Ultralydsbaseret præparation af C. Elegans-prøver

C. elegans, en nematode, er en meget anvendt modelorganisme inden for biologi. Prøvepræparation før analyse kræver lyse, protein- og lipidekstraktion samt RNA-fragmentering, som kan udføres pålideligt ved sonikering. Ultralydscelledisruptorer er pålidelige, avancerede og brugervenlige apparater til hurtig præparation af C. elegans-prøver.

Ultralydsbaseret præparation af C. elegans-prøver

Caenorhabditis elegans er rundorme, som anvendes i vid udstrækning i forskningslaboratorier til at undersøge genomik, udviklingsbiologi og sygdomme. Mange gener i C. elegans’ genom har funktionelle modstykker hos mennesker. Nematoden er dermed en yderst nyttig model for sygdomme hos mennesker. Andre fordele, der bidrager til den udbredte anvendelse af C. elegans, er den nemme og billige dyrkning på plader med bakterier (f.eks. E. coli), dens gennemsigtighed, den nemme håndtering samt muligheden for at fryse og opbevare ormene i længere tid.
Protein- og lipidanalyse er rutineprocedurer i laboratorier, og ultralydsbaseret prøvepræparation er den etablerede metode til at lysere C. elegans-nematoder på alle udviklingsstadier (dvs. embryoner, larver L1-L4 og voksne). Da C. elegans også anvendes som proteinekspressionssystem til at overudtrykke specifikke proteiner, kræves der en pålidelig, reproducerbar metode til lyse og proteinekstraktion, som giver et højt proteinudbytte. Systemer til ultralydscelledisruption og ekstraktion fås som homogenisatorer med sonde og som ultralydsapparater til flere prøver. Hielscher Ultrasonics har den ideelle ultralydscelledisruptor til din laboratorieprocedure og tilbyder nem prøvepræparation til alle prøvestørrelser og prøveantal.

Ultralydsprotokoller til disruption og lyse af C. Elegans

Ultralydshomogenisering og lyse af C. elegans samt den efterfølgende protein- og lipidekstraktion kan udføres med forskellige procedurer og forskellige homogeniserings- og lysebuffere osv. Alle lyseprotokoller har det til fælles, at prøverne skal holdes på is hele tiden for at forhindre proteinnedbrydning. Nedenfor præsenterer vi nogle pålidelige og hurtige ultralydsprotokoller til lyse og ekstraktion til præparation af C. elegans-prøver af høj kvalitet, der indeholder protein eller lipider.

Fordele ved ultralydslyse af C. elegans

• pålidelig
• reproducerbar
• præcis temperaturstyring
• pålidelig processtyring
• skånsom metode
• nem at anvende
• sikker

Ultralydsbaseret proteinekstraktion fra C. elegans-prøver

Ultralydslyse og proteinekstraktion af C. elegans-orme kan udføres med forskellige protokoller. Nedenfor præsenterer vi nogle få pålidelige og hurtige lyseprotokoller, der giver reproducerbare resultater ved proteinekstraktion.

Hurtig præparation af cytosolisk ekstrakt fra C. elegans-orme ved sonikering

Med følgende protokol kan du præparere C. elegans-lysater på mindre end 30 minutter.
Indsamling af C. elegans
Overfør de ønskede C. elegans-orme til et 1,5ml rør med fosfatbufferet saltvand (PBS), eller vask dem af en plade med 1,5ml PBS. Centrifugér i 1min ved 2000rpm for at danne en pellet. Hold prøverne på is hele tiden.
Vask derefter ormene to gange med PBS.
Vask derefter ormene to gange med ddH₂O.
Resuspendér ormene i mindst 500ul homogeniseringsbuffer (HB). Ormeprøverne er nu klar til ultralydslyse.
For at opnå højere kvalitet af proteinekstraktet kan du eventuelt reducere bakteriel kontaminering ved at vaske ormene i 5min hver gang i henholdsvis PBS og sterilt, ultrarent vand (ddH₂O) eller udføre sukroseflotation. Hold ormeprøverne på is hele tiden.

Protokol til ultralydslyse af C. elegans

• Sørg for at klargøre ultralydsapparatet på forhånd, så ultralydshomogenisatoren er klar til brug (sonde monteret, sonikeringsprogram forudindstillet). 

Hvis dit ultralydsapparat er monteret på et stativ, skal du placere isbadet med prøverørene under ultralydssonden og føre ultralydssonden ind i 1,5ml røret.

• Ved lyse af C. elegans med UP200St eller UP200Ht bør ultralydsbehandlingen udføres med en mikrospids (f.eks. 2mm sonden S26d2; se billedet til venstre) ved 40% amplitude i 1sec med 30sec pauser imellem. 5 sonikeringscyklusser på hver 1 sekund med 30sec pauser er ideelle til lyse af C. elegans. Hvis du udfører lysen for første gang, kan du kontrollere lysens forløb i små alikvoter af prøven efter hver puls ved hjælp af et mikroskop.
• Lysen er gennemført, når ormene er disrupteret. For kraftig sonikering medfører nedbrydning af cellekernerne og viser sig ved, at prøven bliver viskøs eller skummer. Brug om nødvendigt flere pulser for at forhindre nedbrydning af prøven. Forlæng ikke varigheden af hver ultralydspulscyklus, så du opnår proteinekstrakter af høj kvalitet.
• Klar cellelysatet ved at centrifugere de ultralydslyserede orme ved 14.000rpm i 10min ved 4ºC.
• Overfør derefter supernatanten til et nyt rør, og klargør den til immunpræcipitation eller andre assays.

Bemærkning om homogeniseringsbuffer: Tilbered homogeniseringsbufferen til ovenstående ultralydslyseprotokol som følger:

Lyse af C. elegans med høj prøvegennemstrømning i 96-brøndsplader med pladesonikatoren UIP400MTP

Lyse af C. elegans (voksne nematoder)
UIP400MTP 80% amplitude, 20 cyklusser (hver sonikeringscyklus: 30 sec TIL, 30 sec FRA)
Lysebuffer:

• Mulighed 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Mulighed 2) til co-immunpræcipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (komplet proteinasehæmmercocktail)

DNA-fragmentering med høj prøvegennemstrømning
C. elegans (voksne nematoder) DNA 200–300bp: pladesonikator UIP400MTP – indstil 80% amplitude, 30 pulser – hver med 30sec til, 30sec fra

Pladesonikatoren UIP400MTP til prøvepræparation med høj prøvegennemstrømning sonikerer prøver ensartet i multibrøndsplader, mikrotiterplader og 96-brøndsplader

Ultralydslyse af C. elegans til kvantitative affinitetsoprensningsassays

C. elegans-embryoner (∼2 millioner pr. replikat) blev høstet friske i biologiske triplikater ved behandling af unge ægbærende hermafroditter med blegemiddel og sonikeret på is (cyklus: 0,5 s, amplitude: 40–45%, 5 pulser/session, 5 sessioner, interval mellem sessionerne: 30 s; ultralydsprocessoren UP200S med mikrospids S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) i lysebuffer (samlet volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteasehæmmerblanding, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Efter sonikering blev Nonidet P-40 Substitute tilsat op til 1%, og lysaterne blev inkuberet med ende-over-ende-rotation ved 4°C i 30 min, efterfulgt af centrifugering ved 20.000 × g i 20 min ved 4°C. Det klarede lysat blev derefter aspireret uden at forstyrre det øverste lipidlag og fordelt i to halvdele på henholdsvis anti-GFP-agarosekuglerne og de blokerede kontrolkugler (40–50 μl). Efter ende-over-ende-rotation ved 4°C i 60–90 min blev kuglerne vasket én gang med lysebuffer indeholdende 0,1% Nonidet P-40 Substitute, efterfulgt af to vaske i enten buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller begge. Ved GFP:MBK-2-pull-downs blev der udført to separate forsøg med forskellige vaskebetingelser. Proteiner blev elueret ved orbital omrystning i 50 μl 6 m urinstof/2 M thiourinstof ved stuetemperatur. Ved MBK-1::GFP-pull-down-forsøgene blev proteiner elueret to gange ved omrystning i 50μl 8 m guanidiniumchlorid ved 90°C, efterfulgt af ethanolpræcipitation. De eluerede proteinprøver blev derefter fordøjet i opløsning.
(jf. Chen et al., 2016)

Ultralydshomogenisering og lyse af orme

Til proceduren for lyse og proteinekstraktion af C.elegans blev 30.000 nematoder på det relevante stadium indsamlet pr. prøve og vasket i iskold S-basal, koncentreret ved centrifugering ved 1500 rpm i 2 min., vasket seks gange med iskold S-basal for at fjerne resterende bakterier og derefter opbevaret på is, indtil de skulle bruges. Til proteinekstraktion fik ægbærende voksne orme lov til at danne en kompakt pellet efter den sidste vask med S-basal. Ormepellets blev derefter resuspenderet i 1 ml iskold ekstraktionsbuffer [20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteasehæmmere (Sigma P2714)] og behandlet med det samme.
∼30.000 ægbærende voksne orme (svarende til ∼100 mg vådvægt) blev sonikeret på is med et ultralydsapparat med sonde (f.eks. UP50H med mikrospids MS2) ved 40% amplitude i 10 cyklusser med 3 sec til og 30 sec fra i 1 ml iskold ekstraktionsbuffer. (jf. Baskharan et al. 2012)

Ultralydsbaseret lipidekstraktion fra C. elegans

Inden for lipidomik, en gren af metabolomikken, karakteriseres og analyseres biologiske systemers samlede lipidindhold. C. elegans anvendes i vid udstrækning inden for lipidomik til at undersøge samspillet mellem metaboliske lipider og deres virkninger på sundhed og levetid.
Ultralydslyse og ekstraktion anvendes til at frigøre lipider såsom sfingolipider fra C. elegans-embryoner, larver og voksne orme. Ultralydsbehandling anvendes til at præparere ormehomogenater og efterfølgende til at ekstrahere lipiderne fra prøven.
Protokol til ultralydsbaseret lipidekstraktion fra C. elegans
Optø C. elegans-pelleten på is, og resuspendér med 0,5 ml ultrawater. Sonikér C. elegans-prøverne i 1,5mL reagensglas, mens prøverne holdes på is hele tiden.
Sonikering kan udføres med et ultralydsapparat med sonde såsom UP200Ht, den ultralydsbaserede prøvepræparationsenhed VialTweeter (samtidig sonikering af 10 prøver) eller UIP400MTP (til sonikering af multibrøndsplader såsom 96-brøndsplader). Til ultralydslyse med UP200Ht anvendes mikrospidsen S26d2. Forudindstil ultralydscyklustilstanden i den digitale menu. Indstil amplituden til 10% og sonikeringscyklustilstanden til 20 cyklusser med pulser på 2 sec og en pause på 30 sec. mellem hvert ultralydspulsudbrud.
Overfør supernatanterne til glasrør med skruelåg. Udfør Folch-ekstraktion ved at tilsætte 1 ml ultrawater til hvert glasrør, efterfulgt af tilsætning af 6 ml chloroform/methanol-blanding (forhold = 2:1) til hvert glasrør.
Vortexbland hvert glasrør i 30 sec 4 gange. Centrifugér rørene ved 1.258 x g i 15 min (Eppendorf, 5810 R) for yderligere at forbedre faseadskillelsen. Overfør den nederste hydrofobe fraktion til et rent glasrør med en Pasteurpipette af glas. Tør den nederste hydrofobe fraktion under en nitrogenstrøm i en nitrogeninddamper. Opbevar den tørrede pellet i en fryser ved -80 °C indtil brug. 


Ultralydsbaseret præparation af ormelysater

Ormelysat: Orme på L4-stadiet blev høstet og vasket tre gange med M9-buffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl og 0,87 mM MgSO₄) for at fjerne alle bakterier. Efter fjernelse af så meget M9-buffer som muligt blev ormene resuspenderet i lysebuffer: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glycerolfosfat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,2 mM phenylmethansulfonylfluorid og proteasehæmmer. Ormene blev frosset i flydende nitrogen og optøet ved 37°C tre gange, hvorefter ormene blev sonikeret på tøris med ultralydsenheden VialTweeter til samtidig præparation af 10 prøverør. Sonikeringen blev udført ved 50% amplitude i 10 cyklusser på 2 sec. med 30 sec pause mellem sonikeringspulserne. Derefter blev prøverne centrifugeret ved 12.000 rpm ved 4°C i 15 min. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -70°C. En alikvot blev anvendt til proteinkvantificering med Bradford-assay.
Bestemmelse af total glutathion, GSH og GSSG: Til glutathionkvantificering blev lysaterne fremstillet og bestemmelsen udført samme dag. Glukosefodrede L4-larver og kontrollarver blev høstet og vasket med M9-buffer tre gange. Efter fjernelse af så meget M9-buffer som muligt blev ormene resuspenderet i iskold metafosforsyre (5% w/v), hvorefter ormene blev sonikeret i is med ultralydsenheden VialTweeter ved 50% amplitude i ti sonikeringscyklusser på 2 sec. med 30 sec. pause mellem hver cyklus. Derefter blev prøverne centrifugeret ved 12.000 rpm ved 4 ̊C i 15 min.
(jf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Prøvepræparation af C. elegans før immunpræcipitation og Western blotting

Kort fortalt blev C. elegans-L1-larver til fremstilling af embryonale ekstrakter dyrket til voksenstadiet i flydende S-medium i storskala. Embryoner blev indsamlet med standardmetoden med blegemiddel og suspenderet i lysebuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteasehæmmercocktail og 1􏰅 fosfatasehæmmercocktail I og II), hurtigt frosset i flydende nitrogen og lyseret ved ultralydscelledisruption med et ultralydsapparat med mikrospids såsom UP200Ht med S26d2 med 10 pulser over 10 s ved 30% amplitude. Hvis et større antal prøver skal præpareres, anbefales den ultralydsbaserede VialTweeter eller ultralydsapparatet UIP400MTP til flere prøver i brøndplader. Efter sonikering blev ekstrakterne forklaret ved centrifugering ved 30.000g i 20 min ved 4°C. Det forklarede ekstrakt (300µg totalprotein) blev inkuberet med 40µ􏰂g affinitetsoprenset anti-CDC-25.1-antistof (denne undersøgelse), som var krydsbundet til protein A-agarose, eller som kontrol blev en tilsvarende mængde kaninimmunoglobulin (Ig)G krydsbundet til protein A-agarose anvendt i et samlet volumen på 200µl lysebuffer indeholdende 1% NP-40, hvis tilsætning reducerede uspecifik binding af proteiner til matrixen. Prøverne blev roteret i 1 h ved 4°C, kuglerne blev vasket tre gange med lysebuffer og elueret med 30µl glycin/HCl og 200 mM NaCl, pH 2,2. Efter immunpræcipitation blev eluaterne fortyndet i 30µ􏰂l SDS-prøvebuffer, opvarmet til 95°C i 4 min, og typisk blev 3% af den samlede mængde som input og 30% af eluaterne påført SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting med anti-CDC-25.1- (1:400), anti-LIN-23- (1:750), anti-ubiquitin- (1:1000), anti-GSK3􏰁- (1:500) eller anti-􏰁β-actin-antistoffer (1:2000). Når ekstrakter ikke blev underkastet immunpræcipitation, blev den samme mængde totalprotein fra disse ekstrakter resuspenderet i SDS-prøvebuffer, opvarmet til 95°C og derefter påført direkte på SDS-PAGE og analyseret ved Western blotting. (jf. Segref et al. 2020)

Ultralydslyse med præcis temperaturstyring

Præcis og pålidelig temperaturstyring er afgørende ved håndtering af biologiske prøver. Høje temperaturer igangsætter termisk induceret proteinnedbrydning i prøver.
Som alle mekaniske prøvepræparationsteknikker udvikler sonikering varme. Prøvernes temperatur kan dog styres godt ved brug af VialTweeter. Vi præsenterer forskellige muligheder for at overvåge og styre temperaturen i dine prøver, mens du præparerer dem til analyse med VialTweeter og VialPress.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydsprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med intelligent software og en tilslutningsbar temperatursensor. Tilslut temperatursensoren til UP200St, og før temperatursensorens spids ind i et af prøverørene. Via den digitale farveberøringsskærm kan du i menuen på UP200St indstille et bestemt temperaturinterval for sonikeringen af dine prøver. Ultralydsapparatet stopper automatisk, når den maksimale temperatur er nået, og holder pause, indtil prøvetemperaturen er faldet til den nedre værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. Blokken i VialTweeter kan forkøles. Sæt blokken i VialTweeter (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titanblokken, hvilket hjælper med at forsinke temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også forkøles.
3. Brug tøris til køling under sonikering. Brug en lav bakke fyldt med tøris, og placér VialTweeter på tørisen, så varmen hurtigt kan ledes væk.

Find den optimale ultralydscelledisruptor til din lyseapplikation

Hielscher Ultrasonics er en producent med mange års erfaring inden for højtydende ultralydscelledisruptorer og homogenisatorer til laboratorier samt systemer i bord- og industriskala. Størrelsen af din bakteriecellekultur, dit forsknings- eller produktionsmål og det cellevolumen, der skal behandles pr. time eller dag, er væsentlige faktorer for at finde den rette ultralydscelledisruptor til din applikation.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til samtidig sonikering af flere prøver (op til 10 hætteglas) samt store antal prøver (dvs. mikrotiterplader / 96-brøndsplader), fra det klassiske laboratorieultralydsapparat med sonde med forskellige effektniveauer fra 50 til 400 watt til fuldt industrielle ultralydsprocessorer med op til 16.000watt pr. enhed til kommerciel celledisruption og proteinekstraktion i storskalaproduktion. Alle ultralydsapparater fra Hielscher er bygget til drift 24/7/365 under fuld belastning. Robusthed og pålidelighed er centrale egenskaber ved vores ultralydsapparater.
Alle digitale ultralydshomogenisatorer er udstyret med intelligent software, farveberøringsskærm og automatisk datalogning, som gør ultralydsapparatet til et praktisk arbejdsredskab i laboratorier og produktionsanlæg.
Fortæl os, hvilken type celler, hvilket volumen, hvor ofte og med hvilket formål du skal behandle dine biologiske prøver. Vi anbefaler den bedst egnede ultralydscelledisruptor til dine proceskrav.

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssystemer, fra kompakte håndholdte homogenisatorer og ultralydsapparater til flere prøver til industrielle ultralydsprocessorer til kommercielle applikationer: