Proteomiske arbejdsgange med proteinnedbrydning ved høj prøvekapacitet

Proteomik er et essentielt fagområde for forståelsen af biologiske processer og systemer, og proteinnedbrydning udgør et afgørende trin i de proteomiske arbejdsgange. Traditionelt udføres proteinnedbrydning i opløsning ved hjælp af proteolytiske enzymer som trypsin, der specifikt hydrolyserer peptidbindinger ved lysin- og argininrester. Denne proces danner peptider, der er velegnede til ionisering og fragmentering i anvendelser inden for massespektrometri (MS). Konventionelle nedbrydningsmetoder kræver imidlertid 12–24 timer for at opnå fuldstændig nedbrydning, hvilket skaber betydelige flaskehalse i proteomiske arbejdsgange.
Sonikering tilbyder et effektivt alternativ, der drastisk forkorter nedbrydningstiden fra timer til blot få minutter. Kombineret med avancerede sonikeringsapparater til flere prøver, såsom Hielscher CupHorn, VialTweeter og sonikeringsapparatet UIP400MTP til plader med 96 brønde, muliggør sonikering accelereret proteomik med høj prøvekapacitet. Disse teknologier strømliner arbejdsgangene, reducerer prøveforberedelsestiden og øger effektiviteten uden at gå på kompromis med reproducerbarhed eller datakvalitet.

Ultralydsenergiens rolle i proteinnedbrydning

Sonikering anvender fokuserede ultralydsbølger til at skabe kavitation – lokale mikrobobler, der kollapser og danner kraftige forskydningskræfter. Dette fænomen forbedrer masseoverførslen, fremmer blandingen af enzymer med substrater og udfolder proteinstrukturer, så spaltningssteder blotlægges for proteolytiske enzymer som trypsin.
Resultatet? En betydelig reduktion af nedbrydningstiden uden at gå på kompromis med effektivitet eller reproducerbarhed.

Ultralydsforstærket proteolytisk nedbrydning: Metodik og resultater

Protokol for accelereret nedbrydning

Ultralydsassisteret nedbrydning kombinerer proteolytiske enzymer og ultralydsenergi for at fremskynde arbejdsgangene. Ved brug af eksempelvis Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) forløber nedbrydningen således:

1. Reduktion: Proteinprøver (0,5 mg/mL, 20 µL) behandles med DTT (2 µL, 110 mM) i ammoniumhydrogencarbonatbuffer (12,5 mM). Sonikering anvendes ved 50% amplitude i 5 minutter.
2. Alkylering: Efter tilsætning af IAA (2 µL, 400 mM) gentages sonikeringen under de samme betingelser.
3. Nedbrydning: Prøverne fortyndes og inkuberes med nanopartikler med immobiliseret trypsin. En afsluttende sonikering (5 minutter) fuldender nedbrydningen. Peptiderne adskilles, tørres og opbevares til analyse med MS.

Denne ultralydsmetode reducerer den samlede forberedelsestid fra 12 timer til under 30 minutter. Trods den accelererede proces svarer peptidudbytte og -kvalitet fortsat til resultaterne fra traditionelle metoder med inkubation natten over.

Effektiviteten af proteinnedbrydning med ultralyd

I sammenlignende studier med E. coli-proteomer:

• Proteinidentifikation: I prøver nedbrudt med ultralyd blev der identificeret 777 proteiner på 5 minutter sammenlignet med 817 på 12 timer. Andelen af fælles proteinidentifikationer oversteg 70%.
• Reproducerbarhed: Gentagne analyser viste korrelationsværdier over 98% inden for hver metode, hvilket demonstrerer pålideligheden.
• Selektivitet: Hver metode nedbrød visse proteiner fortrinsvis, idet nedbrydning med ultralyd favoriserede 65 proteiner og nedbrydning natten over 54 proteiner. Sådanne nuancerede forskelle understreger sonikeringens unikke potentiale til specifikke anvendelser.

Resultater af mærkningsfri proteinkvantificering af syv proteiner tilsat en E. coli-
prøve. Følgende proteiner blev tilsat på to forskellige niveauer som angivet i kolonnen
med navnet “Theo Ratio”. Theo Ratio er det teoretiske forhold mellem de to niveauer anvendt i dette
forsøg. Bovint serumalbumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1-kasein (CASA1),
α-S2-kasein (CASA2), cytokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) og carbonanhydrase 2
(CAH2). Forholdene blev beregnet ved hjælp af LFQ-proteinintensiteter opnået fra MaxQuant-
analyse. Students t-test blev anvendt til at sammenligne værdierne opnået med hver metode (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Studie og grafik: © Martins et al., 2019)

Trypsin immobiliseret på nanopartikler

Kombinationen af nanopartikler med immobiliseret trypsin (f.eks. T-FMNPs) og sonikering forbedrer proteomiske arbejdsgange yderligere. Disse nanopartikler giver et stort overfladeareal til enzym-substrat-interaktioner, hvilket øger effektiviteten. Ved anvendelse på komplekse proteomer, såsom E. coli-proteomer, opnår den kombinerede metode:

• Hastighed: Fuldstændig nedbrydning inden for 5 minutter.
• Nøjagtighed: Proteinkvantificering, der er sammenlignelig med traditionelle metoder (p > 0,01, n=3).
• Skalerbarhed: Tilpasning til multibrøndplatforme som UIP400MTP muliggør behandling med høj prøvekapacitet.

Klik her for den detaljerede protokol med trinvise instruktioner!
(jf. Martins et al., 2019)

Proteolytisk nedbrydning ved høj hastighed og med høj prøvekapacitet med sonikeringsapparater fra Hielscher

De bedste modeller af sonikeringsapparater til proteomik

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige modeller af sonikeringsapparater til samtidig forberedelse af flere prøver, hvilket understøtter arbejdsgange med høj prøvekapacitet. Uanset om du arbejder med hætteglas, reagensglas, multibrøndplader (f.eks. plader med 6, 24 eller 96 brønde) eller petriskåle – tilbyder vi de ideelle sonikeringsapparater til dine forsøg.

Sonikeringsapparat UIP400MTP til multibrøndplader

For maksimal prøvekapacitet giver UIP400MTP mulighed for at behandle plader med 96 brønde med ultralyd. UIP400MTP er kompatibel med enhver standardmikroplade, kræver ingen dyre producentspecifikke engangsartikler og giver dig frihed til at vælge den bedste multibrøndplade til din forskning. Ved at tilføre ensartet energi over hele pladen muliggør apparatet hurtig reduktion, alkylering og nedbrydning af op til 200 komplekse proteomer på blot 1 time. Dette niveau af automatisering og effektivitet er afgørende for proteomik med høj prøvekapacitet og kliniske anvendelser. Læs mere om sonikeringsapparatet til multibrøndplader!

VialTweeter

VialTweeter er skræddersyet til laboratorier, der har behov for samtidig sonikering af op til 10 hætteglas eller reagensglas. Dets ikke-invasive tilgang eliminerer risikoen for krydskontaminering og sikrer samtidig reproducerbar proteinnedbrydning. Dette apparat er ideelt til forskere, der arbejder med begrænsede prøvevolumener eller forskellige prøvetyper.
Læs mere om sonikeringsapparatet VialTweeter til flere prøverør!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikeringsapparatet CupHorn er et kraftfuldt apparat, der er udviklet til samtidig behandling af flere prøver i lukkede beholdere. Det sikrer ensartet fordeling af ultralydsenergi og præcis temperaturstyring. Muligheden for at behandle op til fem prøver samtidig, kombineret med dets kompatibilitet med arbejdsgange, der omfatter reduktion, alkylering og nedbrydning, gør CupHorn til et pålideligt værktøj til proteomik baseret på MS.
Læs mere om CupHorn SonoReactor!

Trinvis protokol for sonikeringsassisteret proteolytisk nedbrydning med trypsin immobiliseret på nanopartikler

Denne protokol af Martins et al. (2019) er optimeret til hurtig proteinnedbrydning ved hjælp af ultralydsenergi og trypsin immobiliseret på nanopartikler (T-FMNPs). De beskrevne trin sikrer effektiv reduktion, alkylering og proteolyse, der er egnet til anvendelser inden for massespektrometri (MS).
Protokollens trin

1. Reduktion af disulfidbindinger
   • Tilsæt 2 µL DTT-opløsning (110 mM) til proteinprøven på 20 µL (0,5 mg/mL) i AmBic-buffer.
   • Anbring prøverøret i sonoreaktoren UP200St-CupHorn.
   • Sonikér prøven i 2,5 minutter ved 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Hold en kort pause for at muliggøre afkøling, og sonikér derefter i yderligere 2,5 minutter under de samme betingelser.
2. Alkylering af reducerede cysteinrester
   • Tilsæt 2 µL IAA-opløsning (400 mM) til den reducerede proteinprøve.
   • Sonikér i 2,5 minutter ved 50% amplitude for at fremme alkyleringen.
   • Hold en pause for at afkøle prøven, og sonikér derefter i yderligere 2,5 minutter.

   Bemærk: Begræns den alkylerede prøves eksponering for lys for at forhindre nedbrydning af IAA.

3. Fortynding af prøven
   • Fortynd den alkylerede proteinprøve til et slutvolumen på 100 µL med 25 mM AmBic-buffer, der indeholder 4% acetonitril (v/v).
   • Bland grundigt ved forsigtig pipettering.
4. Proteolytisk nedbrydning med trypsin immobiliseret på nanopartikler
   • Tilsæt 20 µL T-FMNP-opløsning (3 mg/mL) til den fortyndede proteinprøve.
   • Sonikér blandingen i sonoreaktoren i 2,5 minutter ved 50% amplitude.
   • Hold en pause for at afkøle prøven, og sonikér derefter i yderligere 2,5 minutter under de samme betingelser.
5. Adskillelse af nanopartikler med trypsin
   • Brug en magnet til at adskille T-FMNPs fra supernatanten, der indeholder peptiderne fra nedbrydningen.
   • Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
6. Forberedelse af peptider til analyse med MS
   • Tør supernatanten, der indeholder peptider, i en vakuumcentrifuge.
   • Opbevar de tørrede peptider ved -20°C indtil videre analyse ved massespektrometri.