Ultralydslyse af bioteknologisk modificerede celler i industriel produktion

Bioteknologisk modificerede bakteriearter såsom E. coli samt genetisk modificerede celletyper fra pattedyr og planter anvendes i vid udstrækning inden for bioteknologi til at udtrykke molekyler. For at frigive disse syntetiserede biomolekyler kræves en pålidelig teknik til celleopløsning. Højtydende ultralydsbehandling er en gennemprøvet metode til effektiv og pålidelig cellelyse – som let kan opskaleres til stor gennemstrømningskapacitet. Hielscher Ultrasonics tilbyder højtydende ultralydsudstyr til effektiv cellelyse med henblik på at producere store mængder biomolekyler af høj kvalitet.

Ekstraktion af molekyler fra cellefabrikker

Til produktion af en bred vifte af biomolekyler kan forskellige modificerede mikroorganismer og planteceller anvendes som mikrobielle cellefabrikker, herunder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana og alger, blandt mange andre. Disse cellefabrikker kan producere proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobrændstoffer og oleokemikalier, som anvendes som fødevarer eller råmaterialer til industrielle anvendelser. Celler, der anvendes som cellefabrikker, dyrkes i lukkede bioreaktorer, hvor de kan opnå høj effektivitet, specificitet og lave energibehov.
For at isolere målmolekylerne fra de bioteknologisk modificerede cellekulturer skal cellerne opløses, så det intracellulære materiale frigives. Celleopløsning med ultralyd er veletableret som en yderst pålidelig og effektiv teknik til celledisintegration og frigivelse af forbindelser.

Mikrobielle cellefabrikker er metabolisk modificerede celler, der anvendes til syntese af forskellige værdifulde forbindelser. Celleopløsning med ultralyd er en effektiv og pålidelig metode til at frigive de værdifulde forbindelser fra cellernes indre.
studie og grafik: ©Villaverde, 2010.

Fordele ved ultralydsapparater til celleopløsning

Som en ikke-termisk, skånsom, men yderst effektiv teknologi anvendes ultralydsapparater til celleopløsning i laboratorier og industrien til at lysere celler og producere ekstrakter af høj kvalitet, som f.eks. anvendes til isolering af molekyler fra cellefabrikker.

Effektultralyd til effektiv opløsning af mikrobielle cellefabrikker

Mekanisme og virkninger ved ultralydsapparater til celleopløsning:
Celleopløsning med ultralyd udnytter ultralydsbølgernes kraft. Ultralydshomogenisatoren / celleopløsningsapparatet er udstyret med en probe (også kaldet en sonotrode) af en titanlegering, som svinger ved en høj frekvens på ca. 20 kHz. Det betyder, at ultralydsproben kobler 20.000 vibrationer pr. sekund ind i den sonikerede væske. Ultralydsbølgerne, der kobles ind i væsken, er kendetegnet ved skiftende højtryks- / lavtrykscyklusser. Under en lavtrykscyklus udvider væsken sig, og der opstår meget små vakuumbobler. Disse meget små bobler vokser over flere skiftende trykcyklusser, indtil de ikke kan optage mere energi. På dette tidspunkt imploderer kavitationsboblerne voldsomt og skaber lokalt et usædvanligt energitæt miljø. Dette fænomen kaldes akustisk kavitation og er kendetegnet ved lokalt meget høje temperaturer, meget høje tryk og forskydningskræfter. Disse forskydningsspændinger nedbryder effektivt cellevæggene og øger masseoverførslen mellem cellernes indre og det omgivende opløsningsmiddel. Som en rent mekanisk teknik anvendes ultralydsgenererede forskydningskræfter i vid udstrækning og er den anbefalede fremgangsmåde til opløsning af bakterieceller samt til proteinisolering. Som en enkel og hurtig metode til celleopløsning er sonikering ideel til isolering fra små, mellemstore og store volumener. Hielscher’s digitale ultralydsapparater er udstyret med en overskuelig indstillingsmenu til præcis styring af sonikeringen. Alle sonikeringsdata gemmes automatisk på et indbygget SD-kort og er let tilgængelige. Avancerede muligheder for varmeafledning såsom ekstern køling, sonikering i pulstilstand osv. under ultralydsdisintegrationen sikrer, at den ideelle procestemperatur opretholdes, og dermed at de ekstraherede varmefølsomme forbindelser forbliver intakte.

Forskning understreger styrkerne ved celleopløsning og ekstraktion med ultralyd

Prof. Chemat et al. (2017) sammenfatter i deres studie, at ”ultralydsassisteret ekstraktion er et grønt og økonomisk rentabelt alternativ til konventionelle teknikker til fødevarer og naturprodukter. De vigtigste fordele er reduktion af ekstraktions- og behandlingstiden, mængden af anvendt energi og opløsningsmidler, antallet af enhedsoperationer samt CO₂ -emissioner.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) anvendte en højtrykshomogenisator og et ultralydsapparat til celledisintegration i deres studie til lyse af sporer for at frigive DNA. Ved sammenligning af de to metoder til celleopløsning konkluderer forskerholdet vedrørende cellelyse til udvinding af spore-DNA, at ”analysen blev udført ved hjælp af cellelysater fra højtrykshomogeniseringen. Efterfølgende indså vi, at celleopløsning med ultralyd har enestående fordele til dette formål. Den er ret hurtig og kan udføres på små prøvevolumener.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekyler fra cellefabrikker til fødevareproduktion

Mikrobielle cellefabrikker er en anvendelig og effektiv produktionsmetode, som anvender mikrobielle organismer til at producere høje udbytter af naturligt forekommende og ikke-naturligt forekommende metabolitter gennem metabolisk bioteknologisk modificering af mikroorganismer såsom bakterier, gær, svampe osv. Enzymer i store mængder produceres eksempelvis ved hjælp af mikroorganismer såsom Aspergillus oryzae, svampe og bakterier. Disse enzymer anvendes til fødevare- og drikkevareproduktion samt inden for landbrug, bioenergi og husholdningspleje.
Visse bakterier såsom Acetobacter xylinum og Gluconacetobacter xylinus producerer cellulose under fermenteringsprocessen, hvor nanofibre syntetiseres i en bottom-up-proces. Bakteriel cellulose (også kendt som mikrobiel cellulose) er kemisk ækvivalent med plantecellulose, men har en høj krystallinitetsgrad og høj renhed (fri for lignin, hemicellulose, pektin og andre biogene bestanddele) samt en unik struktur bestående af et tredimensionelt (3D), netformet netværk vævet af cellulosenanofibre. (jf. Zhong, 2020) Sammenlignet med plantebaseret cellulose er bakteriel cellulose mere bæredygtig, og den producerede cellulose er ren og kræver ikke komplicerede oprensningstrin. Ultralydsbehandling og opløsningsmiddelekstraktion med NaOH eller SDS (natriumdodecylsulfat) er meget effektive til isolering af bakteriel cellulose fra bakteriecellerne.

Biomolekyler fra cellefabrikker til lægemiddel- og vaccineproduktion

Et af de mest fremtrædende lægemidler, der fremstilles ved hjælp af cellefabrikker, er humant insulin. Til bioteknologisk insulinproduktion anvendes overvejende E. coli og Saccharomyces cerevisiae. Da biosyntetiserede molekyler i nanostørrelse har høj biokompatibilitet, er biologiske nanopartikler såsom ferritin fordelagtige til talrige anvendelser inden for biologisk produktion. Desuden giver produktion i metabolisk modificerede mikroorganismer ofte betydeligt højere udbytter. For eksempel er produktionen af artemisininsyre, resveratrol og lycopen steget til det tidobbelte til flere hundrede gange det oprindelige niveau og er allerede etableret eller under udvikling til produktion i industriel skala. (jf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
For eksempel er proteinbaserede biomolekyler i nanostørrelse med selvsamlende egenskaber såsom ferritin og viruslignende partikler særligt interessante til vaccineudvikling, da de efterligner både patogeners størrelse og struktur og egner sig til konjugering af antigener på overfladen for at fremme interaktionen med immunceller. Sådanne molekyler udtrykkes i såkaldte cellefabrikker (f.eks. modificerede E. coli-stammer), som producerer et bestemt målmolekyle.

Protokol for ultralydslyse af E. coli BL21 til frigivelse af ferritin

Ferritin er et protein, hvis primære funktion er lagring af jern. Ferritin viser lovende egenskaber som selvsamlende nanopartikler i vacciner, hvor det anvendes som vehikel til levering af vaccinekomponenter (f.eks. SARS-Cov-2-spikeproteiner). Den videnskabelige forskning udført af Sun et. al. (2016) viser, at rekombinant ferritin kan frigives i opløselig form fra Escherichia coli ved lave NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). For at udtrykke ferritin i E. coli BL21 og frigive ferritinet blev følgende protokol anvendt med succes. Det rekombinante pET-28a/ferritin-plasmid blev transformeret ind i E coli BL21 (DE3)-stammen. Ferritin-E coli BL21 (DE3)-cellerne blev dyrket i LB-vækstmedier med 0,5% kanamycin ved 37°C og induceret ved en OD600 på 0,6 med 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside i 3 timer ved 37°C. Den endelige kultur blev derefter høstet ved centrifugering ved 8000g i 10 minutter ved 4°C, og pelleten blev opsamlet. Derefter blev pelleten resuspenderet i henholdsvis LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% gærekstrakt)/lysebuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) og NaCl-opløsninger med forskellige koncentrationer (0, 50, 100, 170 og 300 mmol/L). Til lyse af bakterieceller blev sonikering anvendt i pulstilstand: f.eks. med ultralydsapparatet UP400St ved 100% amplitude med en driftscyklus på 5 sekunder TIL, 10 sekunder FRA, i 40 cyklusser) og derefter blev der centrifugeret ved 10 000g i 15 minutter ved 4°C. Supernatanten og bundfaldet blev analyseret ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Alle natriumdodecylsulfatfarvede geler blev scannet med en scanner med høj opløsning. Gelbillederne blev analyseret med Magic Chemi 1D-software. For at opnå optimal tydelighed blev proteinbåndene detekteret ved at justere parametrene. Dataene for båndene blev genereret fra tekniske triplikater. (jf. Sun et al., 2016)

Ultralydsapparater til industriel lyse af cellefabrikker

Ultralydslyse og -ekstraktion er en pålidelig og praktisk metode til at frigive metabolitter fra cellefabrikker og understøtter dermed en effektiv produktion af målmolekyler. Ultralydsapparater til celleopløsning fås fra laboratoriestørrelse til industriel størrelse, og processerne kan opskaleres fuldstændigt lineært.
Hielscher Ultrasonics er din kompetente partner inden for højtydende ultralydsapparater til celleopløsning og har mange års erfaring med installation af ultralydssystemer i bordopstillinger og industrielle anlæg.
Når det gælder avanceret hardware og software, opfylder systemerne til celleopløsning fra Hielscher Ultrasonics alle krav til optimal processtyring, enkel betjening og brugervenlighed. Kunder og brugere af ultralydsapparater fra Hielscher værdsætter den fordel, at ultralydsapparater til celleopløsning og ekstraktion fra Hielscher muliggør præcis procesovervågning og -styring – via digital berøringsskærm og fjernstyring gennem en browser. Alle vigtige sonikeringsdata (f.eks. nettoenergi, samlet energi, amplitude, varighed, temperatur og tryk) gemmes automatisk som en CSV-fil på et integreret SD-kort. Dette hjælper med at opnå reproducerbare og gentagelige resultater og letter processtandardisering samt overholdelse af god fremstillingspraksis (cGMP).
Ultralydsprocessorer fra Hielscher er naturligvis konstrueret til 24/7-drift under fuld belastning og kan derfor anvendes pålideligt i industrielle produktionsanlæg. Takket være høj robusthed og lavt vedligeholdelsesbehov er ultralydsudstyrets nedetid meget lav. CIP-funktioner (rengøring på stedet) og SIP-funktioner (sterilisering på stedet) minimerer arbejdskrævende rengøring, især fordi alle væskeberørte dele har glatte metaloverflader (ingen skjulte åbninger eller dyser).

Tabellen nedenfor giver en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: