Ultralydslyse af biokonstruerede celler i industriel produktion

Biomanipulerede bakteriearter som E. coli samt genetisk modificerede pattedyr- og plantecelletyper bruges i vid udstrækning i bioteknologi til at udtrykke molekyler. For at frigive disse syntetiserede biomolekyler kræves en pålidelig celleforstyrrelsesteknik. Højtydende ultralydbehandling er en gennemprøvet metode til effektiv og pålidelig cellelyse – let skalerbar til store gennemløb. Hielscher Ultrasonics tilbyder dig højtydende ultralydsudstyr til effektiv cellelyse for at producere store mængder biomolekyler af høj kvalitet.

Udvinding af molekyler fra cellefabrikker

Til produktion af en bred vifte af biomolekyler kan forskellige konstruerede mikrober og planteceller bruges som mikrobielle cellefabrikker, herunder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana og alger, blandt mange andre. Disse cellefabrikker kan producere proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobrændstoffer og oleokemikalier, der bruges som fødevarer eller råmateriale til industrielle applikationer. Celler, der bruges som cellefabrikker, dyrkes i lukkede bioreaktorer, hvor de kan opnå høj effektivitet, specificitet og lave energikrav.
For at isolere målmolekylerne fra de biomanipulerede cellekulturer skal cellerne forstyrres, så det intracellulære materiale frigives. Ultralydscelleforstyrrere er veletablerede som meget pålidelige og effektive teknikker til celleopløsning og frigivelse af forbindelser.

Mikrobielle cellefabrikker er metabolisk konstruerede celler, der bruges til syntese af forskellige værdifulde forbindelser. Ultralydscelleafbrydelse er en effektiv og pålidelig metode til at frigive de værdifulde forbindelser fra cellens indre.
studie og grafik: ©Villaverde, 2010.

Fordele ved ultralydscelleforstyrrere

Som en ikke-termisk, mild, men alligevel meget effektiv teknologi bruges ultralydsforstyrrende stoffer i laboratorier og industri til at lyse celler og til at producere ekstrakter af høj kvalitet, f.eks. brugt til isolering af molekyler fra cellefabrikker.

Power-ultralyd til effektiv afbrydelse af mikrobielle cellefabrikker

Mekanisme og virkninger af ultralydscelleforstyrrere:
Ultralydscelleafbrydelse brugte kraften fra ultralydsbølger. Ultralydshomogenisatoren / celleforstyrreren er udstyret med en sonde (aka sonotrode) fremstillet af titanlegering, der svinger med en høj frekvens på ca. 20 kHz. Dette betyder, at ultralydssonden kobler 20.000 vibrationer i sekundet i den sonikerede væske. Ultralydbølgerne koblet til væsken er kendetegnet ved skiftende højtryks- / lavtrykscyklusser. Under en lavtrykscyklus udvider væsken sig, og der opstår små vakuumbobler. Disse meget små bobler vokser over flere vekslende trykcyklusser, indtil de ikke kan absorbere yderligere energi. På dette tidspunkt imploderer kavitationsboblerne voldsomt og skaber lokalt et ekstraordinært energitæt miljø. Dette fænomen er kendt som akustisk kavitation og er karakteriseret ved lokalt meget høje temperaturer, meget høje tryk og forskydningskræfter. Disse forskydningsspændinger bryder effektivt cellevægge og øger masseoverførslen mellem cellens indre og det omgivende opløsningsmiddel. Som en rent mekanisk teknik anvendes ultralydgenererede forskydningskræfter i vid udstrækning og den anbefalede procedure til bakteriel celleforstyrrelse samt til proteinisolering. Som en enkel og hurtig celleforstyrrelsesmetode er sonikering ideel til isolering af små, mellemstore og store volumener. Hielschers digitale ultralydapparater er udstyret med en klar menu med indstillinger til præcis sonikeringskontrol. Alle sonikeringsdata gemmes automatisk på et indbygget SD-kort og er simpelthen tilgængelige. Sofistikerede muligheder for varmeafledning, såsom ekstern køling, sonikering i pulstilstand osv. under ultralydsopløsningsprocessen sikrer opretholdelsen af den ideelle procestemperatur og derved intaktheden af ekstraherede varmefølsomme forbindelser.

Forskning understreger styrkerne ved ultralydscelleafbrydelse og ekstraktion

Prof. Chemat et al. (2017) genoptager i deres undersøgelse, at "ultralydsassisteret ekstraktion er et grønt og økonomisk levedygtigt alternativ til konventionelle teknikker til fødevarer og naturlige produkter. De vigtigste fordele er reduktion af ekstraktions- og behandlingstid, mængden af energi og anvendte opløsningsmidler, enhedsoperationer og CO₂ emissioner."
Gabig-Ciminska et al. (2014) brugte en højtrykshomogenisator og en ultralydscelle-dsintegrator i deres undersøgelse til lysering af sporer for at frigive DNA. Ved at sammenligne begge celleforstyrrelsesmetoder konkluderer forskerholdet, at med hensyn til cellelysen for spore-DNA "er der foretaget analyse ved at anvende cellelysater fra højtrykshomogeniseringen. Bagefter indså vi, at en ultralydscelleforstyrrelse har enestående fordele til dette formål. Det er ret hurtigt og kan behandles til små prøvemængder." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekyler fra cellefabrikker til fødevareproduktion

Mikrobielle cellefabrikker er en levedygtig og effektiv produktionsmetode, der bruger mikrobielle organismer til at producere høje udbytter af native og ikke-native metabolitter ved metabolisk bio-engineering af mikrobielle mikroorganismer såsom bakterier, gær, svampe osv. Bulkenzymer fremstilles f.eks. ved hjælp af mikroorganismer som Aspergillus oryzae, svampe og bakterier. Disse bulkenzymer bruges til fødevare- og drikkevareproduktion samt i landbrug, bioenergi og husholdningspleje.
Visse bakterier såsom Acetobacter xylinum og Gluconacetobacter xylinus producerer cellulose under fermenteringsprocessen, hvor nanofibre syntetiseres i en bottom-up-proces. Bakteriel cellulose (også kendt som mikrobiel cellulose) er kemisk ækvivalent med plantecellulose, men den har høj grad af krystallinitet og høj renhed (fri for lignin, hemicellulose, pektin og andre biogene komponenter) samt en unik struktur af cellulose nanofibervævet tredimensionelt (3D) retikuleret netværk. (jf. Zhong, 2020) I sammenligning med planteafledt cellulose er bakteriecellulose mere bæredygtig, og den producerede cellulose er ren og kræver ikke komplekse rensningstrin. Ultralydbehandling og opløsningsmiddelekstraktion ved hjælp af NaOH eller SDS (natriumdodecylsulfat) er meget effektive til isolering af bakteriel cellulose fra bakteriecellerne.

Biomolekyler fra cellefabrikker til farmaceutisk og vaccineproduktion

Et af de mest fremtrædende farmaceutiske produkter, der stammer fra cellefabrikker, er humant insulin. Til biomanipuleret insulinproduktion anvendes overvejende E. coli og Saccharomyces cerevisiae. Da biosyntetiserede molekyler i nanostørrelse tilbyder en høj biokompatibilitet, er biologiske nanopartikler såsom ferritin fordelagtige til adskillige biofremstillingsapplikationer. Derudover er produktionen i metabolisk manipulerede mikrober ofte betydeligt mere effektiv i de opnåede udbytter. For eksempel er produktionen af artemisinsyre, resveratrol og lycopen tidoblet til flere hundrede gange og er allerede etableret eller er under udvikling til produktion i industriel skala. (jf. Liu et al.; Mikrob. Celle fakta. 2017)
For eksempel er proteinbaserede biomolekyler i nanostørrelse med selvsamlende egenskaber såsom ferritin og viruslignende partikler særligt interessante for vaccineudvikling, da de efterligner både størrelsen og strukturen af patogener og er modtagelige for overfladekonjugering af antigener for at fremme interaktionen med immunceller. Sådanne molekyler udtrykkes i såkaldte cellefabrikker (f.eks. konstruerede E. coli-stammer), som producerer et bestemt målmolekyle.

Protokol for ultralydslyse og af E. coli BL21 til ferritinfrigivelse

Ferritin er et protein, hvis primære funktion er opbevaring af jern. Ferritin viser lovende evner som selvsamlende nanopartikler i vacciner, hvor det bruges som vaccineleveringsmiddel (f.eks. SARS-Cov-2 spikeproteiner). Den videnskabelige forskning af Sun et. al. (2016) viser, at rekombinant ferritin kan frigives som en opløselig form fra Escherichia coli ved lave NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). For at udpumpe ferritin i E. coli BL21 og frigive ferrtinet blev følgende protokol anvendt. Det rekombinante pET-28a/ferritinplasmide blev omdannet til E coli BL21 (DE3) stammen. Ferritin E coli BL21 (DE3)-cellerne blev dyrket i LB-vækstmedier med 0,5 % kanamycin ved 37 °C og induceret ved en OD600 på 0,6 med 0,4 % isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid i 3 timer ved 37 °C. Den endelige kultur blev derefter høstet ved centrifugering ved 8000 g i 10 minutter ved 4°C, og pelleten blev indsamlet. Derefter blev pelleten resuspenderet i LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0.5% gærekstrakt)/lysisbuffer (henholdsvis 20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) og forskellige koncentrationer af NaCl-opløsning (henholdsvis 0, 50, 100, 170 og 300 mmol/L). Til bakteriel cellelyse blev sonikering anvendt i pulstilstand: f.eks. ved hjælp af Ultralydsapparat UP400St ved 100 % amplitude med en driftscyklus på 5 sekunder ON, 10 sekunder OFF i 40 cyklusser) og derefter centrifugeret ved 10 000 g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten og bundfaldet blev analyseret ved hjælp af natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Alle natriumdodecylsulfatfarvede geler blev scannet med højopløsningsscanner. Gelbilleder blev analyseret ved hjælp af Magic Chemi 1D-software. For optimal klarhed blev proteinbånd detekteret ved at justere parametre. Data for båndene blev genereret fra tekniske tredobbelte data. (jf. Sun et al., 2016)

Ultralydscelleafbrydere til industriel lysis af cellefabrikker

Ultralydslyse og ekstraktion er en pålidelig og behagelig metode til at frigive metabolitter fra cellefabrikker og derved hjælpe med en effektiv produktion af målmolekyler. Ultralydscelleafbrydere er tilgængelige fra laboratoriet til industriel størrelse, og processer kan skaleres helt lineært.
Hielscher Ultrasonics er din kompetente partner til højtydende ultralydsforstyrrere og har lang erfaring inden for implantering af ultralydssystemer i bænk- og industrielle omgivelser.
Når det kommer til sofistikeret hardware og software, opfylder Hielscher Ultrasonics celleafbrydelsessystemer alle krav til optimal processtyring, nem betjening og brugervenlighed. Kunder og brugere af Hielscher ultralydsapparater værdsætter fordelen ved, at Hielscher ultralydscelleforstyrrere og ekstraktorer giver mulighed for præcis procesovervågning og kontrol – via digital touch-display og browserfjernbetjening. Alle vigtige sonikeringsdata (f.eks. Nettoenergi, total energi, amplitude, varighed, temperatur, tryk) gemmes automatisk som CSV-fil på et integreret SD-kort. Dette hjælper med at opnå reproducerbare og repeterbare resultater og letter processtandardisering samt opfyldelsen af god fremstillingspraksis (cGMP).
Selvfølgelig er Hielscher ultralydsprocessorer bygget til 24/7 drift under fuld belastning og kan derfor betjenes pålideligt i industrielle produktionsmiljøer. På grund af høj robusthed og lav vedligeholdelse er nedetiden for ultralydsudstyret virkelig lav. CIP-funktioner (clean-in-place) og SIP (sterilize-in-place) minimerer besværlig rengøring, især da alle våde dele er glatte metaloverflader (ingen skjulte åbninger eller dyser).

Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater: