Ultralyd forberedelse af C. Elegans Prøver

Ultralyd forberedelse af C. Elegans Prøver

C. elegans er rundorm, som er meget udbredt i forskningslaboratorier til at undersøge genomforskning, udviklingsbiologi, og sygdomme. Mange gener i genomet af C. elegans har funktionelle modstykker hos mennesker. Derved er nematodeormen en yderst nyttig model for sygdomme hos mennesker. Andre fordele for den brede brug af C. elegans er dens nemme og billige dyrkning på plader, der indeholder bakterier (f.eks, E. coli), dens gennemsigtighed, bekvem håndtering, samt muligheden for at fryse og opbevare orme i en længere periode.
Protein- og lipidanalyser er regelmæssige procedurer i laboratorier, og ultralydsprøvepræparat er den etablerede metode til at lyse C. elegans nematoder i alle udviklingsfaser (dvs. embryoner, larver L1-L4, voksne). Da C. elegans også anvendes som proteinudtrykssystem til overekspresbare, er der behov for en pålidelig, reproducerbar lysis- og proteinekstraktionsmetode, som giver et højt proteinudbytte. Ultralydcelleafbrydelses- og ekstraktionssystemer fås som sonde-type homogenisatorer og som multi-sample ultralydsenheder. Catering til praktisk prøve forberedelse og alle slags prøve størrelser numre, Hielscher Ultrasonics har den ideelle ultralyd celle disruptor til din lab procedure.

Ultralydprotokoller til C. Elegans Disruption og Lysis

Ultralydhomogenisering og lysis af C. elegans og den efterfølgende protein- og lipidekstraktion kan udføres ved hjælp af forskellige procedurer ved hjælp af forskellige homogeniserings- og lysisbuffere osv. Alle lysisprotokoller har det til fælles, at prøverne løbende skal opbevares på is for at forhindre proteinforringelse. Nedenfor præsenterer vi dig nogle pålidelige og hurtige ultralydlysis og ekstraktionsprotokoller til fremstilling af protein- eller lipidholdige C. elegans prøver af høj kvalitet.

Fordele ved Ultralyd C. elegans Lysis

• pålidelig
• reproducerbar
• præcistemperaturstyret
• pålidelig processtyring
• skånsom metode
• let at anvende
• sikker

Ultralydproteinekstraktion fra C. elegans prøver

Ultralydlysis og proteinekstraktion af C. elegans orme kan udføres ved hjælp af forskellige protokoller. Nedenfor præsenterer vi dig et par pålidelige og hurtige lysis protokoller for reproducerbare protein ekstraktion resultater.

Hurtig præpartation af cytosol ekstrakt fra C. elegans Worms af Sonikering

Med følgende protokol kan du forberede C. elegans lysates på mindre end 30 minutter.
Indsamling af C. elegans
Vælg de ønskede C. elegans orme i en 1,5 ml rør fosfat buffered saltvand (PBS) eller vaske dem fra en plade med 1,5 ml PBS. Centrifuge på for 1min ved 2000rpm til pellet. Hold prøverne hele tiden på is.
Vask derefter ormene to gange med PBS.
Bagefter vaskes ormene to gange med ddH₂O.
Resuspend ormene i mindst 500ul homogenisering buffer (HB). Ormen prøverne er nu klar til ultralyd lysis.
For højere proteinekstrakt kvalitet, kan du reducere bakteriel forurening ved at vaske orme i 5min hver i PBS og sterilt, ultra-rent vand (ddH₂O) eller udføre saccharose floatation. Hold ormen prøver kontinuerligt på is.

Ultralyd C. elegans Lysis-protokollen

• Sørg for, at du forbereder ultralydsprængningen på forhånd, så ultralydshomogenisatoren er klar til brug (sondemonteret, sonikeringsprogram forudindstillet).

Hvis din ultralydsmaskine er stand-monteret, skal du placere isbadet med dine prøverør under ultralydssonden og indsætte ultralydsonden i 1,5 ml røret.

• For C. elegans lysis med UP200St eller UP200Ht skal ultralydbehandling udføres ved hjælp af et mikrotip (f.eks. 2 mm sonde S26d2; se billedet til venstre) ved 40% amplitude i 1sk med 30sec pauser i mellem. 5 sonikering cykler for hver 1 sekund med 30sec pauser er ideelle til C. elegans lysis. Hvis du udfører lysis for første gang, kan du kontrollere lysis progression i små aliquots af prøven efter hver puls ved hjælp af et mikroskop.
• Lysis er fuldført, når ormene afbrydes. Over-sonikering resulterer i brud på kerner og bliver synlig, når prøven bliver tyktflydende eller skum. Brug om nødvendigt flere impulser for at forhindre prøvenedbrydning. Må ikke øge tiden for hver ultralyd puls cyklus for at få høj kvalitet protein ekstrakter.
• Klar celle lysere ved centrifugering af ultralydlysede orme ved 14.000 omdr./min. i 10min ved 4ºC.
• Derefter overføre supernatant til en frisk rør og forberede immunoprecipitation eller andre analyser.

Bemærkning til homogeniseringsbuffer: Forbered homogeniseringsbufferen til ultralydslyseprotokollen ovenfor på følgende måde:

Ultralydlysis af C. elegans for kvantitative affinitetsrensningsanalyser

C. elegans embryoner (∼2 millioner pr replikat) blev friskhøstet i biologiske tre eksemplarer ved blegning unge gravid hermafroditter og sonikeret på is (cyklus: 0,5 s, amplitude: 40-45%, 5 slag / session, 5 sessioner, interval mellem sessioner: 30 s; UP200S ultralydsprocessor med mikrospids S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) i lysisbuffer (samlet volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteasehæmmerblanding, 0,1% Nonidet P-40 Erstatning). Efter sonikering blev Nonidet P-40 Stedfortræder lagt op til 1%, og lysatet blev inkuberet med hovedet over halerotation ved 4 °C i 30 min. efterfulgt af centrifugering ved 20.000 × g i 20 min. ved 4°C. Renset lysate blev derefter aspireret uden at forstyrre overlæbelaget og delt med halvdelen i enten anti-GFP agarose perler eller de blokerede kontrol perler (40-50 μl). Efter hoved over hale rotation ved 4 ° C i 60-90 min, perlerne blev vasket en gang med lysis buffer indeholder 0,1% Nonidet P-40 Stedfortræder, efterfulgt af to vasketider i enten buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller begge dele. For GFP:MBK-2-trækninger blev der udført to separate eksperimenter ved hjælp af forskellige vaskeforhold. Proteiner blev eluteret ved orbital omrystning i 50 μl på 6 m urinstof/2 M thiourea ved stuetemperatur. Til mbk-1::GFP pull-down-forsøgene blev proteiner eluteret to gange ved omrystning i 50μl 8 m guanidiniumchlorid ved 90°C efterfulgt af ethanolfældning. Eluterede proteinprøver blev derefter fordøjet i opløsning.
(jf. Chen et al., 2016)

Ultralydorm homogenisering og lysis

For C.elegans lysis og proteinekstraktion blev der indsamlet 30.000 nemotoder af det relevante stadium pr. prøve og vasket i iskold S-basal, koncentreret ved centrifugering ved 1500 omdrejning i 2 min., vasket seks gange med iskold S-basal for at fjerne restbakterier og derefter opbevares på is, indtil den var klar til brug. Til proteinekstraktion fik gravid-voksne orme lov til at danne en kompakt pellet efter den sidste S-basalvask. Worm pellets blev derefter resuspended i 1 ml iskold ekstraktion Buffer [20 mM kaliumphosphat, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, protease hæmmere (Sigma P2714)] og behandles straks.
∼30.000 gravid-voksne orme (svarende til ∼100 mg vådvægt), blev sonikeret på is ved hjælp af en sonde-type ultralydsmaskine (f.eks UP50H med microtip MS2) ved 40% amplitude i 10 cyklusser af 3 sek på, 30 sek off, i 1 ml iskold udvinding buffer. (jf. Baskharan et al. 2012)

Ultralyd lipid udvinding fra C. elegans

I lipidomics, en gren af metabolomics, lipid supplement af biologiske systemer er karakteriseret og analyseret. C. elegans er meget udbredt i lipidomics at undersøge samspillet mellem metaboliske lipider og deres virkninger på sundhed og levetid.
Ultralydlysis og ekstraktion bruges til at frigive lipider såsom sphingolipids fra C. elegans embryoner, larver, og voksne orme. Ultralydbehandling bruges til at forberede orm homogenater og efterfølgende til at udtrække lipider fra prøven.
Protokol til ultralydlipidekstraktion fra C. elegans
Optø C. elegans pellet på is og resuspend med 0,5 ml ultravand. 
Sonicate C. elegans prøver i 1,5 ml reagensglas, samtidig med at prøverne kontinuerligt på is.
Sonikering kan udføres ved hjælp af en sonde-ultralydstor som f.eks. Uf200 ः t, den ultralydsprøveforberedelsesenhed VialTweeter (samtidig sonikering af 10 prøver) eller UIP400MTP (til sonikering af multi-well plader såsom 96-brønd plader). For ultralyd lysis med UP200Ht bruge mikro-tip S26d2. Forindstillet ultralyd cyklus mode i den digitale menu. Indstil amplitude til 10% og sonikering cyklus tilstand af 2 sek impulser på 20 cyklusser med en pause på 30 sek. mellem hver ultralyd pulsering brast.
Overfør supernatanterne til glasrør med skruedæksel. 
Folchekstraktion udføres ved at tilsætte 1 ml ultravand til hvert glasrør efterfulgt af tilsætning af 6 ml chloroform/methanol (forholdet = 2:1) til hvert glasrør.
Vortex hvert glasrør i 30 sek i 4 gange. 
Centrifuge rørene ved 1.258 x g i 15 min (Eppendorf, 5810 R) for yderligere at forbedre faseadskillelsen. 
Overfør den nederste hydrofobiske fraktion til et rent glasrør med et glas Pasteur pipette. 
Tør den nederste hydrofobiske fraktion under kvælstofstrømmen i en nitrogenfordamper. 
Den tørrede pellet opbevares i en -80 °C fryser indtil brug.

Ultralyd forberedelse af Worm Lysates

Orm lysat: L4 fase orme blev høstet og vasket tre gange med M9 buffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂Po₄, 85,56 mM NaCl, og 0,87 mM MgSO₄) for at fjerne alle bakterier. Efter fjernelse så meget som muligt af M9 buffer, orme blev resuspended i lysis buffer: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphat β-glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 5 mM natriumpyrofosphat, 0,2 mM phenylmethanesulfonylfluorid og proteasehæmmer. Orme blev frosset i flydende nitrogen og optøet ved 37 °C i tre gange, så orme blev sonikeret på tøris med en ultralyd VialTweeter enhed til samtidig forberedelse af 10 prøverør. Sonikering blev udført ved 50% amplitude i 10 cyklusser af 2 sek. med 30 sek pause mellem sonikering brister. Derefter blev prøverne centrifugeret ved 12000 omdrejninger i minuttet ved 4°C i 15 min. Supernatanten blev indsamlet og opbevaret ved -70°C. En aliquot blev brugt til protein kvantificering af Bradford assay.
Bestemmelse af total glutathion, GSH og GSSG: Til glutathion kvantificering, lysater og bestemmelse blev foretaget samme dag. Glukose-fodret og kontrol L4 larver blev høstet og vasket med M9 buffer tre gange. Efter at have fjernet så meget som muligt af M9 buffer, orme blev resuspenderet i iskold metaphosphoric syre (5% w / v), så orme blev sonikeret i is med en ultralyd VialTweeter på 50% amplitude i ti sonication cykler på 2 sek. med 30 sek. pause mellem hver cyklus. Bagefter centrifugeret ved 12000 rpm ved 4 ̊C i 15 min.
(jf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Prøve Prep før immunudfald og vestlige Blotting

