Ultralydsforberedelse af C. Elegans prøver

C. elegans, en nematodeorm, er en meget brugt modelorganisme i biologien. Prøveforberedelse før analyse kræver lysis, protein- og lipidekstraktion samt RNA-fragmentering, som pålideligt kan udføres via sonikering. Ultralydscelleforstyrrere er pålidelige, sofistikerede og brugervenlige enheder til hurtig forberedelse af C. elegans-prøver.

Ultralydsforberedelse af C. Elegans prøver

C. elegans er rundorm, som er meget udbredt i forskningslaboratorier til at undersøge genomik, udviklingsbiologi og sygdomme. Mange gener i genomet hos C. elegans har funktionelle modstykker hos mennesker. Derved er nematodeormen en yderst nyttig model for menneskelige sygdomme. Andre fordele ved den brede anvendelse af C. elegans er dens nemme og billige dyrkning på plader, der indeholder bakterier (f.eks. E. coli), dens gennemsigtighed, bekvem håndtering samt muligheden for at fryse og opbevare ormene i længere tid.
Protein- og lipidanalyse er regelmæssige procedurer i laboratorier, og ultralydsprøveforberedelse er den etablerede metode til at lyse C. elegans nematoder i alle udviklingsstadier (dvs. embryoner, larver L1-L4, voksne). Da C. elegans også bruges som proteinekspressionssystem til at overudtrykke målrettede proteiner, kræves en pålidelig, reproducerbar lysis- og proteinekstraktionsmetode, som giver høje proteinudbytter. Ultralydscelleafbrydelses- og ekstraktionssystemer er tilgængelige som homogenisatorer af sondetype og som ultralydapparater med flere prøver. Hielscher Ultrasonics tager højde for bekvem prøveforberedelse og alle slags prøvestørrelser og har den ideelle ultralydscelleforstyrrer til din laboratorieprocedure.

Ultralydsprotokoller til C. Elegans Disruption og Lysis

Ultralydshomogenisering og lysis af C. elegans og den efterfølgende protein- og lipidekstraktion kan udføres ved hjælp af forskellige procedurer ved hjælp af forskellige homogeniserings- og lysbuffere osv. Alle lysisprotokoller har det til fælles, at prøverne kontinuerligt skal holdes på is for at forhindre proteinnedbrydning. Nedenfor præsenterer vi dig nogle pålidelige og hurtige ultralydslys- og ekstraktionsprotokoller til fremstilling af protein- eller lipidholdige C. elegans-prøver af høj kvalitet.

Fordele ved ultralyd C. elegans Lysis

• Pålidelig
• Reproducerbare
• præcist temperaturstyret
• Pålidelig processtyring
• skånsom metode
• let at påføre
• Sikker

Ultralydsproteinekstraktion fra C. elegans prøver

Ultralydslyse og proteinekstraktion af C. elegans orme kan udføres ved hjælp af forskellige protokoller. Nedenfor præsenterer vi dig et par pålidelige og hurtige lyseprotokoller til reproducerbare proteinekstraktionsresultater.

Hurtig præparation af cytosolisk ekstrakt fra C. elegans orme ved sonikering

Med følgende protokol kan du tilberede C. elegans lysater på mindre end 30 minutter.
Samling af C. elegans
Pluk de ønskede C. elegans-orme i et 1,5 ml rør fosfatbufret saltvand (PBS) eller vask dem fra en tallerken med 1,5 ml PBS. Centrifuger ved 1 minut ved 2000 rpm til pille. Opbevar altid prøverne på is.
Vask derefter ormene to gange med PBS.
Vask derefter ormene to gange med ddH₂O.
Resuspender ormene i mindst 500 ul homogeniseringsbuffer (HB). Ormeprøverne er nu klar til ultralydslys.
For højere proteinekstraktkvalitet vil du måske reducere bakteriel kontaminering ved at vaske ormene i 5 minutter hver i PBS og sterilt, ultrarent vand (ddH₂O) eller udføre saccharoseflydning. Opbevar ormeprøverne kontinuerligt på is.

Ultralyd C. elegans Lysis protokol

• Sørg for, at du forbereder ultralydsapparatet på forhånd, så ultralydshomogenisatoren er klar til brug (sonde monteret, sondeprogram forudindstillet).

Hvis din ultralydsapparat er stativmonteret, skal du placere isbadet med dine sample rør under ultralydssonden og indsæt ultralydssonden i 1,5 ml røret.

• For C. elegans lysis med UP200St eller UP200Ht skal ultralydbehandling udføres ved hjælp af en mikrotip (f.eks. 2 mm sonde S26d2; se billedet til venstre) ved 40% amplitude i 1 sek med 30 sek pauser imellem. 5 sonikeringscyklusser for hvert 1 sekund med 30 sek pauser er ideelle til C. elegans lysis. Hvis du udfører lysen for første gang, kan du kontrollere lyseringsforløbet i små alikvoter af prøven efter hver puls ved hjælp af et mikroskop.
• Lysen afsluttes med succes, når ormene forstyrres. Oversonikering resulterer i brud på kerner og bliver synlig, når prøven bliver tyktflydende eller skummer. For at forhindre prøvenedbrydning skal du bruge flere bælgfrugter, hvis det er nødvendigt. Forøg ikke tiden for hver ultralydspulscyklus for at få proteinekstrakter af høj kvalitet.
• Klar cellelysat ved at centrifugere de ultralydlyserede orme ved 14.000 rpm i 10 minutter ved 4ºC.
• Overfør derefter supernatanten til et nyt rør og forbered til immunudfældning eller andre analyser.

Bemærkning til homogeniseringsbuffer: Forbered homogeniseringsbufferen til ultralydslyseprotokollen ovenfor som følger:

Lysis med høj gennemstrømning af C. elegans i 96-brønds plader ved hjælp af UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (voksne nematoder)
UIP400MTP 80% amplitude, 20 cyklusser (hver sonikeringscyklus: 30 sek ON, 30 sec OFF)
Lysis buffer:

• Mulighed 1) 4 % SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Mulighed 2) for Co-immunoprecipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (komplet proteinasehæmmercocktail)

DNA-fragmentering med høj kapacitet
C. elegans (voksne nematoder) DNA 200-300bp: UIP400MTP plade soniker – sæt 80% amplitude, 30 impulser – hver 30 sek. tændt, 30 sek. slukket

UIP400MTP Plate Sonicator til prøveforberedelse med høj kapacitet sonikerer ensartet prøver i multi-brønd, mikrotiterplader og 96-brønds plader

Ultralydslyse af C. elegans til kvantitative affinitetsoprensningsanalyser

C. elegans-embryoner (∼2 millioner pr. replikat) blev friskhøstet i biologisk tredobbelt ved blegning af unge drægtige hermafroditter og sonikeret på is (cyklus: 0,5 s, amplitude: 40-45%, 5 slag/session, 5 sessioner, interval mellem sessioner: 30 s; UP200S ultralydsprocessor med mikrospids S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) i lysisbuffer (samlet volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteasehæmmerblanding, 0,1% Nonidet P-40-erstatning). Efter sonikering blev Nonidet P-40-erstatning tilsat op til 1%, og lysaterne blev inkuberet med hoved over halerotation ved 4 ° C i 30 minutter, efterfulgt af centrifugering ved 20.000 × g i 20 minutter ved 4 ° C. Clearet lysat blev derefter aspireret uden at forstyrre det øverste lipidlag og delt halvt i enten anti-GFP-agaroseperlerne eller de blokerede kontrolperler (40-50 μl). Efter rotation hoved over hale ved 4 °C i 60-90 minutter blev perlerne vasket én gang med lysisbuffer indeholdende 0,1 % Nonidet P-40 Substitute, efterfulgt af to gange vask i enten buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller begge. For GFP:MBK-2 pull-downs blev der udført to separate eksperimenter under forskellige vaskebetingelser. Proteiner blev elueret ved orbital rystning i 50 μl 6 m urinstof/2 M thiourea ved stuetemperatur. Til MBK-1::GFP pull-down-eksperimenterne blev proteiner elueret to gange ved at ryste i 50 μl 8 m guanidiniumchlorid ved 90 °C, efterfulgt af ethanoludfældning. Eluerede proteinprøver blev derefter fordøjet i opløsning.
(jf. Chen et al., 2016)

Ultralyd orm homogenisering og lysis

Til C.elegans lysis og proteinekstraktionsprocedure blev 30.000 nemotoder af det relevante trin indsamlet pr. prøve og vasket i iskold S-basal, koncentreret ved centrifugering ved 1500 rpm i 2 min., vasket seks gange med iskold S-basal for at fjerne resterende bakterier og derefter opbevaret på is, indtil den var klar til brug. Til proteinekstraktion fik gravid-voksne orme lov til at danne en kompakt pellet efter den sidste S-basalvask. Ormepiller blev derefter resuspenderet i 1 ml iskold ekstraktionsbuffer [20 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteasehæmmere (Sigma P2714)] og behandlet med det samme.
∼30.000 gravide-voksne orme (svarende til ∼100 mg vådvægt) blev sonikeret på is ved hjælp af en sonde-type ultralydsapparat (f.eks. UP50H med mikrotip MS2) ved 40% amplitude i 10 cyklusser på 3 sek på, 30 sek slukket, i 1 ml iskold ekstraktionsbuffer. (jf. Baskharan et al. 2012)

