Fastfasepeptidsyntese – mere effektiv med sonikering
Fastfasepeptidsyntese (SPPS) er den almindelige metode til peptidsyntese. Ultralydsbehandling er et pålideligt værktøj til at intensivere fastfasepeptidsyntese, hvilket resulterer i højere udbytter, forbedret renhed, ingen racemisering og en betydeligt øget reaktionshastighed. Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til peptidsyntese, spaltning og opløsning.
Ultralydsbaseret fastfasepeptidsyntese
Ultralydsbehandling anvendes allerede i vid udstrækning som intensiveringsmetode i organisk syntese og er velkendt for sine fordele såsom drastisk reducerede reaktionstider, højere udbytter, færre biprodukter, igangsættelse af reaktionsveje, som ikke kunne opnås på andre måder, og/eller bedre selektivitet. Der kan også opnås store fordele, når sonikering kobles ind i peptidsyntesereaktioner. Forskningsresultater har vist, at ultralydsassisteret peptidsyntese opnår et optimeret udbytte af peptider med høj renhed uden racemisering inden for en kort reaktionstid.
- Høje peptidudbytter
- Betydeligt hurtigere syntese
- Højere peptidrenhed
- Ingen racemisering
- Parallel syntese af forskellige peptider
- Skalerbar til ethvert volumen
Ultralyds-cuphorn til ensartet sonikering af flere reaktionsbeholdere for forbedret peptidsyntese.
Grafik, der viser Merrifields fastfasepeptidsyntese. Ultralydsbehandling bruges til at fremme og forbedre syntesereaktionen samt til at spalte de syntetiserede peptider fra resinen.
Grafik: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studie | Undersøgte peptider | Reaktionstid (klassisk metode vs. US-SPPS) | Råproduktets renhed (klassisk metode vs. US-SPPS) | Racemisering og sidereaktioner | Vigtigste konklusioner |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Ingen observeret for Cys/His, selv ved 70°C | ~7–12x hurtigere syntese; store forbedringer af renheden, især for sekvenser med tendens til aggregering såsom TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (kun US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Ikke undersøgt; et mindre fald i renheden af Pep2 blev bemærket | 14x reduktion af tidsforbruget for Pep1; råudbytterne steg betydeligt. |
| Merlino et al. (2019) | Modelpentapeptider, peptider op til 44-mer, “vanskelige sekvenser” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); betydeligt højere end ved termisk opvarmning (~45°C) | Ingen signifikant stigning for Cys/His-enantiomerer | Meget effektiv til vanskelige sekvenser og sekvenser med tendens til aggregering; muliggør et reduceret reagensoverskud, samtidig med at høj renhed opretholdes. |
Fastfasepeptidsyntese forbedret med ultralyd
Fastfasepeptidsyntese (SPPS) er en kemisk reaktion, der gør det muligt at opbygge en peptidkæde gennem successive reaktioner af aminosyrederivater på et uopløseligt, porøst bæremateriale. Traditionel fastfasepeptidsyntese er dog en relativt ineffektiv og langsom proces. Derfor er ultralydsintensivering af peptidsyntese et højt anset værktøj til en mere effektiv og hurtig syntese af peptider.
Silva et al. (2021) sammenlignede “klassisk” fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-fastfasepeptidsyntese (SPPS) med ultralyds (US)-assisteret SPPS på grundlag af fremstillingen af tre peptider, nemlig peptidet Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), der er specifikt for fibroblastvækstfaktorreceptor 3(FGFR3), og de nye peptider Pep2 (RQMATADEA-NH2) og Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
US-assisteret SPPS medførte en 14-fold (Pep1) og 4-fold reduktion af tidsforbruget (Pep2) ved opbygning af peptiderne sammenlignet med den “klassiske” metode. Interessant nok gav ultralydsassisteret SPPS Pep1 med højere renhed (82%) end “klassisk” SPPS (73%). Den betydelige reduktion af tidsforbruget kombineret med den opnåede høje renhed af råpeptiderne fik forskerholdet til at anvende US-assisteret SPPS på det store peptid Pep3, som indeholder et højt antal hydrofobe aminosyrer og homooligomere sekvenser. Bemærkelsesværdigt nok blev syntesen af dette 25-mer-peptid gennemført på mindre end 6 timer (347 min) med moderat renhed (ca. 49%).
Hurtigere peptidsyntese via fastfasepeptidsyntese med ultralydsomrøring.
(Studie og analyse: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) gennemførte også en omfattende undersøgelse af ultralydens virkninger på Fmoc-baseret fastfasepeptidsyntese, som muliggjorde syntese af forskellige biologisk aktive peptider (op til 44-mer) med en bemærkelsesværdig besparelse på materiale og reaktionstid. De viste, at ultralydsbehandling ikke forværrede de vigtigste sidereaktioner og forbedrede syntesen af peptider med “vanskelige sekvenser”, hvilket placerer ultralydsfremmet fastfasepeptidsyntese (US-SPPS) blandt de nuværende højeffektive strategier til peptidsyntese.
Tilgængeligheden af højtydende systemer til ultralydsbaseret (sonisk) syntese af peptider muliggør betydeligt forbedrede syntesehastigheder og en øget renhed af råprodukterne. (jf. Wołczański et al., 2019)
Undersøgelse af racemisering. Sammenligning af væsentlige 1H NMR-spektre af modelpeptider syntetiseret manuelt med den klassiske fremgangsmåde ved stuetemperatur og med ultralydsmetoden ved forhøjet temperatur. De kemiske skift for His- og Cys-α-protoner og Acm-methylengruppen (venstre paneler) samt Vals ɣ-methylprotoner (højre paneler) viser, at sonikering ved 70°C ikke forårsager racemisering.
(Studie og analyse: Wołczański et al., 2019)
Ultralydsbaseret spaltning af peptider
Efter fastfasepeptidsyntese (SPPS) skal de syntetiserede peptider spaltes fra de polymere resiner. Dette trin kaldes også afbeskyttelse. Når almindelig rystning og ultralydsbehandling til spaltning af peptider fra resin sammenlignes, kræver rystemetoden ca. 1 time, mens ultralydsbaseret spaltning kan gennemføres på 15 til 20 min. Ultralydsbaseret peptidspaltning kan anvendes til spaltning af beskyttede aminosyrer og peptider, der er bundet til polystyrenresiner via benzylesterbindinger.
Ultralydsbaseret spaltning af peptider fra polystyrenresin giver høje udbytter af peptider med høj renhed, uden racemisering, ved en hurtig procedure.
(studie og grafik: ©Anuradha og Ravindranath, 1995)
Reaktor med ultralydsomrøring til forbedret og accelereret peptidsyntese. Billedet viser ultralydsapparatet UP200St i en omrørt glasreaktor.
Højtydende ultralydsapparater til peptidsyntese
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsløsninger til direkte og indirekte sonikering. Kraftige ultralydsprocessorer, som kan styres præcist, tilfører reaktionsbeholderen nøjagtigt den rette mængde ultralydsenergi. Uanset om du bruger sprøjter, rør, multibrøndsplader eller glasreaktorer som syntesebeholder, tilbyder Hielscher Ultrasonics det bedst egnede ultralydsapparat til din peptidanvendelse.
- skræddersyede peptider
- peptidproduktion i stor skala
- peptidbiblioteker
Mange peptidsynteser udføres i sprøjter (f.eks. sprøjtereaktorer med fritte). Ultralydsomrøreren til sprøjter fra Hielscher sonikerer peptidopløsningen ved at koble ultralydsbølgerne gennem sprøjtevæggen ind i væsken. Ultralydsomrøreren til sprøjter er en af de mest populære ultralydsløsninger til ultralydsassisteret syntese af peptider.
Et cuphorn til ultralyd er et velegnet værktøj til sonikering af op til 5 reaktionsbeholdere, mens VialTweeter kan rumme op til ti reaktionsrør plus yderligere fem større beholdere ved hjælp af klemmetilbehør.
Til andre reaktortyper såsom fastfasereaktoren Merrifield eller Kamysz og andre beholdere og reaktorer af polypropylen eller borosilikat tilbyder Hielscher sonikeringsapparater til indirekte og direkte sonikering med skræddersyet klemmefastgørelse eller flange.
Større omrørte glasreaktorer, f.eks. til syntese i opløsningsfase, kan naturligvis nemt udstyres med ultralydssonder (også kaldet sonotroder eller ultralydshorn) i enhver størrelse.
- forskellige typer ultralydsapparater
- direkte og indirekte sonikering
- præcis intensitetsstyring
- præcis temperaturstyring
- kontinuerlig eller pulseret ultralyd
- smarte funktioner, programmerbare apparater
- tilgængelige til ethvert volumen
- lineær skalerbarhed
Til fastfasepeptidsyntese i multibrønds-/mikrotiterplader er UIP400MTP det ideelle apparat. Ultralydskavitation kobles indirekte og ensartet ind i de mange prøvebrønde for at opnå overlegen masseoverførsel og syntesereaktion. Se videoen nedenfor for at se sonikeringsapparatet til mikroplader UIP400MTP i aktion!
Kontakt os! / Spørg os!
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer til blandingsopgaver, dispergering, emulgering og ekstraktion i laboratorie-, pilot- og industriskala.
Værd at vide om ultralydsbaseret peptidsyntese
Hvad er peptider?
Peptider er forbindelser, hvor flere aminosyrer er forbundet via amidbindinger, såkaldte peptidbindinger. Når de er bundet i komplekse strukturer – typisk bestående af 50 eller flere aminosyrer – kaldes disse store peptidstrukturer proteiner. Peptider er en essentiel byggesten for liv og udfører talrige funktioner i kroppen.
Hvordan fungerer peptidsyntese?
Inden for organisk kemi, molekylærbiologi og biovidenskab er peptidsyntese processen, hvor peptider fremstilles. Peptider syntetiseres kemisk via en kondensationsreaktion mellem carboxylgruppen i en aminosyre og aminogruppen i en anden aminosyre. Strategier med beskyttelsesgrupper anvendes normalt for at undgå uønskede sidereaktioner med de forskellige aminosyresidekæder.
Kemisk (in vitro) peptidsyntese starter oftest med at koble carboxylgruppen i den indkommende aminosyre (C-terminus) til N-terminus i den voksende peptidkæde. I modsætning til denne C-til-N-syntese foregår den naturlige proteinbiosyntese af lange peptider i levende organismer i den modsatte retning. Det betyder, at N-terminus i den indkommende aminosyre ved biosyntese forbindes med C-terminus i proteinkæden (N-til-C).
De fleste forsknings- og udviklingsprotokoller til peptidsyntese er baseret på fastfasemetoder, mens syntesemetoder i opløsningsfase anvendes ved industriel produktion af peptider i stor skala.
Hvad er det nuværende teknologiske stade inden for peptidsyntese?
SUS-SPPS (bæredygtig ultralydsassisteret SPPS) har vist sig at reducere processen til kun to trin pr. cyklus (kombineret kobling/capping/afbeskyttelse + én vask), hvilket reducerer forbruget af opløsningsmiddel og tidsforbruget betydeligt. (jf. Mottola et al., 2025)
Ultralydsassisteret TAPS er en kombination under udvikling med dokumenteret succes i totalsynteser (f.eks. lipobactin) og undersøges af CDMO’er til fremstilling af API’er.
Opdag fordelene ved ultralydsassisteret TAGGING-peptidsyntese!
Kontinuerlig processering undersøges som en yderligere forbedring – platforme til silyleret tag-assisteret kontinuerlig one-pot-syntese er blevet beskrevet.
Området bevæger sig mod principperne for grøn kemi, hvor både ultralyd og TAPS bidrager til reduceret brug af opløsningsmidler, lavere reagensforbrug og forbedret bæredygtighed.
Litteratur / Referencer
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra laboratoriestørrelse til industristørrelse.