• Proteinekstraktion er et essentielt prøveforberedelsestrin i proteomics.
• Proteiner kan ekstraheres fra plante- og dyrevæv, gær og mikroorganismer.
• Sonication er en pålidelig og effektiv proteinudvindingsmetode, der giver høj proteinudbytte inden for en kort ekstraktionstid.

Protein udvinding fra væv og celler

Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er et vigtigt prøveforberedelsestrin, der udføres under mange biokemiske og analytiske teknikker såsom ELISA, PAGE, Western blotting, massespektrometri eller proteinoprensning. Ultralydcelleforstyrrelse, lysis og ekstraktion er en præcist kontrollerbar, ikke-termisk teknik for at sikre høje udbytter af proteiner.

Generelle instruktioner til ultralydslysis og proteinekstraktion

• Temperaturregulering: For at sikre et højt proteinudbytte uden termisk denaturering skal temperaturen under ekstraktion kontrolleres. Hielscher's state-of-art ultralyd homogenisatorer – Også kaldet ultralyd disintegrator eller ultrasonifier – netop er styrbar. De kommer med en tilkoblelig temperaturføler. I indstillingsmulighederne i ultralydshomogenisator, kan en maksimal temperatur indstilles. Når denne temperatur max er nået, stopper ultralydsapparat automatisk indtil prøven er afkølet.
• Buffer: Valget af en egnet puffer og den rigtige volumen buffer varierer fra væv til væv og skal være regnet ud ved trial-and-error test.
• Isolering / oprensning: Proteinlysater kan indeholde et overskud af biomolekyler, såsom DNA eller kulhydrater, som kan fjernes ved proteinpræcipitation (deoxycholat-trichloreddikesyre) eller buffer udveksling.

Chittapalo og Noomhorm (2009) rapporterede i deres undersøgelse, at proteinudbyttet steg ved hjælp af sonikering, og at ultralydvævshomogeniserings- og lyseprocessen kan forbedre eksisterende ekstraktionsprocesser betydeligt – muliggør nye kommercielle udvindingsmuligheder.
 

Proteinekstraktion fra animalsk væv

Til fremstilling af helformet væv (f.eks. Nyre, hjerte, lunge, muskel osv.) Skal vævet dissekeres i meget små stykker med rene værktøjer, på is og helst så hurtigt som muligt for at forhindre nedbrydning af proteaser (f.eks. lysis buffer såsom RIPA eller hypotonisk lysis buffer indeholdende protease og phosphatase inhibitor cocktail). Efter dissekering sænkes prøven i flydende nitrogen til snapfrysning. Prøven kan opbevares ved -80 ° C til senere brug eller blive bedøvet på is til øjeblikkelig homogenisering. Umiddelbart inden ultralydsekstraktion sættes iskold lyspuffer (med proteasehæmmere DTT, leupeptin og aprotinin) hurtigt i prøverøret (ca. 10 mg væv ca. ~ 600 μl buffer anbefales). Ca.. 20-60 mg væv anbefales pr. Prøverør.
Ultralydhomogenisering, lysis og ekstraktion udføres med en ultralydhomogenisator såsom UP100H eller UP200Ht, udstyret med en mikro-tip sonotrode. Sonikering varighed er 60-90 sek. ved en ultralyd cyklus tilstand på 15 sek. sonikering og 10 sek. hviletid. Prøven skal opbevares i is hele tiden.
Efter ultralydshomogenisering / ekstraktion centrifugeres lysatet ved 27.000 g i ca. 20 min. Derefter opsamles supernatanten, således at proteinkoncentrationen kan bestemmes ved et proteinassay, såsom Pierce proteinassay BCA.

Proteinekstraktion fra blodserum

For en homogen blanding af serum og fosfatbufferen hvirvles prøven først før ultralydcellelyse. Til ultralydlysis sonikeres prøven med en ultralydslaboratoriehomogenisator som UP100H i 8 cyklusser ved 20% amplitude i cyklusser på hver 5 sekunder tændt og 15 sekunder slukket. Proteinekstraktion udføres ved sonikering i cyklusser (pulseringstilstand) og ved at placere prøven på is, så overophedning og termisk nedbrydning af prøven undgås. Da serum indeholder en stor mængde proteiner med høj molekylvægt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G og immunoglobulin A), som interfererer med adskillelsen af proteiner med lav molekylvægt under IEF, anbefales det at nedbryde dem fra serumet ved anvendelse af en udtømningskolonne.

Proteinekstraktion fra plantevæv

Frisk, blødt plantevæv, f.eks. Mos osv. Kan let forstyrres ved simpelthen at placere det hakkede prøveemne i lysisbuffer til sonikering. Tøde, ligenøse plantevæv, såsom frø, grannål osv., Skal jordes tørre. Nogle hårde træagtige plantematerialer skal fryses og formales i flydende nitrogen, før de ekstraheres ved sonikering. For plantecellekulturuspensioner er en ultralydsbehandling mellem 30 og 150 sekunder i en lyseringsbuffer for det meste tilstrækkelig. Hårdere materialer såsom græskarfrø kræver en mere intens lydbehandling som beskrevet nedenfor.
 

Protokol til ultralydsekstraktion af albumin fra græskarfrø

Til ultralydproteinekstraktion af albumin fra finmalet græskarfrøpulver tilsættes 10 g affedtet græskarfrøpulver og 100 ml deioniseret vand som opløsningsmiddel i et 250 ml glasbægerglas. Proteinekstraktionen består af to trin: For det første sonikeres prøven med en sonde-type ultralydator UP400St (400W, 24kHz) udstyret med sonotrode S24d7. Glasbægeret anbringes i et koldt vandbad under ultralydhomogeniseringen. Den stikbare temperatursensor og temperaturreguleringsindstillingerne for ultralydapparatet UP400St sikrer, at prøvetemperaturen altid holdes under 30 ° C. Ved den præcise temperaturregulering under sonikering undgås en denaturering af albumin. For det andet blev ekstraktionen udført med en mixer ved 200 o / min hastighed og ved 30 ° C. Derefter overføres bægerglasset til en termostatisk ryster. Globulin fjernes via dialyse med destilleret vand. Efter fjernelse af globulin kan proteinekstraktet udtages til bestemmelse af albuminprofilen og justeres derefter til pI = 3,0 under anvendelse af 0,1 M HCl til albuminkoagulation. Den faste fase separeres ved centrifugering ved 5000 g, 20 °C og opløses igen i deioniseret vand. Albuminkoagulation udføres to gange for at øge proteinforholdet i albuminkoncentratet.

Ultralyd alkalisk proteinekstraktion til fremstilling af proteinkoncentrat fra risklid viser, at ultralydsbehandling resulterer i højere proteinudbytte i en signifikant kortere ekstraktionstid – sammenlignet med konventionelle ekstraktionsmetoder.

Prøvepræparationsprotokol for funktionelt iNOS-enzym

For at opnå fuldt funktionelt iNOS-enzym (f.eks. Til lægemiddelscreening) anbefales følgende protokol: Cellesuspensionen skal placeres på is og sonikeres med en UP100H ved 10μm amplitude ved cyklustilstand på 5 sek. sonikering og 25 sek. hvile på is. Proceduren skal gentages ca. 3 gange. Hviletiden mellem sonikeringscyklusser reducerer temperaturstigningen og vil derfor reducere risikoen for denaturering.

Ultralydproteinopløseliggørelse

Sonikation kan accelerere proteinopløsningen, som normalt kræver flere timer. For ikke at overophede prøven og forhindre proteinnedbrydning og modifikationer i opløsninger indeholdende urinstof, bør ultralydsbrud ikke vare længere end få sekunder.

Ultralyd udstyr til protein ekstraktion

Hielscher Ultrasonics tilbyder en bred vifte af ultralyd homogenisatorer til disintegration af celler, væv, bakterier, mikroorganismer, gær og sporer.
Hielscher lab ultralydapparater er kraftfulde og nemme at betjene. De er bygget til 24/7 drift og er designet som robuste og effektive laboratorie- og bænkenheder. For alle enheder kan energiudgangen og amplituden styres præcist. Det brede udvalg af tilbehør åbner yderligere opsætningsmuligheder. De digitale ultralydapparater som VialTweeter, UP200Ht, UP200St og UP400St har en integreret temperaturkontrol og et indbygget SD-kort til automatisk dataoptagelse.
Til indirekte, krydskontamineringsfri og samtidig sonikering af flere prøver tilbyder vi VialTweeter eller ultralyd CupHorn.
Tabellen nedenfor giver dig et overblik over vores ultralydapparater til prøveforberedelse, celleforstyrrelser og ekstraktion. Klik på enhedstypen for at få mere information om hver ultralydhomogenisator. Vores veluddannede og langvarige erfaringer teknisk personale vil med glæde hjælpe dig med at vælge den mest egnede ultralydator til din prøveforberedelse!
 

Afhængigt af din ansøgning, materiale og prøvevolumen vil vi anbefale dig det mest egnede opsætning til din prøveudgave. Kontakt os i dag!