Ultralyd lipidekstraktion fra C. elegans

I lipidomics, en gren af metabolomics, karakteriseres og analyseres lipidkomplementet af biologiske systemer. C. elegans er meget udbredt i lipidomics til at undersøge interaktionen mellem metaboliske lipider og deres virkninger på sundhed og levetid.
Ultralydslyse og ekstraktion bruges til at frigive lipider såsom sfingolipider fra C. elegans embryoner, larver og voksne orme. Ultralydbehandling bruges til at fremstille ormehomogenater og efterfølgende til at ekstrahere lipiderne fra prøven.
Protokol til ultralydslipidekstraktion fra C. elegans
Optø C. elegans-pelleten på is og opløs med 0,5 ml ultravand. 
Sonikere C. elegans-prøverne i 1,5 ml reagensglas, mens prøverne holdes kontinuerligt på is.
Sonikering kan udføres ved hjælp af en sonde-ultralydsmaskine, såsom UP200Ht, ultralydsprøveforberedelsesenheden VialTweeter (samtidig sonikering af 10 prøver) eller UIP400MTP (til sonikering af multi-brøndplader såsom 96-brønds plader). Til ultralydslysering med UP200Ht skal du bruge mikrospidsen S26d2. Forudindstil ultralydscyklustilstanden i den digitale menu. Indstil amplitude til 10% og sonikeringscyklustilstand på 2 sek. pulser på 20 cyklusser med en pause på 30 sek. mellem hvert ultralydspulseringsudbrud.
Overfør supernatanterne til glasrør med skruelåg. 
Udfør folch-ekstraktion ved at tilsætte 1 ml ultravand til hvert glasrør, efterfulgt af tilsætning af 6 ml chloroform/methanol (forhold = 2:1) blanding til hvert glasrør.
Hvirvel hvert glasrør i 30 sek. i 4 gange. 
Centrifuger rørene ved 1.258 x g i 15 minutter (Eppendorf, 5810 R) for yderligere at forbedre faseseparationen. 
Overfør den nederste hydrofobe fraktion til et rent glasrør med en Pasteur-glaspipette. 
Tør den nedre hydrofobe fraktion under nitrogenstrømmen i en nitrogenfordamper. 
Opbevar den tørrede pille i en fryser på -80 °C indtil brug.

Ultralydspræparat af ormelysater

Ormelysat: Orme i L4-stadiet blev høstet og vasket tre gange med M9-buffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl og 0,87 mM MgSO₄) for at fjerne alle bakterier. Efter at have fjernet så meget som muligt af M9-bufferen blev orme resuspenderet i lysisbuffer: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphat β-glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 5 mM natriumpyrophosphat, 0,2 mM phenylmethansulfonylfluorid og proteasehæmmer. Orme blev frosset i flydende nitrogen og optøet ved 37 ° C tre gange, derefter blev orme sonikeret på tøris med en ultralyd VialTweeter-enhed til samtidig forberedelse af 10 prøverør. Sonikering blev udført ved 50% amplitude i 10 cyklusser på 2 sek. med 30 sek pause mellem sonikeringsudbruddene. Derefter blev prøverne centrifugeret ved 12000 rpm ved 4°C i 15 min. Supernatanten blev indsamlet og opbevaret ved -70°C. En alikvot blev brugt til proteinkvantificering ved Bradford-analyse.
Bestemmelse af total glutathion, GSH og GSSG: Til glutathionkvantificering blev lysater og bestemmelse foretaget samme dag. Glukosefodrede og kontrollerede L4-larver blev høstet og vasket med M9-buffer tre gange. Efter at have fjernet så meget som muligt af M9-bufferen, blev orme resuspenderet i iskold metaphosphorsyre (5% w / v), derefter blev orme sonikeret i is med en ultralyd VialTweeter ved 50% amplitude i ti sonikeringscyklusser på 2 sek. med 30 sek. pause mellem hver cyklus. Derefter centrifugeres ved 12000 rpm ved 4 ̊C i 15 min.
(jf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Prøveforberedelse før immunudfældning og Western Blotting

Kort sagt, for embryonale ekstrakter blev C. elegans L1-larver dyrket i store flydende S-medium-kulturer til voksenalderen. Embryoner blev indsamlet ved hjælp af standardblegemetoden og suspenderet i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1��� Protease Inhibitor Cocktail og 1 Phosphatase Inhibitor Cocktail I og II), hurtigt frosset i flydende nitrogen og lyseret ved ultralydscelleforstyrrelse ved hjælp af en ultralydsapparat med mikrotip såsom UP200Ht med S26d2 i 10 impulser over 10 s ved 30 % amplitude. Hvis der skal fremstilles et større antal prøver, skal ultralydsscanningen VialTweeter eller MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP til brøndplader anbefales. Efter sonikering blev ekstrakter forhåndsgodkendt ved centrifugering ved 30.000 g i 20 minutter ved 4 °C. Det præ-clearede ekstrakt (300 μg af det samlede protein) blev inkuberet med 40 μ reseptuelle antistoffer (dette studie) krydsbundet til protein A-agarose, eller som kontrol, blev en tilsvarende mængde kaninimmunglobulin (Ig)G tværbundet til protein A-agarose anvendt i et samlet volumen på 200 μl lysisbuffer indeholdende 1 % NP-40, hvis inklusion reducerede uspecifik binding af proteiner til matrixen. Prøverne blev roteret i 1 time ved 4°C, perlerne blev vasket tre gange med lysisbuffer og elueret med 30 μl glycin/HCl og 200 mM NaCl, pH 2,2. Efter immunpræcipitation blev eluater fortyndet i 30 μregulativ sikkerhedsdatabladsbuffer, opvarmet til 95 °C i 4 minutter, og typisk 3 % af totalen for input og 30 % for eluaterne blev påført SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting med anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3-regissat (1:500) eller anti-regissat ≥β-actin (1:2000) antistoffer. Hvor ekstrakter ikke blev udsat for immunudfældning, blev den samme mængde af det samlede protein afledt af disse ekstrakter resuspenderet i SDS-prøvebufferen, opvarmet til 95 °C og derefter direkte påført SDS-PAGE og analyseret ved Western blotting. (jf. Segref et al. 2020)

Ultralydslysis under forudgående temperaturkontrol

Den præcise og pålidelige temperaturkontrol er afgørende ved håndtering af biologiske prøver. Høje temperaturer initierer termisk induceret proteinnedbrydning i prøver.
Som alle mekaniske prøveforberedelsesteknikker skaber sonikering varme. Temperaturen på prøverne kan dog kontrolleres godt, når du bruger VialTweeter. Vi præsenterer dig for forskellige muligheder for at overvåge og kontrollere temperaturen på dine prøver, mens du forbereder dem med VialTweeter og VialPress til analyse.

1. Overvågning af prøvetemperaturen: Ultralydsprocessoren UP200St, som driver VialTweeter, er udstyret med en intelligent software og en tilsluttelig temperatursensor. Sæt temperatursensoren i UP200St, og indsæt spidsen af temperatursensoren i et af sample rør. Via digitalt farvet berøringsdisplay kan du indstille i menuen på UP200St et specifikt temperaturområde for din sample sonikering. Ultralydsapparatet stopper automatisk, når den maksimale temperatur er nået, og holder pause, indtil sample temperaturen er nede til den lavere værdi af den indstillede temperatur ∆. Derefter starter sonikeringen automatisk igen. Denne smarte funktion forhindrer varmeinduceret nedbrydning.
2. VialTweeter-blokken kan forkøles. Sæt VialTweeter-blokken (kun sonotroden uden transducer!) i køleskabet eller fryseren for at forkøle titaniumblokken hjælper med at udskyde temperaturstigningen i prøven. Hvis det er muligt, kan selve prøven også forkøles.
3. Brug tøris til at afkøle under sonikering. Brug en lav bakke fyldt med tøris, og placer VialTweeteren på tørisen, så varmen hurtigt kan forsvinde.

Find den optimale ultralydscelleforstyrrer til din lysisapplikation

Hielscher Ultrasonics er mangeårig erfaren producent af højtydende ultralydscelleforstyrrere og homogenisatorer til laboratorier, bordplade og industrielle skalasystemer. Din bakterielle cellekulturstørrelse, dit forsknings- eller produktionsmål og mængden af celle, der skal behandles pr. time eller dag, er vigtige faktorer for at finde den rigtige ultralydscelleforstyrrer til din applikation.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige løsninger til samtidig sonikering af multiprøver (op til 10 hætteglas) samt masseprøver (dvs. mikrotiterplader / 96-brønds plader), den klassiske sonde-type laboratorie ultralydsapparat med forskellige effektniveauer fra 50 til 400 watt til fuldt industrielle ultralydsprocessorer med op til 16.000 watt pr. enhed til kommerciel celleafbrydelse og proteinekstraktion i stor produktion. Alle Hielscher ultralydapparater er bygget til 24/7/365 drift under fuld belastning. Robusthed og pålidelighed er kernefunktioner i vores ultralydsenheder.
Alle digitale ultralydshomogenisatorer er udstyret med smart software, farvet berøringsdisplay og automatisk dataprotokol, som gør ultralydsenheden til et praktisk arbejdsredskab i laboratorie- og produktionsfaciliteter.
Fortæl os, hvilken slags celler, hvilken volumen, med hvilken frekvens og med hvilket mål du skal behandle dine biologiske prøver. Vi vil anbefale dig den bedst egnede ultralydscelleforstyrrer til dine proceskrav.

Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydssystemer fra kompakte håndholdte homogenisatorer og MultiSample ultralydsapparater til industrielle ultralydsprocessorer til kommercielle applikationer: