Biosyntetisk produktion af oligosaccharider i modermælk

Biosyntesen af oligosaccharider (HMO'er) via fermentering eller enzymatiske reaktioner er en kompleks, krævende og ofte lavtydende proces. Ultralydbehandling øger masseoverførslen mellem substrat og cellefabrikker og stimulerer cellevækst og metabolisme. Derved intensiverer sonikering fermentering og biokemiske processer, hvilket resulterer i en accelereret og mere effektiv produktion af HMO'er.

oligosaccharider af human mælk

Oligosaccharider (HMO'er), også kendt som mormælksglykaner, er sukkermolekyler, der er en del af oligosaccharider-gruppen. Fremtrædende eksempler på HMO'er omfatter 2'-fucosyllactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3'-galactosyllactose (3′-GL) og difucosyllactose (DFL).
Mens modermælk består af mere end forskellige 150 HMO-strukturer, produceres kun 2′-fucosyllactose (2′-FL) og lacto-N-neotetraose (LNnT) i øjeblikket på kommercielt niveau og anvendes som ernæringsmæssige tilsætningsstoffer i modermælkserstatning.
Oligosaccharider (HMO'er) er kendt for deres betydning i babyernæring. Oligosaccharider til brystmælk er en unik type næringsstoffer, der fungerer som præbiotika, anti-klæbende antimikrobielle stoffer og immunmodulatorer i spædbarnets tarm og bidrager væsentligt til hjernens udvikling. HMO'er findes udelukkende i modermælk hos mennesker; Mælk fra andre pattedyr (f.eks. ko, ged, får, kamel osv.) har ikke disse specifikke former for oligosaccharider.
Oligosaccharider i modermælk er den tredje mest udbredte faste bestanddel i modermælk, som kan være til stede enten i opløst eller emulgeret eller suspenderet form i vand. Laktose og fedtsyrer er de mest udbredte faste stoffer, der findes i modermælk. HMO'er er til stede i en koncentration på 0,35-0,88 ounce (9,9-24,9 g)/L. Cirka 200 strukturelt forskellige oligosaccharider af human mælk er kendt. Det dominerende oligosaccharid hos 80% af alle kvinder er 2′-fucosyllactose, som er til stede i human modermælk i en koncentration på ca. 2,5 g/l.
Da HMO'er ikke fordøjes, bidrager de ikke kalorisk til ernæring. Da de er ufordøjelige kulhydrater, fungerer de som præbiotika og fermenteres selektivt af ønskværdig tarmmikroflora, især bifidobakterier.

Biosyntese af oligosaccharider i human mælk

Cellefabrikker og enzymatiske / kemo-enzymatiske systemer er nuværende teknologier, der bruges til syntese af HMO'er. Til HMO-produktion i industriel skala er fermentering af mikrobielle cellefabrikker, biokemisk syntese og forskellige enzymatiske reaktioner gennemførlige måder at producere HMO-bioproduktion på. Af økonomiske årsager er biosyntese via mikrobielle cellefabrikker i øjeblikket den eneste teknik, der anvendes på industrielt produktionsniveau af HMO'er.

Fermentering af HMO'er ved hjælp af mikrobielle cellefabrikker

E.coli, Saccharomyces cerevisiae og Lactococcus lactis er almindeligt anvendte cellefabrikker, der bruges til bioproduktion af biologiske molekyler såsom HMO'er. Fermentering er en biokemisk proces, der bruger mikroorganismer til at omdanne et substrat til målrettede biologiske molekyler. Mikrobielle cellefabrikker bruger simple sukkerarter som substrat, som de omdanner til HMO'er. Da simple sukkerarter (f.eks. laktose) er et rigeligt, billigt substrat, holder dette biosynteseprocessen omkostningseffektiv.
Vækst og biokonverteringshastighed påvirkes hovedsageligt af masseoverførsel af næringsstoffer (substrat) til mikroorganismerne. Masseoverførselshastigheden er en hovedfaktor, der påvirker produktsyntesen under gæringen. Ultralydbehandling er velkendt for at fremme masseoverførsel.
Under fermentering skal forholdene i bioreaktoren konstant overvåges og reguleres, så cellerne kan vokse så hurtigt som muligt for derefter at producere de målrettede biomolekyler (f.eks. oligosaccharider såsom HMO'er; insulin; rekombinante proteiner). Teoretisk set starter produktdannelsen, så snart cellekulturen begynder at vokse. Men især i genetisk modificerede celler, såsom konstruerede mikroorganismer, induceres det normalt senere ved at tilsætte et kemisk stof til substratet, som opregulerer ekspressionen af det målrettede biomolekyle. Ultralydsbioreaktorer (sono-bioreaktor) kan styres præcist og give mulighed for specifik stimulering af mikrober. Dette resulterer i en accelereret biosyntese og højere udbytter.
Ultralydslyse og ekstraktion: Fermentering af komplekse HMO'er kan være begrænset af titere med lav gæring og produkter, der forbliver intracellulære. Ultralydslyse og ekstraktion bruges til at frigive intracellulært materiale før oprensning og nedstrømsprocesser.

Ultralydsfremmet gæring

Væksthastigheden for mikrober såsom Escherichia coli, konstrueret E.coli, Saccharomyces cerevisiae og Lactococcus lactis kan accelereres ved at øge masseoverførselshastigheden og cellevæggens permeabilitet ved at anvende kontrolleret lavfrekvent ultralydbehandling. Som en mild, ikke-termisk behandlingsteknik anvender ultralydbehandling rent mekaniske kræfter i gæringsbouillonen.
Akustisk kavitation: Arbejdsprincippet for sonikering er baseret på akustisk kavitation. Ultralydssonden (sonotrode) kobler lavfrekvente ultralydbølger ind i mediet. Ultralydsbølgerne bevæger sig gennem væsken og skaber skiftevis højtrykscyklusser (kompression) / lavtryk (sjældenhed). Ved at komprimere og strække væsken i skiftende cyklusser opstår der små vakuumbobler. Disse små vakuumbobler vokser over flere cyklusser, indtil de når en størrelse, hvor de ikke kan absorbere yderligere energi. På dette punkt med maksimal vækst imploderer vakuumboblen voldsomt og genererer lokalt ekstreme forhold, kendt som fænomenet kavitation. I det kavitationelle "hot-spot" kan der observeres høje tryk- og temperaturforskelle og intense forskydningskræfter med væskestråler på op til 280 m/sek. Ved disse kavitationseffekter opnås grundig masseoverførsel og sonoporation (perforering af cellevægge og cellemembraner). Substratets næringsstoffer flyder til og ind i de levende hele celler, så cellefabrikkerne får optimal næring, og væksten samt omdannelseshastigheden accelereres. Ultralydsbioreaktorer er en enkel, men yderst effektiv strategi til at behandle biomasse i en biosynteseproces med en gryde.
En præcist kontrolleret, mild sonikering er velkendt for at intensivere gæringsprocesser.
Sonikering forbedrer "produktiviteten af mange bioprocesser, der involverer levende celler via forbedring af substratoptagelse, forbedret produktion eller vækst ved at øge cellens porøsitet og potentielt forbedret frigivelse af cellekomponenter." (Naveena et al. 2015)
Læs mere om ultralydsassisteret fermentering!

Naveena et al. (2015) fandt, at ultralydsintensivering giver flere fordele under biobehandling, herunder lave driftsomkostninger sammenlignet med andre forbedrende behandlingsmuligheder, enkelhed i drift og beskedne strømkrav.

Højtydende ultralydsfermenteringsreaktorer

Fermenteringsprocesser involverer levende mikroorganismer som bakterier eller gær, der fungerer som cellefabrikker. Mens sonikering anvendes til at fremme masseoverførsel og øge mikroorganismens vækst og konverteringshastighed, er det afgørende at kontrollere ultralydsintensiteten nøjagtigt for at undgå ødelæggelse af cellefabrikkerne.
Hielscher Ultrasonics er specialist i design, fremstilling og distribution af højtydende ultralydapparater, som kan styres og overvåges præcist for at sikre overlegne gæringsudbytter.

Processtyring er ikke kun afgørende for høje udbytter og overlegen kvalitet, men gør det også muligt at gentage og reproducere resultater. Især når det kommer til stimulering af cellefabrikker, er den cellespecifikke tilpasning af sonikeringsparametrene afgørende for at opnå høje udbytter og for at forhindre cellenedbrydning. Derfor er alle digitale modeller af Hielscher ultralydapparater udstyret med intelligent software, som giver dig mulighed for at justere, overvåge og revidere sonikeringsparametre. Ultralydsprocesparametre såsom amplitude, temperatur, tryk, sonikeringsvarighed, driftscyklusser og energiinput er afgørende for at fremme HMO-produktion via gæring.
Den smarte software fra Hielscher ultralydapparater registrerer automatisk alle vigtige procesparametre på det integrerede SD-kort. Den automatiske dataregistrering af sonikeringsprocessen er grundlaget for processtandardisering og reproducerbarhed / repeterbarhed, som er påkrævet for god fremstillingspraksis (GMP).

Ultralydsrektorer til gæring

Hielscher tilbyder ultralydssonder i forskellige størrelser, længder og geometrier, som kan bruges til batch- såvel som kontinuerlige gennemstrømningsbehandlinger. Ultralydsreaktorer, også kendt som sono-bioreaktorer, er tilgængelige for ethvert volumen, der dækker ultralydsbiobehandlingen fra små laboratorieprøver til pilot- og fuldt kommercielt produktionsniveau.
Det er velkendt, at placeringen af ultralydssonotroden i reaktionskarret påvirker fordelingen af kavitation og mikrostreaming i mediet. Sonotrode og ultralydsreaktor skal vælges i overensstemmelse med cellebouillonens behandlingsvolumen. Mens sonikering kan udføres i batch såvel som i kontinuerlig tilstand, anbefales det til høje produktionsmængder at bruge en kontinuerlig flowinstallation. Når de passerer gennem en ultralydsflowcelle, får alle cellemedier nøjagtig den samme eksponering for sonikering, hvilket sikrer den mest effektive behandling. Hielscher Ultrasonics brede vifte af ultralydssonder og flowcellereaktorer gør det muligt at samle den ideelle ultralydsbiobehandlingsopsætning.

Hielscher Ultrasonics – Fra laboratorium til pilot til produktion

Hielscher Ultrasonics dækker hele spektret af ultralydsudstyr, der tilbyder kompakte håndholdte ultralydshomogenisatorer til prøveforberedelse til bænk- og pilotsystemer samt kraftfulde industrielle ultralydsenheder, der nemt behandler lastbiler i timen. Hielscher ultralydapparater er alsidige og fleksible i installations- og monteringsmuligheder og kan let integreres i alle former for batchreaktorer, fed-batches eller kontinuerlige gennemstrømningsopsætninger.
Forskelligt tilbehør samt tilpassede dele giver mulighed for den ideelle tilpasning af din ultralydsopsætning til dine proceskrav.
Hielscher ultralydsprocessorer er bygget til 24/7 drift under fuld belastning og tung under krævende forhold og er pålidelige og kræver kun lav vedligeholdelse.
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater: