Biosyntetisk produktion af oligosakkarider i human mælk

Biosyntesen af oligosakkarider i human mælk (HMO’er) via fermentering eller enzymatiske reaktioner er en kompleks, ressourcekrævende proces, der ofte giver et lavt udbytte. Ultralydsbehandling øger masseoverførslen mellem substrat og cellefabrikker og stimulerer cellevækst og metabolisme. Dermed intensiverer sonikering fermentering og biokemiske processer, hvilket resulterer i en hurtigere og mere effektiv produktion af HMO’er.

Oligosakkarider i human mælk

Oligosakkarider i human mælk (HMO’er), også kendt som glykaner i human mælk, er sukkermolekyler, der tilhører gruppen af oligosakkarider. Fremtrædende eksempler på HMO’er omfatter 2’-fucosyllactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3’-galactosyllactose (3′-GL) og difucosyllactose (DFL).
Mens human modermælk indeholder mere end 150 forskellige HMO-strukturer, produceres i øjeblikket kun 2′-fucosyllactose (2′-FL) og lacto-N-neotetraose (LNnT) kommercielt og anvendes som ernæringsmæssige tilsætningsstoffer i modermælkserstatning.
Oligosakkarider i human mælk (HMO’er) er kendt for deres betydning for spædbørns ernæring. Oligosakkarider i human mælk er en unik type næringsstoffer, der virker som præbiotika, antiadhæsive antimikrobielle stoffer og immunmodulatorer i spædbarnets tarm og bidrager væsentligt til hjernens udvikling. HMO’er findes udelukkende i human modermælk; mælk fra andre pattedyr (f.eks. køer, geder, får, kameler osv.) indeholder ikke disse specifikke former for oligosakkarider.
Oligosakkarider i human mælk er den tredjemest forekommende faste bestanddel i human mælk og kan være til stede i enten opløst, emulgeret eller suspenderet form i vand. Laktose og fedtsyrer er de mest forekommende faste stoffer i human mælk. HMO’er er til stede i en koncentration på 0,35–0,88 unser (9,9–24,9 g)/ L. Der kendes cirka 200 strukturelt forskellige oligosakkarider i human mælk. Det dominerende oligosakkarid hos 80% af alle kvinder er 2′-fucosyllactose, som er til stede i human modermælk i en koncentration på cirka 2,5 g/ L.
Da HMO’er ikke fordøjes, bidrager de ikke med kalorier til ernæringen. Som ufordøjelige kulhydrater fungerer de som præbiotika og fermenteres selektivt af den ønskede tarmmikroflora, især bifidobakterier.

Biosyntese af oligosakkarider i human mælk

Cellefabrikker og enzymatiske / kemoenzymatiske systemer er teknologier, der i dag anvendes til syntese af HMO’er. Ved HMO-produktion i industriel skala er fermentering med mikrobielle cellefabrikker, biokemisk syntese og forskellige enzymatiske reaktioner gennemførlige metoder til bioproduktion af HMO’er. Af økonomiske årsager er biosyntese via mikrobielle cellefabrikker i øjeblikket den eneste teknik, der anvendes til industriel produktion af HMO’er.

Fermentering af HMO’er ved hjælp af mikrobielle cellefabrikker

E.coli, Saccharomyces cerevisiae og Lactococcus lactis er almindeligt anvendte cellefabrikker til bioproduktion af biologiske molekyler såsom HMO’er. Fermentering er en biokemisk proces, hvor mikroorganismer bruges til at omdanne et substrat til de ønskede biologiske molekyler. Mikrobielle cellefabrikker bruger simple sukkerarter som substrat, som de omdanner til HMO’er. Da simple sukkerarter (f.eks. laktose) er et billigt substrat, der findes i rigelige mængder, holder dette biosynteseprocessen omkostningseffektiv.
Væksthastigheden og bioomdannelseshastigheden påvirkes hovedsageligt af masseoverførslen af næringsstoffer (substrat) til mikroorganismerne. Masseoverførselshastigheden er en væsentlig faktor, der påvirker produktsyntesen under fermentering. Ultralydsbehandling er velkendt for at fremme masseoverførslen.
Under fermentering skal forholdene i bioreaktoren konstant overvåges og reguleres, så cellerne kan vokse så hurtigt som muligt og derefter producere de ønskede biomolekyler (f.eks. oligosakkarider såsom HMO’er; insulin; rekombinante proteiner). Teoretisk begynder produktdannelsen, så snart cellekulturen begynder at vokse. Især i genetisk modificerede celler såsom genetisk konstruerede mikroorganismer induceres den dog normalt senere ved at tilsætte et kemisk stof til substratet, som opregulerer ekspressionen af det ønskede biomolekyle. Ultralydsbioreaktorer (sonobioreaktorer) kan styres præcist og muliggør specifik stimulering af mikrober. Dette resulterer i en hurtigere biosyntese og højere udbytter.
Ultralydsbaseret lysering og ekstraktion: Fermentering af komplekse HMO’er kan være begrænset af lave fermenteringstitre og af, at produkterne forbliver intracellulære. Ultralydsbaseret lysering og ekstraktion bruges til at frigøre intracellulært materiale før oprensning og efterfølgende procestrin.

Ultralydsfremmet fermentering

Væksthastigheden hos mikrober såsom Escherichia coli, genetisk konstruerede E.coli, Saccharomyces cerevisiae og Lactococcus lactis kan øges ved at øge masseoverførselshastigheden og cellevæggens permeabilitet gennem kontrolleret lavfrekvent ultralydsbehandling. Som en skånsom, ikke-termisk behandlingsteknik tilfører ultralydsbehandling udelukkende mekaniske kræfter til fermenteringsvæsken.
Akustisk kavitation: Sonikeringens virkemåde er baseret på akustisk kavitation. Ultralydssonden (sonotroden) kobler lavfrekvente ultralydsbølger ind i mediet. Ultralydsbølgerne bevæger sig gennem væsken og skaber skiftende højtryks- (kompression) / lavtrykscyklusser (ekspansion). Ved at komprimere og strække væsken i skiftende cyklusser opstår der meget små vakuumbobler. Disse små vakuumbobler vokser over flere cyklusser, indtil de når en størrelse, hvor de ikke kan absorbere yderligere energi. Ved denne maksimale størrelse imploderer vakuumboblen voldsomt og skaber lokalt ekstreme forhold, kendt som fænomenet kavitation. I kavitationens ”hotspot” kan der observeres store tryk- og temperaturforskelle og intense forskydningskræfter med væskestråler på op til 280m/sec. Disse kavitationseffekter medfører omfattende masseoverførsel og sonoporation (perforering af cellevægge og cellemembraner). Substratets næringsstoffer transporteres hen til og ind i de levende, hele celler, så cellefabrikkerne forsynes optimalt med næring, og både vækst- og omdannelseshastighederne øges. Ultralydsbioreaktorer er en enkel, men yderst effektiv strategi til behandling af biomasse i en biosynteseproces i én beholder.
Præcist kontrolleret, skånsom sonikering er velkendt for at intensivere fermenteringsprocesser.
Sonikering forbedrer ”produktiviteten i mange bioprocesser, der involverer levende celler, ved at forbedre substratoptagelsen, øge produktionen eller væksten gennem øget celleporøsitet og potentielt øge frigivelsen af cellekomponenter.” (Naveena et al. 2015)
Læs mere om ultralydsassisteret fermentering!

Naveena et al. (2015) fandt, at ultralydsintensivering giver flere fordele under bioprocessering, herunder lave driftsomkostninger sammenlignet med andre behandlingsmuligheder til procesforbedring, enkel betjening og beskedne effektbehov.

Højtydende ultralydsreaktorer til fermentering

Fermenteringsprocesser involverer levende mikroorganismer såsom bakterier eller gær, der fungerer som cellefabrikker. Når sonikering anvendes til at fremme masseoverførslen og øge mikroorganismernes vækst- og omdannelseshastighed, er det afgørende at styre ultralydsintensiteten præcist for at undgå ødelæggelse af cellefabrikkerne.
Hielscher Ultrasonics er specialist i at designe, fremstille og distribuere højtydende ultralydsapparater, som kan styres og overvåges præcist for at sikre overlegne fermenteringsudbytter.

Processtyring er ikke kun afgørende for høje udbytter og overlegen kvalitet, men gør det også muligt at gentage og reproducere resultater. Især når det gælder stimulering af cellefabrikker, er cellespecifik tilpasning af sonikeringsparametrene afgørende for at opnå høje udbytter og forhindre cellenedbrydning. Derfor er alle digitale modeller af Hielschers ultralydsapparater udstyret med intelligent software, som giver dig mulighed for at justere, overvåge og revidere sonikeringsparametre. Ultralydsprocesparametre såsom amplitude, temperatur, tryk, sonikeringsvarighed, driftscyklusser og energitilførsel er afgørende for at fremme HMO-produktion via fermentering.
Den intelligente software i Hielschers ultralydsapparater registrerer automatisk alle vigtige procesparametre på det integrerede SD-kort. Den automatiske dataregistrering af sonikeringsprocessen er grundlaget for processtandardisering og reproducerbarhed / repeterbarhed, som er påkrævet i henhold til god fremstillingspraksis (GMP).

Ultralydsreaktorer til fermentering

Hielscher tilbyder ultralydssonder i forskellige størrelser, længder og geometrier, som kan bruges til både batchbehandling og kontinuerlig gennemstrømningsbehandling. Ultralydsreaktorer, også kendt som sonobioreaktorer, fås til ethvert volumen og dækker ultralydsbaseret bioprocessering fra små laboratorieprøver til pilotproduktion og fuldt kommerciel produktion.
Det er velkendt, at ultralydssonotrodens placering i reaktionsbeholderen påvirker fordelingen af kavitation og mikrostrømninger i mediet. Sonotrode og ultralydsreaktor bør vælges i overensstemmelse med det volumen cellevæske, der skal behandles. Selvom sonikering kan udføres både som batchbehandling og kontinuerligt, anbefales brugen af et anlæg med kontinuerlig gennemstrømning til store produktionsvolumener. Når hele cellemediet passerer gennem en ultralydsflowcelle, udsættes det for præcis den samme sonikering, hvilket sikrer den mest effektive behandling. Hielscher Ultrasonics’ brede udvalg af ultralydssonder og flowcellereaktorer gør det muligt at sammensætte den ideelle opstilling til ultralydsbaseret bioprocessering.

Hielscher Ultrasonics – Fra laboratorium til pilotproduktion og produktion

Hielscher Ultrasonics dækker hele spektret af ultralydsudstyr og tilbyder alt fra kompakte, håndholdte ultralydshomogenisatorer til prøveforberedelse til bord- og pilotsystemer samt kraftige industrielle ultralydsenheder, som nemt behandler hele lastbillæs i timen. Med alsidige og fleksible installations- og monteringsmuligheder kan Hielschers ultralydsapparater nemt integreres i alle typer batchreaktorer, fed-batch-systemer eller opstillinger med kontinuerlig gennemstrømning.
Forskelligt tilbehør samt specialtilpassede dele muliggør en ideel tilpasning af din ultralydsopstilling til dine proceskrav.
Hielschers ultralydsprocessorer er bygget til drift 24/7 under fuld belastning og intensiv brug under krævende forhold, er pålidelige og kræver kun begrænset vedligeholdelse.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: