Peptidsyntese i fast fase – Mere effektivt med ultralydsbehandling
Fastfasepeptidsyntese (SPPS) er den almindelige metode til peptidsyntese. Ultralydbehandling er et pålideligt værktøj til at intensivere peptidsyntese i fast fase, hvilket resulterer i højere udbytter, forbedret renhed, ingen racemisering og betydeligt accelereret reaktionshastighed. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til peptidsyntese, spaltning og opløsning.
Ultralydsbaseret peptidsyntese i fast fase
Ultralydbehandling anvendes allerede i vid udstrækning som intensiverende metode i organisk syntese og er kendt for sine fordele såsom drastisk reducerede reaktionstider, højere udbytter, mindre biprodukter, initiering af veje, som ikke kunne opnås på andre måder, og / eller bedre selektivitet. Store fordele kan også opnås, når sonikering er koblet til peptidsyntesereaktioner. Forskningsresultater har vist, at ultralydassisteret peptidsyntese opnår optimeret udbytte af peptider med høj renhed uden racemisering inden for en kort reaktionstid.
- Høje peptidudbytter
- Betydeligt hurtigere syntese
- Højere peptidrenhed
- Ingen racemisering
- Parallel syntese af forskellige peptider
- Kan skaleres til ethvert volumen
Ultralyd cuphorn til ensartet sonikering af flere reaktorbeholdere for forbedret peptidsyntese.
Illustration, der viser Merrifield-metoden til peptidsyntese i fast fase. Ultralyd anvendes til at fremme og forbedre syntesereaktionen samt til at frigøre de syntetiserede peptider fra harpiksen.
Grafik: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Undersøgelse | Undersøgte peptider | Reaktionstid (klassisk vs. US-SPPS) | Råoliens renhed (klassisk vs. US-SPPS) | Racemisering og bivirkninger | De vigtigste pointer |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański m.fl. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH₂, B2m58-69-NH₂, ACP65-74-NH₂, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | Der blev ikke observeret nogen for Cys/His, selv ikke ved 70 °C | ~7–12 gange hurtigere syntese; betydelige forbedringer i renheden, især for sekvenser, der har tendens til at danne aggregater, såsom TAT. |
| Silva m.fl. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (kun i USA) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Ikke testet; der er konstateret et let fald i renheden af Pep2 | 14 gange hurtigere for Pep1; det rå udbytte steg markant. |
| Merlino m.fl. (2019) | Modelpentapeptider, peptider op til 44-mer, “svære sekvenser” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84 % → 93 % (model); markant højere end ved termisk opvarmning (~45 °C) | Ingen signifikant stigning for Cys/His-enantiomererne | Særdeles effektiv til vanskelige sekvenser eller sekvenser, der har tendens til at klumpe sig sammen; muliggør anvendelse af mindre mængder reagens med bevarelse af høj renhed. |
Fastfasepeptidsyntese forbedret med ultralyd
Fastfasepeptidsyntese (SPPS) er en kemisk reaktion, der tillader samling af en peptidkæde gennem successive reaktioner af aminosyrederivater på en uopløselig porøs støtte. Den traditionelle fastfasepeptidsyntese er dog en relativt ineffektiv og langsom proces. Derfor er ultralydsintensivering af peptidsyntese et højt anset værktøj til en mere effektiv og hurtig syntese af peptider.
Silva m.fl. (2021) sammenlignede “klassisk” fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-peptidsyntese i fast fase (SPPS) med ultralyd (US)-assisteret SPPS baseret på fremstillingen af tre peptider, nemlig det fibroblastvækstfaktorreceptor 3 (FGFR3)-specifikke peptid Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) og de nye peptider Pep2 (RQMATADEA-NH2) og Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS med hjælp fra USA medførte en 14-fold (Pep1) og 4-fold tidsbesparelse (Pep2) i peptidsamlingen sammenlignet med “klassisk” metode. Interessant nok gav ultralydsassisteret SPPS Pep1 i højere renhed (82 %) end den “klassisk” SPPS (73 %). Den betydelige tidsbesparelse kombineret med den opnåede høje renhed af det rå peptid fik forskerteamet til at anvende ultralydsassisteret SPPS på det store peptid Pep3, som indeholder et stort antal hydrofobe aminosyrer og homooligosekvenser. Bemærkelsesværdigt nok blev syntesen af dette 25-mer-peptid gennemført på mindre end 6 timer (347 minutter) med moderat renhed (ca. 49 %).
Hurtigere peptidsyntese via fastfasepeptidsyntese ved hjælp af ultralydomrøring.
(Undersøgelse og analyse: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) gennemførte ligeledes en omfattende undersøgelse af ultralydets indvirkning på Fmoc-baseret peptidsyntese i fast fase, hvilket muliggjorde syntesen af forskellige biologisk aktive peptider (op til 44-mer) med en bemærkelsesværdig besparelse i både materiale og reaktionstid. De påviste, at ultralydsbehandlingen ikke forværrede de vigtigste bivirkninger og forbedrede syntesen af peptider med “svære sekvenser”, hvilket placerer den ultralydsfremmede fastfasepeptidsyntese (US-SPPS) blandt de nuværende højeffektive peptidsyntetiske strategier.
Tilgængeligheden af højtydende systemer til ultralyd (sonisk) syntese af peptider giver mulighed for betydeligt forbedrede syntesehastigheder og en stigning i renheden af råvarer. (jf. Wołczański et al., 2019)
Undersøgelsen af racemisering. Sammenligning af signifikante 1H NMR-spektre af modelpeptider syntetiseret manuelt ved hjælp af den klassiske tilgang ved stuetemperatur vs ultralydsmetode ved forhøjet temperatur. Kemiske skift af His og Cys α-protoner og methylengruppe af Acm (venstre paneler), ɣ-methylprotoner af Val (højre paneler) viser, at sonikering ved 70 °C ikke forårsager racemisering.
(Undersøgelse og analyse: Wołczański et al., 2019)
Ultralydspaltning af peptider
Efter fastfasepeptidsyntese (SPPS) skal syntetiserede peptider spaltes fra polymerharpikserne. Dette trin er også kendt som deprotection. Når almindelig rystning og ultralydbehandling for peptidspaltning fra harpiks sammenlignes, kræver rystemetoden ca. 1 time, mens ultralydspaltning kan udføres på 15 til 20 minutter. Ultralydspeptidspaltningen kan påføres spaltningen af beskyttede aminosyrer og peptider bundet til polystyrenharpikser gennem benzylesterbindinger.
Ultralydspaltning af peptider fra polystyrenharpiks giver høje udbytter af peptider i høj renhed uden racemisering inden for en hurtig procedure.
(studie og grafik: ©Anuradha og Ravindranath, 1995)
Ultralydomrørt reaktor til forbedret og accelereret peptidsyntese. Billedet viser ultralydsapparat UP200St i en omrørt glasreaktor.
Højtydende ultralydapparater til peptidsyntese
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til direkte og indirekte sonikering. Kraftige og præcist kontrollerbare ultralydsprocessorer leverer nøjagtig den rigtige mængde ultralydsenergi til reaktionsbeholderen. Uanset om du bruger sprøjter, rør, multi-brøndplader eller glasreaktorer som syntesebeholder, tilbyder Hielscher Ultrasonics den bedst egnede ultralydsapparat til din peptidapplikation.
- Tilpassede peptider
- storstilet peptidproduktion
- Peptid biblioteker
Mange peptidsynteser udføres i sprøjter (f.eks. frittede sprøjtereaktorer). Hielschers ultralydssprøjteomrører sonikerer peptidopløsningen, der kobler ultralydsbølgerne gennem sprøjtevæggen ind i væsken. Ultralydssprøjteomrøreren er en af de mest populære ultralydsløsninger til ultralydsassisteret syntese af peptider.
Ultralydskophornet er et velegnet værktøj til at sonikere op til 5 reaktorbeholdere, mens VialTweeter kan rumme op til ti reaktionsrør plus yderligere fem større beholdere via clamp-on tilbehør.
Til andre reaktortyper, såsom Merrifield- eller Kamysz-fastfase-reaktorer samt andre beholdere og reaktorer af polypropylen eller borosilikat, tilbyder Hielscher sonikatorer til indirekte og direkte sonikering med skræddersyet klemmefastgørelse eller flange.
Større omrørte glasreaktorer, f.eks. til syntese i opløsningsfase, kan naturligvis nemt udstyres med ultralydssonder (også kaldet sonotroder eller ultralydshorn) i alle størrelser.
- forskellige ultralydstyper
- Direkte og indirekte sonikering
- Præcis intensitetskontrol
- Præcis temperaturkontrol
- kontinuerlig eller pulserende ultralyd
- Smarte funktioner, programmerbare enheder
- tilgængelig for enhver diskenhed
- lineær skalerbarhed
Til peptidsyntese i fast fase i multi-well-/mikrotiterplader er UIP400MTP det ideelle apparat. Ultralydskavitation overføres indirekte og jævnt til de mange prøvebrønde, hvilket sikrer optimal masseoverførsel og syntesereaktion. Se videoen nedenfor for at se, hvordan Mikroplade-sonikatoren UIP400MTP i aktion!
Kontakt os! / Spørg os!
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer til blandingsapplikationer, dispersion, emulgering og ekstraktion i laboratorie-, pilot- og industriel skala.
Værd at vide om ultralydsbaseret peptidsyntese
Hvad er peptider?
Peptider er forbindelser, hvor flere aminosyrer er forbundet via amidbindinger, såkaldte peptidbindinger. Når de er bundet i komplekse strukturer – Disse store peptidstrukturer består typisk af 50 eller flere aminosyrer - og kaldes proteiner. Peptider er en vigtig byggesten i livet og opfylder adskillige funktioner i kroppen.
Hvordan fungerer peptidsyntese?
I organisk kemi, molekylærbiologi og biovidenskab er peptidsyntese processen med at producere peptider. Peptider syntetiseres kemisk via kondensationsreaktion af carboxylgruppen af en aminosyre til aminogruppen af en anden aminosyre. Beskyttelsesgrupper (også beskyttende grupper) strategier bruges normalt for at undgå uønskede bivirkninger med de forskellige aminosyresidekæder.
Kemisk (in-vitro) peptidsyntese starter oftest med at koble carboxylgruppen af den indkommende aminosyre (C-terminal) til N-terminalen af den voksende peptidkæde. I modsætning til denne C-til-N-syntese sker naturlig proteinbiosyntese af lange peptider i levende organismer i den modsatte retning. Det betyder, at i biosyntese er N-terminalen af den indkommende aminosyre forbundet med C-terminalen af proteinkæden (N-til-C).
De fleste forsknings- og udviklingsprotokoller for peptidsyntese er baseret på fastfasemetoder, mens opløsningsfasesyntesemetoder kan findes i storskala industriel produktion af peptider.
Hvad er den aktuelle stand af teknikken inden for peptidsyntese?
SUS-SPPS (Bæredygtig ultralydsassisteret SPPS) Det er påvist, at denne metode reducerer processen til blot to trin pr. cyklus (kombineret kobling/capping/afbeskyttelse + en enkelt skylning), hvilket medfører en betydelig reduktion i forbruget af opløsningsmidler og den tid, der kræves. (jf. Mottola et al., 2025)
Ultralydsassisteret TAPS er en ny kombination, der har vist sig at være en succes inden for totalsyntese (f.eks. lipobactin), og som i øjeblikket undersøges af CDMO’er med henblik på fremstilling af aktive lægemiddelstoffer (API).
Oplev fordelene ved ultralydsassisteret TAGGING-peptidsyntese!
Kontinuerlig behandling undersøges som en yderligere forbedring – Der er beskrevet platforme til kontinuerlig one-pot-syntese med silylerede tag-markører.
Faget bevæger sig i retning af principperne for grøn kemi, hvor både ultralyd og TAPS bidrager til et reduceret forbrug af opløsningsmidler, lavere reagensforbrug og øget bæredygtighed.
Litteratur / Referencer
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.