Bioengineered bakterier arter såsom E. coli samt genetisk modificerede pattedyr og plante celletyper anvendes i vid udstrækning i biotek til at udtrykke molekyler. For at frigive disse syntetiserede biomolekyler kræves en pålidelig celleforstyrrelsesteknik. Højtydende ultralydbehandling er en gennemprøvet metode til effektiv og pålidelig celle lysis – let skalerbar til store gennemløb. Hielscher Ultrasonics tilbyder dig højtydende ultralydsudstyr til effektive celle lysis for at producere store mængder biomolekyler af høj kvalitet.

Udvinding af molekyler fra cellefabrikker

Til produktion af en bred vifte af biomolekyler kan forskellige manipulerede mikrober og planteceller bruges som mikrobielle cellefabrikker, herunder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana og alger, blandt mange andre. Disse cellefabrikker kan producere proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobrændstoffer og oleokemikalier, der bruges som fødevarer eller råvarer til industrielle anvendelser. Celler, der anvendes som cellefabrikker, dyrkes i lukkede bioreaktorer, hvor de kan opnå høj effektivitet, specificitet og lave energibehov.
For at isolere målmolekylerne fra de bioengineered cellekulturer skal cellerne forstyrres, så det intracellulære materiale frigives. Ultralydcelleforstyrrende stoffer er veletablerede som meget pålidelig og effektiv teknik til celleopløsning og sammensat frigivelse.

Mikrobielle cellefabrikker er metabolisk manipulerede celler, der anvendes til syntese af forskellige værdifulde forbindelser. Ultralydcelleforstyrrelse er en effektiv og pålidelig metode til at frigive de værdifulde forbindelser fra celleinteriøret.
undersøgelse og grafik: ©Villaverde, 2010.

Fordele ved ultralydscelleforstyrrende stoffer

Som en ikke-termisk, mild, men alligevel meget effektiv teknologi anvendes ultralydsforstyrrende stoffer i laboratoriet og industrien til at lyse celler og til at producere ekstrakter af høj kvalitet, f.eks.

Power-Ultralyd for effektiv forstyrrelse af mikrobielle cellefabrikker

Mekanisme og virkninger af ultralydcelleforstyrrende stoffer:
Ultralydcelleforstyrrelse brugte effekten af ultralydbølger. Ultralyd homogenisator / celle disruptor er udstyret med en sonde (aka sonotrode) lavet af titaniumlegering, der svinger med en høj frekvens på ca. 20 kHz. Det betyder, at ultralydsonden parres 20.000 vibrationer i sekundet i den sonikerede væske. Ultralydbølgerne koblet ind i væsken er kendetegnet ved skiftende højtryks- / lavtrykscyklusser. Under et lavtrykscyklus udvider væsken sig, og der opstår små vakuumbobler. Disse meget små bobler vokser over flere skiftende trykcyklusser, indtil de ikke kan absorbere yderligere energi. På dette tidspunkt imploderer kavitationsboblerne voldsomt og skaber lokalt et ekstraordinært energitæt miljø. Dette fænomen er kendt som akustisk kavitation og er kendetegnet ved lokalt meget høje temperaturer, meget højt tryk og forskydningskræfter. Disse forskydning understreger bryde effektivt cellevægge og øge masseoverførslen mellem cellen interiør og det omgivende opløsningsmiddel. Som en rent mekanisk teknik anvendes ultralydsgenererede forskydningskræfter i vid udstrækning og den anbefalede procedure for bakteriecelleforstyrrelser samt for proteinisolation. Som en enkel og hurtig celleforstyrrelsesmetode er sonikering ideel til isolering af små, mellemstore og store mængder. Hielschers digitale ultralydapparater er udstyret med en klar menu med indstillinger for præcis sonikeringskontrol. Alle sonikeringsdata gemmes automatisk på et indbygget SD-kort og er simpelthen tilgængelige. Sofistikerede muligheder for varmeafledning såsom ekstern køling, sonikering i pulstilstand osv. under ultralydsopløsningsprocessen sikrer opretholdelsen af den ideelle procestemperatur og dermed intaktheden af ekstrahviderede varmefølsomme forbindelser.

Forskning understreger styrkerne af ultralydscelleforstyrrelser og ekstraktion

Prof. Chemat et al. (2017) genoptager i deres undersøgelse, at "ultralydassisteret ekstraktion er et grønt og økonomisk levedygtigt alternativ til konventionelle teknikker til fødevarer og naturlige produkter. De vigtigste fordele er fald i ekstraktions- og behandlingstiden, mængden af energi og opløsningsmidler, der anvendes, enhedsoperationer og CO₂ emissioner."
Gabig-Ciminska et al. (2014) brugte en højtryks homogenisator og en ultralydscelle dsintegrator i deres undersøgelse til lysis af sporer for at frigive DNA. Ved at sammenligne begge celleforstyrrelsesmetoder konkluderer forskerholdet, at med hensyn til cellelyset til spore-DNA er "analyse blevet udført ved at anvende cellelyater fra højtryks homogeniseringen. Bagefter indså vi, at en ultralydscelleforstyrrelse har fremragende fordele til dette formål. Det er ret hurtigt og kan behandles for små prøvemængder." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekyler fra cellefabrikker til fødevareproduktion

Mikrobielle cellefabrikker er en levedygtig og effektiv produktionsmetode, der bruger mikrobielle organismer til at producere høje udbytter af indfødte og ikke-hjemmehørende metabolitter ved metabolisk bioteknik af mikrobielle mikroorganismer som bakterier, gær, svampe osv. Bulkenzymer produceres for eksempel ved hjælp af mikroorganismer, så vidt Aspergillus oryzae, svampe og bakterier. Disse bulkenzymer anvendes til produktion af fødevarer og drikkevarer samt i landbrug, bioenergi og husholdningspleje.
Visse bakterier som Acetobacter xylinum og Gluconacetobacter xylinus producerer cellulose under fermenteringsprocessen, hvor nanofibre syntetiseres i en bottom-up proces. Bakteriecelleulose (også kendt som mikrobiel cellulose) er kemisk svarende til plante cellulose, men det har høj grad af krystallinitet og høj renhed (fri for lignin, hemicellulose, pektin og andre biogene komponenter) samt en unik struktur af cellulose nanofiber-vævet tredimensionelle (3D) reticulated netværk. (se Zhong, 2020) I forhold til plante-afledt cellulose, bakteriel cellulose er mere bæredygtig og cellulose produceret er ren ikke kræver komplekse rensning trin. Ultralydbehandling og opløsningsmiddeludvinding ved hjælp af NaOH eller SDS (natrium dodecyl sulfat) er meget effektive til isolering af bakteriecelleulose fra bakteriecellerne.

Biomolekyler fra cellefabrikker til produktion af lægemidler og vacciner

Et af de mest fremtrædende farmaceutiske produkter fra cellefabrikker er human insulin. Til bioengineered insulinproduktion anvendes overvejende E. coli og Saccharomyces cerevisiae. Da biosyntetiserede nano-størrelse molekyler tilbyder en høj biokompatibilitet, biologiske nanopartikler såsom ferritin er fordelagtige for mange bioproduktion applikationer. Derudover er produktionen i metabolisk manipulerede mikrober ofte betydeligt mere effektiv i de opnåede udbytter. F.eks. er produktionen af artemisinsyre, resveratrol og lycopen tidoblet til flere hundrede gange og er allerede etableret eller er under udvikling til industriel produktion. (jf. Liu et al.; Mikrob. Celle fakta. 2017)
For eksempel er proteinbaserede nano-størrelse biomolekyler med selvmonteringsegenskaber som ferritin og viruslignende partikler særligt interessante for vaccineudvikling, da de efterligner både størrelsen og strukturen af patogener og er modtagelige for overfladekonjugation af antigener for at fremme interaktionen med immunceller. Sådanne molekyler udtrykkes i såkaldte cellefabrikker (f.eks. manipulerede E. coli-stammer), som producerer et bestemt målmolekyle.

Protokol for ultralyd lysis og E. coli BL21 for Ferritin Release

Ferritin er et protein, som primært funktion er opbevaring af jern. Ferritin viser lovende evner som selvmontering af nanopartikler i vacciner, hvor det bruges som vaccineleveringskøretøj (f.eks. SARS-Cov-2 spikeproteiner). Den videnskabelige forskning i Sun et. al. (2016) viser, at rekombinant ferritin kan frigives som en opløselig form fra Escherichia coli ved lave NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). For at udtrykke ferritin i E. coli BL21 og for at frigive ferrtinen blev følgende protokol anvendt med succes. Den rekombinante pET-28a/ferritin plasmid blev omdannet til E coli BL21 (DE3) stammen. Ferritin E coli BL21 (DE3) cellerne blev kultiveret i LB vækstmedier med 0,5% kanamycin ved 37 °C og induceret ved en OD600 på 0,6 med 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside i 3 timer ved 37 °C. Den endelige kultur blev derefter høstet ved centrifugering ved 8000g i 10 minutter ved 4 ° C, og pellet blev indsamlet. Derefter blev pelleten suspenderet igen i LB medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% gærekstrakt) / lysis buffer (20 mmol / L Tris, 50 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, pH 7.6) og forskellige koncentrationer af NaCl-opløsning (henholdsvis 0, 50, 100, 170 og 300 mmol / L). For bakteriecelle lysis blev sonikering anvendt i pulstilstand: f.eks. ultralydator UP400St ved 100% amplitud med en arbejdscyklus på 5 sekunder ON, 10 sekunder OFF, i 40 cyklusser) og derefter centrifugeret ved 10 000g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten og bundfaldet blev analyseret af natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Alle natrium dodecyl sulfat-farvede geler blev scannet med høj opløsning scanner. Gel billeder blev analyseret ved hjælp af Magic Chemi 1D-software. For at opnå optimal klarhed blev proteinbånd opdaget ved at justere parametre. Dataene for båndene blev genereret fra tekniske triplikater. (jf. Sun et al., 2016)

Ultralydscelleforstyrrende stoffer til industrielle lysis af cellefabrikker

Ultralyd lysis og ekstraktion er en pålidelig og behagelig metode til at frigive metabolitter fra cellefabrikker og derved hjælpe en effektiv produktion af målmolekyler. Ultralydcelleforstyrrende stoffer er tilgængelige fra lab til industriel størrelse, og processer kan skaleres helt lineære.
Hielscher Ultrasonics er din kompetente partner for højtydende ultralydsforstyrrende stoffer og har lang tid erfaring inden for implantering af ultralydssystemer i bænk-top og industrielle indstillinger.
Når det kommer til sofistikeret hardware og software, opfylder Hielscher Ultrasonics celleforstyrrelsessystemer alle krav til optimal processtyring, nem betjening og brugervenlighed. Kunder og bruger af Hielscher ultralydapparater værdsætter fordelen ved, at Hielscher ultralydscelleforstyrrendere og ekstravindere giver mulighed for præcis procesovervågning og -kontrol – via digital touch-display og browser fjernbetjening. Alle vigtige sonikeringsdata (f.eks. nettoenergi, total energi, amplitud, varighed, temperatur, tryk) gemmes automatisk som CSV-fil på et integreret SD-kort. Dette hjælper med at opnå reproducerbare og repeterbare resultater og letter processtandardisering samt opfyldelsen af god fremstillingspraksis (cGMP).
Selvfølgelig er Hielscher ultralydsprocessorer bygget til 24/7 drift under fuld belastning og kan derfor pålideligt betjenes i industrielle produktionsindstillinger. På grund af høj robusthed og lav vedligeholdelse er ultralydsudstyrets nedetid virkelig lav. CIP(clean-in-place) og SIP (sterilisere-in-place) funktioner minimere besværlig rengøring, især da alle våde dele er glatte metaloverflader (ingen skjulte åbninger eller dyser).

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige forarbejdningskapacitet hos vores ultralydapparater: