller organisme gennemgår. Mere specifikt er det det sæt af udtrykte proteiner i en given type celle eller organisme, på et givet tidspunkt, under definerede betingelser. Udtrykket er en blanding af proteiner og genom. Proteomics er studiet af proteom.

Protein

Proteiner er er store biomolekyler, såkaldte makromolekyler – som er sammensat af en eller flere lange kæder af aminosyrerester. Proteiner er til stede i alle organismer af både vegetabilsk og animalsk oprindelse, og de er afgørende for de fleste biologiske funktioner. Da proteiner indeholder en masse biologiske oplysninger, ekstraheres de til analytisk formål, fx til proteomisk forskning. Den vigtigste funktion, der udføres af proteiner, omfatter katalyse af metaboliske reaktioner, DNA-replikation, respons på stimuli og transport af molekyler fra et sted til et andet. Proteiner adskiller sig fra hinanden primært i deres sekvens af aminosyrer, som dikteres af nukleotidsekvensen af ​​deres gener, og som normalt resulterer i proteinfoldning i en specifik tredimensionel struktur, der bestemmer dens aktivitet. Proteiner er – foruden peptider – en af ​​de vigtigste komponenter i fødevarer. Derfor proteomik er et stærkt værktøj i fødevarevidenskab at optimere processer, fødevaresikkerhed og ernæring vurdering.

Gelelektroforese

Gelelektroforese er den vigtigste metode til separation og analyse af makromolekyler såsom DNA, RNA og proteiner samt deres fragmenter, baseret på deres størrelse og ladning. Det anvendes i klinisk kemi at separere proteiner ved ladning og / eller størrelse (IEF agarose, især størrelse uafhængig) og i biokemi, molekylærbiologi og proteomics at adskille en blandet population af DNA og RNA-fragmenter efter længde, at anslå størrelsen af ​​DNA og RNA-fragmenter eller til at adskille proteiner ved beregning.

Cellekulturer

Cellekultur er den styrede voksende proces, hvorved cellerne dyrkes under kontrollerede forhold. Celledyrkningsbetingelser varierer for hver celletype. Generelt miljøet af en cellekultur består af en egnet beholder (fx petriskål) med substrat eller medium, der leverer vigtige næringsstoffer (aminosyrer, kulhydrater, vitaminer, mineraler), vækstfaktorer, hormoner og gasser (CO2, Den2), Og regulerer fysisk-kemiske miljø (pH-puffer, osmotisk tryk, temperatur). De fleste celler har brug for en overflade eller kunstigt substrat, mens andre cellekulturer kan dyrkes fritflydende i dyrkningsmedium (suspensionskultur, cellesuspension).
Massekulturer af animalske cellelinier anvendes i industriel produktion af virale vacciner og andre bioteknologisk afledte produkter. Menneskelige stamceller dyrkes for at udvide antallet af celler og differentiere cellerne i forskellige somatiske celletyper til transplantationsformål.

vævsprøver

Udtrykket væv beskriver en cellulær mellemprodukt, hvor cellematerialet er på en organisatorisk plan mellem celler og en fuldstændigt organ. I væv, lignende celler, fra samme oprindelse som tilsammen udfører en specifik funktion, er samlet. Af den funktionelle gruppering af flere væv er de komplekse strukturer af organer dannet.
Væv samples til forskning i biologi, histologi / histopatologi, parasitologi, biokemi, immunhistokemi samt at dyrke og ekstrahere DNA. Det kan skelnes mellem dyr (underafsnit: pattedyr væv) og plantevæv. Dyrevæv er inddelt i fire grundlæggende typer af binde-, muskel, nervøs, og epithelvæv. Plant væv er opdelt i følgende tre væv systemer: epidermis, jorden væv, og det vaskulære væv.
Vævsprøver kan fremstilles ud fra animalske eller plantedele, f.eks knogler, muskler, blade, etc.