Kort sagt, for embryonale ekstrakter, C. elegans L1 larver blev dyrket i store flydende S-medium kulturer til voksenalderen. Embryoner blev indsamlet ved hjælp af standard blegemiddelmetoden og suspenderet i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail og 1􏰅 Phosphatase Inhibitor Cocktail I og II), hurtigt frosset i flydende nitrogen og lyset af ultralydcelleafbrydelse ved hjælp af en ultralydsfremmer med mikrotip som f.eks. Uf200 ः t med S26d2 for 10 impulser over 10 s ved 30% amplitude. Hvis der skal fremstilles et større antal prøver, skal ultralydsprøverne VialTweeter eller MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP til brøndplader anbefales. Efter sonikering blev ekstrakter forklaret ved centrifugering ved 30.000 g i 20 min ved 4°C. Det prædaftalte ekstrakt (300μg totalprotein) blev inkuberet med 40 μ􏰂g anti-CDC-25,1 affinitetsrens renset antistof (denne undersøgelse) på tværs af protein A-agarose, eller som kontrol blev der anvendt en tilsvarende mængde kaninimmunoglobulin (Ig)G på tværs af proteinet A-agarose i et samlet volumen på 200 μl lysisbuffer indeholdende 1% NP-40, hvis medtagelse reducerede den ikke-specifikke binding af proteiner til matrixen. Prøverne blev roteret i 1 time ved 4°C, perlerne blev vasket tre gange med lysisbuffer og eluteret med 30μl glycin/HCl og 200 mM NaCl, pH 2.2. Efter immunudfældning blev eluatter fortyndet i 30μ􏰂l af SDS-prøvebufferen, opvarmet til 95°C i 4 min. og typisk 3% af det samlede beløb for input og 30% for eluates blev anvendt på SDS-PAGE efterfulgt af vestlige blotting med anti-CDC-25,1 (1:400), anti-LIN-23 (1:: 750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) eller anti-􏰁β-actin (1:2000) antistoffer. Hvis ekstrakter ikke blev vaccineret, blev den samme mængde samlet protein fra disse ekstrakter resuspenderet i SDS-prøvebufferen, opvarmet til 95°C og derefter direkte anvendt på SDS-PAGE og analyseret ved western blotting. (jf. Segref et al. 2020)

Ultralydlysis under Prescise Temperaturkontrol

Den præcise og pålidelige temperaturkontrol er afgørende ved håndtering af biologiske prøver. Høje temperaturer indleder termisk induceret proteinforringelse i prøver.
Som alle mekaniske prøve forberedelse teknikker, sonikering skaber varme. Prøverne kan dog kontrolleres godt, når vialTweeter anvendes. Vi præsenterer dig forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen af dine prøver, mens du forbereder dem med VialTweeter og VialPress til analyse.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med en intelligent software og en justerbar temperatursensor. Sæt temperatursensoren i UP200St, og sæt spidsen af temperaturføleren i et af prøverørene. Via digital farvet touch-display kan du i menuen i UP200St angive et specifikt temperaturområde til din prøvesoning. Ultralydsonicatoren stopper automatisk, når max temperaturen er nået, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er nede på den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Så starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. VialTweeter-blokken kan afkøles på forhånd. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotrode uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også afkøles på forhånd.
3. Brug tøris til afkøling under sonikering. Brug en lavvandet bakke fyldt med tøris og læg VialTweeter på tørisen, så varmen hurtigt kan sprede sig.

Find den optimale ultralydscellefor disruptor til din Lysis-applikation

Hielscher Ultrasonics er mangeårig erfaren producent af højtydende ultralydscelleforstyrrende stoffer og homogenisatorer til laboratorier, bænk-top og industrielle skalasystemer. Din bakterielle cellekultur størrelse, din forskning eller produktion mål og mængden af celle til at behandle i timen eller dagen er afgørende faktorer for at finde den rigtige ultralydcelle disruptor til din ansøgning.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til samtidig sonikering af multiprøver (op til 10 hætteglas) samt masseprøver (dvs. microtiter plader / 96-brønd plader), den klassiske sonde-type lab ultrasonicator med forskellige effektniveauer fra 50 til 400 watt til fuldt industrielle ultralyd processorer med op til 16.000watts per enhed for kommerciel celle forstyrrelser og protein ekstraktion i stor produktion. Alle Hielscher ultralydsenheder er bygget til 24/7/365 drift under fuld belastning. Robusthed og pålidelighed er centrale funktioner i vores ultralydsenheder.
Alle digitale ultralydhomogenisatorer er udstyret med smart software, farvet touch display og automatisk data protocolling, som gør ultralydsenheden til et praktisk arbejdsværktøj i laboratorie- og produktionsfaciliteter.
Lad os vide, hvilken slags celler, hvilket volumen, med hvilken frekvens og med hvilket mål du har til at behandle dine biologiske prøver. Vi vil anbefale dig den mest egnede ultralydscelle disruptor til dine proceskrav.

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet af vores ultralydsystemer fra kompakte håndholdte homogenisatorer og MultiSample Ultrasonicators til industrielle ultralydsprocessorer til kommercielle applikationer: