Proteinekstraktion fra væv og cellekulturer med ultralyd

• Proteinekstraktion er et væsentligt trin i prøveforberedelsen inden for proteomik.
• Proteiner kan ekstraheres fra plante- og dyrevæv, gær og mikroorganismer.
• Sonikering er en pålidelig og effektiv metode til proteinekstraktion, som giver høje proteinudbytter på kort ekstraktionstid.

Proteinekstraktion fra væv og celler

Proteinekstraktion fra væv og dyrkede celler er et væsentligt trin i prøveforberedelsen, som udføres i forbindelse med mange biokemiske og analytiske teknikker såsom ELISA, PAGE, Western blotting, massespektrometri eller proteinoprensning. Celledisintegration, lyse og ekstraktion med ultralyd er en ikke-termisk teknik, der kan styres præcist for at sikre høje proteinudbytter.

Generelle anvisninger til lyse og proteinekstraktion med ultralyd

• Temperaturstyring: For at sikre et højt proteinudbytte uden termisk denaturering skal temperaturen under ekstraktionen styres. Hielschers avancerede ultralydshomogenisatorer – også kaldet ultralydsdisintegratorer eller ultralydsapparater – kan styres præcist. De leveres med en tilslutningsbar temperaturføler. I ultralydshomogenisatorens indstillinger kan der angives en maksimumtemperatur. Når denne maksimumtemperatur nås, stopper ultralydsapparatet automatisk, indtil prøven er kølet ned.
• Buffer: Valget af en egnet buffer og det rette buffervolumen varierer fra væv til væv og skal fastlægges ved at prøve sig frem.
• Isolering / oprensning: Proteinlysater kan indeholde et overskud af biomolekyler såsom DNA eller kulhydrater, som kan fjernes ved proteinudfældning (deoxycholat-trichloreddikesyre) eller bufferudskiftning.

Chittapalo og Noomhorm (2009) rapporterede i deres undersøgelse, at proteinudbyttet steg ved brug af sonikering, og at processen med vævshomogenisering og lyse med ultralyd kan forbedre eksisterende ekstraktionsprocesser betydeligt – hvilket åbner for nye kommercielle ekstraktionsmuligheder.
 

Proteinekstraktion fra dyrevæv

Ved forberedelse af hele vævsstykker (f.eks. nyre, hjerte, lunge, muskel osv.) bør vævet dissekeres i meget små stykker med rene redskaber, helst på is og så hurtigt som muligt for at forhindre nedbrydning ved proteaser (f.eks. lysebuffer såsom RIPA eller hypotonisk lysebuffer, der indeholder en blanding af protease- og fosfatasehæmmere). Efter dissektion nedsænkes prøven i flydende kvælstof til lynfrysning. Prøven kan opbevares ved -80°C til senere brug eller holdes på is til umiddelbar homogenisering. Umiddelbart før ultralydsekstraktionen tilsættes iskold lysebuffer (med proteasehæmmerne DTT, leupeptin og aprotinin) hurtigt til prøverøret (der anbefales ca. ~600 μL buffer pr. ~10 mg væv). Der anbefales ca. 20–60mg væv pr. prøverør.
Homogenisering, lyse og ekstraktion med ultralyd udføres med en ultralydshomogenisator såsom UP100H eller UP200Ht, der er udstyret med en sonotrode med mikrospids. Sonikeringens varighed er 60–90 sek. i en ultralydscyklustilstand med 15 sek. sonikering og 10 sek. pause. Prøven bør hele tiden holdes på is.
Efter homogenisering / ekstraktion med ultralyd centrifugeres lysatet ved 27.000g i ca. 20 min. Derefter opsamles supernatanten, så proteinkoncentrationen kan bestemmes med et proteinassay såsom Pierce BCA-proteinassay.

Proteinekstraktion fra blodserum

For at opnå en homogen blanding af serum og fosfatbuffer vortexblandes prøven først inden cellelyse med ultralyd. Til ultralydslysen sonikeres prøven med en ultralydshomogenisator til laboratoriebrug såsom UP100H i 8 cyklusser ved 20% amplitude, hvor hver cyklus består af 5 sekunder med ultralyd og 15 sekunder uden ultralyd. Proteinekstraktionen udføres ved sonikering i cyklusser (pulserende tilstand) og ved at placere prøven på is, så overophedning og termisk nedbrydning af prøven undgås. Da serum indeholder en stor mængde proteiner med høj molekylvægt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G og immunglobulin A), som forstyrrer separationen af proteiner med lav molekylvægt under IEF, anbefales det at fjerne dem fra serum ved hjælp af en depletionskolonne.

Proteinekstraktion fra plantevæv

Friskt, blødt plantevæv, f.eks. mos osv., kan let disintegreres ved blot at placere det hakkede prøvemateriale i lysebuffer til sonikering. Sejt, lignificeret plantevæv, såsom frø, grannåle osv., bør formales tørt. Nogle hårde, træagtige plantematerialer skal fryses og formales i flydende kvælstof, før de ekstraheres ved sonikering. Til suspensioner af plantecellekulturer er en ultralydsbehandling på mellem 30 og 150 sekunder i en lysebuffer som regel tilstrækkelig. Sejere materiale såsom græskarkerner kræver en mere intens sonikering som beskrevet nedenfor.
 

Protokol for ekstraktion af albumin fra græskarkerner med ultralyd

Til proteinekstraktion af albumin fra fintformalet græskarkernepulver med ultralyd tilsættes 10 g affedtet græskarkernepulver og 100 mL deioniseret vand som opløsningsmiddel til et 250mL bægerglas. Proteinekstraktionen består af to trin: Først sonikeres prøven med et ultralydsapparat med sonde, UP400St (400W, 24kHz), udstyret med sonotroden S24d7. Bægerglasset placeres i et koldt vandbad under ultralydshomogeniseringen. Den tilslutningsbare temperaturføler og temperaturstyringsindstillingerne på ultralydsapparatet UP400St sikrer, at prøvetemperaturen altid holdes under 30°C. Den præcise temperaturstyring under sonikeringen forhindrer denaturering af albumin. Som andet trin blev ekstraktionen udført med en blander ved en hastighed på 200 rpm og ved 30°C. Derefter overføres bægerglasset til en termostatstyret ryster. Globulin fjernes ved dialyse med destilleret vand. Efter fjernelsen af globulin kan der udtages en prøve af proteinekstraktet til bestemmelse af albuminprofilen, og ekstraktet justeres derefter til pI=3,0 med 0,1 M HCl for at koagulere albumin. Den faste fase separeres ved centrifugering ved 5000g, 20°C og genopløses i deioniseret vand. Albuminkoagulering udføres to gange for at øge proteinandelen i albuminkoncentratet.

Alkalisk proteinekstraktion med ultralyd til fremstilling af proteinkoncentrat fra risklid viser, at ultralydsbehandlingen giver et højere proteinudbytte på en betydeligt kortere ekstraktionstid – sammenlignet med konventionelle ekstraktionsmetoder.

Prøveforberedelsesprotokol til funktionelt iNOS-enzym

For at opnå fuldt funktionelt iNOS-enzym (f.eks. til lægemiddelscreening) anbefales følgende protokol: Cellesuspensionen bør placeres på is og sonikeres med en UP100H ved 10µm amplitude i en cyklustilstand med 5 sek. sonikering og 25 sek. pause på is. Proceduren bør gentages ca. 3 gange. Pausen mellem sonikeringscyklusserne mindsker temperaturstigningen og vil derfor mindske risikoen for denaturering.

Proteinsolubilisering med ultralyd

Sonikering kan fremskynde proteinsolubiliseringsprocessen, som normalt kræver flere timer. For at undgå overophedning af prøven og forhindre proteinnedbrydning og modifikationer i opløsninger, der indeholder urinstof, bør ultralydspulserne ikke vare længere end få sekunder.

Ultralydsudstyr til proteinekstraktion

Hielscher Ultrasonics tilbyder et bredt udvalg af ultralydshomogenisatorer til disintegration af celler, væv, bakterier, mikroorganismer, gær og sporer.
Hielschers ultralydsapparater til laboratoriebrug er kraftige og nemme at betjene. De er bygget til drift 24/7 og konstrueret som robuste og effektive laboratorie- og bordapparater. På alle apparater kan energioutput og amplitude styres præcist. Det brede udvalg af tilbehør giver yderligere muligheder for opsætning. De digitale ultralydsapparater såsom VialTweeter, UP200Ht, UP200St og UP400St har integreret temperaturstyring og et indbygget SD-kort til automatisk dataregistrering.
Til indirekte, samtidig sonikering af flere prøver uden krydskontaminering tilbyder vi VialTweeter eller ultralyds-CupHorn.
Tabellen nedenfor giver dig et overblik over vores ultralydsapparater til prøveforberedelse, celledisintegration og ekstraktion. Klik på apparattypen for at få flere oplysninger om hver ultralydshomogenisator. Vores veluddannede tekniske personale med mange års erfaring hjælper dig gerne med at vælge det bedst egnede ultralydsapparat til din prøveforberedelse!
 

Afhængigt af din anvendelse, dit materiale og dit prøvevolumen anbefaler vi den bedst egnede opsætning til din prøveforberedelse. Kontakt os i dag!