Krop Væsker

Blod, serum, plasma, cerebrospinalvæske, spyt og synovialvæske er kropsvæsker, som tilbyder en stor kilde til diagnostisk relevante oplysninger. Derfor er en sofistikeret fremstilling af legemsvæskeprøver til analyse er vigtig. Det første problem er forbundet med den brede dynamikområde bestanddele til stede i legemsvæsker.

Bestemmelse af proteinkoncentration

Bradford-assay, Lowry-assay og bicinchoninsyre (BCA) er almindelige assays til bestemmelse af koncentrationen af ​​proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) er en af ​​de hyppigst anvendte proteinstandard.

Lysis buffer

Lysisbuffer skal valgt i overensstemmelse med cellematerialet eller væv (vævskultur, plante, bakterier, svampe, etc.) og om cellerne er i en struktur og typen af ​​struktur. En bred vifte af lysis buffere til ekstraktion af proteiner, membraner, og organeller formuleres med en eller flere detergenter. Detergentet vælges sædvanligvis via trial-and-error test eller – hvis muligt – ifølge en eksisterende proteinekstraktionsprotokol. Vaskemiddelet skal være kompatibelt med vævskilden og proteinerne. Generelt vælges det mildeste rengøringsmiddel, der virker for et specifikt væv / protein, for at opretholde ekstraktets maksimale funktionalitet. I tilfælde af ekstraktion af membraner og organeller holder et mildt rengøringsmiddel membranen intakt. Almindeligt anvendte vaskemidler i lysisbuffere er for det meste nonioniske eller zwitterioniske, f.eks. CHAPS, deoxycholat, Triton ™ X-100, NP40 og Tween 20.
For eksempel kan væv som hjerne, lever, tarm, nyrer, milt etc. simpelt bukkes med RIPA – Imidlertid bør proteasehæmmere og DTT (fx til gelelektroforese) medtages.
Lysis-buffer til skeletmuskelvæv (iskold): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (vægt / volumen) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM ditithreitit suppleret med protease og phosphataseinhibitor cocktail
Tabel med almindelige buffere og deres pH-interval. I almindelighed anvendes disse buffere normalt i koncentrationer på 20-50 mM.

Buffer pH-interval
Citronsyre – Naoh 2,2 af – 6,5 af
Natriumcitrat – Citronsyre 3,0 af – 6,2 af
Natriumacetat – eddikesyre 3,6 af – 5,6 af
Cacodylsyre-natriumsalt – HCI 5,0 af – 7,4 af
MY – Naoh 5,6 af – 6,8 af
Natriumdihydrogenphosphat – dinatriumhydrogenphosphat 5,8 af – 8,0
imidazol – HCI 6,2 af – 7,8 af
Mopper – Koh 6,6 af – 7,8 af
Triethanolaminhydrochlorid – Naoh 6,8 af – 8,8
tris – HCI 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 af – 8,2 af
Tricin – Naoh 7,6 af – 8,6 af
Natriumtetraborat – borsyre 7,6 af – 9,2 af
bicin – Naoh 7,7 af – 8,9 af
Glycin – Naoh 8,6 af – 10,6 af

De fleste puffere viser en pH-afhængighed med temperaturen. Dette gælder især for Tris-buffere. PKa skifter fra 8,06 ved 25 ° C til 8,85 ved 0 ° C.
(PH og pKa af en puffer: pH måler koncentrationen af ​​hydrogenioner i en vandig opløsning pKa (= syredissociationskonstant) er en beslægtet, men mere specifik foranstaltning, idet den hjælper til at forudsige, hvordan et molekyle vil reagere på et specifikt. pH-værdi.)

Af TRIzol

TRIzol er en kemisk opløsning, der anvendes til at ekstrahere RNA / DNA / protein under guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion. Anvendelsen af ​​ultralyd bistået TRIZOL ekstraktionsresultater i høj DNA, RNA og protein udbytter fra den samme prøve og udmærker derved andre ekstraktionsmetoder.