Proteomiske arbejdsgange med proteinfordøjelse med høj kapacitet

Proteomics er et vigtigt område for at forstå biologiske processer og systemer, hvor proteinfordøjelse udgør et kritisk trin i dets arbejdsgange. Traditionelt udføres proteinfordøjelse i opløsning ved hjælp af proteolytiske enzymer som trypsin, som specifikt hydrolyserer peptidbindinger ved lysin- og argininrester. Denne proces genererer peptider, der er velegnede til ionisering og fragmentering i massespektrometri (MS) applikationer. Konventionelle fordøjelsesmetoder kræver dog 12-24 timer for at opnå færdiggørelse, hvilket skaber betydelige flaskehalse i proteomiske arbejdsgange.
Ultralydbehandling tilbyder et kraftfuldt alternativ, der dramatisk forkorter fordøjelsestiden fra timer til blot et par minutter. Når det kombineres med avancerede multi-sample sonikere såsom Hielscher CupHorn, VialTweeter og 96-brønds plade sonicator UIP400MTP, muliggør ultralydbehandling accelereret, high-throughput proteomics. Disse teknologier strømliner arbejdsgange, reducerer prøveforberedelsestiden og øger effektiviteten uden at gå på kompromis med reproducerbarhed eller datakvalitet.

Ultralydsenergiens rolle i proteinfordøjelsen

Ultralydbehandling anvender fokuserede ultralydbølger til at skabe kavitation - lokaliserede mikrobobler, der kollapser for at generere intense forskydningskræfter. Dette fænomen forbedrer masseoverførsel, fremmer blandingen af enzymer med substrater og udfolder proteinstrukturer og udsætter spaltningssteder for proteolytiske enzymer som trypsin.
Resultatet? En betydelig reduktion i fordøjelsestiden uden at gå på kompromis med effektivitet eller reproducerbarhed.

Ultralydsforbedret proteolytisk fordøjelse: Metode og resultater

Accelereret fordøjelsesprotokol

Ultralydsassisteret fordøjelse kombinerer proteolytiske enzymer og ultralydsenergi for at fremskynde arbejdsgange. For eksempel ved hjælp af Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) forløber fordøjelsesarbejdsgangen som følger:

1. Reduktion: Proteinprøver (0,5 mg/ml, 20 μL) behandles med DTT (2 μL, 110 mM) i ammoniumbicarbonatbuffer (12,5 mM). Sonikering påføres ved 50% amplitude i 5 minutter.
2. Alkylering: Efter tilsætning af IAA (2 μL, 400 mM) gentages sonikering under de samme betingelser.
3. Fordøjelse: Prøver fortyndes og inkuberes med immobiliserede trypsin nanopartikler. En sidste runde sonikering (5 minutter) afslutter fordøjelsen. Peptider adskilles, tørres og opbevares til MS-analyse.

Denne ultralydsmetode reducerer den samlede forberedelsestid fra 12 timer til under 30 minutter. På trods af den accelererede proces forbliver peptidudbyttet og kvaliteten i overensstemmelse med traditionelle metoder natten over.

Effektivitet af ultralydsproteinfordøjelse

I sammenlignende undersøgelser med E. coli-proteomer:

• Protein identifikation: Ultralydsfordøjede prøver identificerede 777 proteiner på 5 minutter sammenlignet med 817 på 12 timer. Fælles proteinidentifikationer oversteg 70 %.
• Reproducerbarhed: Replikerede analyser viste korrelationsværdier over 98 % inden for hver metode, hvilket demonstrerede pålidelighed.
• Selektivitet: Visse proteiner blev fortrinsvis fordøjet ved hver metode, hvor ultralydsfordøjelsen favoriserede 65 proteiner og fordøjelsen natten over 54 proteiner. Sådanne nuancerede forskelle understreger det unikke potentiale for ultralydbehandling til specifikke applikationer.

Etiketfri proteinkvantificeringsresultater af syv tilsat proteiner til en E. coli
prøve. Følgende proteiner blev tilsat på to forskellige niveauer som angivet i kolonnen
navngivet som "Theo Ratio". Theo Ratio er det teoretiske forhold mellem de to niveauer, der bruges i denne
eksperiment. Bovint serumalbumin (ALBU), β-lactoglobulin (LACB), α-S1 kasein (CASA1)
α-S2 kasein (CASA2), cytokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) og kulsyreanhydrase 2
(CAH2). Forholdet blev beregnet ved hjælp af LFQ-proteinintensiteter opnået fra MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Undersøgelse og grafik: © Martins et al., 2019)

Nanopartikel-immobiliseret trypsin

Integrationen af immobiliserede trypsin-nanopartikler (f.eks. T-FMNP'er) med ultralydbehandling forbedrer proteomics-arbejdsgangene yderligere. Disse nanopartikler giver et højt overfladeareal til enzym-substrat-interaktioner, hvilket øger effektiviteten. Når den anvendes på komplekse proteomer, såsom E. coli, opnår den kombinerede metode:

• Fart: Komplet fordøjelse inden for 5 minutter.
• Nøjagtighed: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalerbarhed: Tilpasning til multi-brøndsplatforme som UIP400MTP muliggør behandling med høj kapacitet.

Klik her for den detaljerede protokol med trin-for-trin instruktioner!
(jf. Martins et al., 2019)

Proteolytisk fordøjelse ved høj hastighed og høj kapacitet med Hielscher sonikere

De bedste sonikermodeller til proteomics

Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige sonikermodeller til samtidig forberedelse af flere prøver, hvilket letter arbejdsgange med høj gennemstrømning. Uanset om du arbejder med hætteglas, reagensglas, multi-brønd-plader (f.eks. 6-, 24-, 96-brønds plader) eller petriskåle – Vi tilbyder dig de ideelle sonikere til dine eksperimenter.

UIP400MTP multi-brønds plade soniker

For ultimativ gennemstrømning giver UIP400MTP mulighed for at behandle 96-brønds plader ultralyd. Kompatibel med enhver standard mikroplade, UIP400MTP kræver ikke dyre proprietære engangsartikler og giver dig frihed til at vælge den bedste multi-brøndplade til din forskning. Ved at levere ensartet energi over hele pladen muliggør den hurtig reduktion, alkylering og fordøjelse af op til 200 komplekse proteomer på kun 1 time. Dette niveau af automatisering og effektivitet er afgørende for proteomics og kliniske applikationer med høj kapacitet. Lær mere om multi-brønds plade soniker!

VialTweeter

VialTweeter er skræddersyet til laboratorier, der kræver samtidig sonikering af op til 10 hætteglas eller reagensglas. Dens ikke-invasive tilgang eliminerer krydskontamineringsrisici og sikrer samtidig reproducerbar proteinfordøjelse. Denne enhed er ideel til forskere, der arbejder med begrænsede prøvemængder eller forskellige prøvetyper.
Lær mere om VialTweeter multi-tube sonicator!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn-sonikeren er en kraftfuld enhed designet til samtidig behandling af flere prøver i forseglede beholdere. Det sikrer ensartet ultralydsenergifordeling og præcis temperaturkontrol. Evnen til at behandle op til fem prøver samtidigt, kombineret med dens kompatibilitet med reducerede, alkylerede og fordøjede arbejdsgange, gør CupHorn til et pålideligt værktøj til MS-baseret proteomics.
Lær mere om CupHorn SonoReactor!

Trin-for-trin protokol til ultralydassisteret proteolytisk fordøjelse ved hjælp af nanopartikel-immobiliseret trypsin

Denne protokol af Martins et al. (2019) er optimeret til hurtig proteinfordøjelse ved hjælp af ultralydsenergi og nanopartikel-immobiliseret trypsin (T-FMNP'er). De skitserede trin sikrer effektiv reduktion, alkylering og proteolyse, der er velegnet til massespektrometri (MS) applikationer.
Trin til protokol

1. Reduktion af disulfidbindinger
   • Tilsæt 2 μL DTT-opløsning (110 mM) til 20 μL proteinprøven (0.5 mg/ml) i AmBic buffer.
   • Placer prøverøret i sonoreaktoren UP200St-CupHorn.
   • Soniker prøven i 2,5 minutter ved 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Hold pause i et kort interval for at tillade afkøling, og soniker derefter i yderligere 2,5 minutter under de samme forhold.
2. Alkylering af reducerede cysteinrester
   • Der tilsættes 2 μL IAA-opløsning (400 mM) til den reducerede proteinprøve.
   • Soniker i 2,5 minutter ved 50% amplitude for at lette alkylering.
   • Hold pause for afkøling, og soniker derefter i yderligere 2,5 minutter.

   Bemærk: Minimer eksponeringen af den alkylerede prøve for lys for at forhindre IAA-nedbrydning.

3. Prøve fortynding
   • Den alkylerede proteinprøve fortyndes til et endeligt volumen på 100 μL ved hjælp af 25 mM AmBic buffer indeholdende 4 % acetonitril (v/v).
   • Bland grundigt ved forsigtig pipettering.
4. Proteolytisk fordøjelse med nanopartikel-immobiliseret trypsin
   • Der tilsættes 20 μL T-FMNP-opløsning (3 mg/ml) til den fortyndede proteinprøve.
   • Soniker blandingen i sonoreaktoren i 2,5 minutter ved 50% amplitude.
   • Hold pause for afkøling, og soniker derefter i yderligere 2,5 minutter under de samme forhold.
5. Adskillelse af trypsin nanopartikler
   • Brug en magnet til at adskille T-FMNP'erne fra supernatanten, der indeholder fordøjede peptider.
   • Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
6. Peptidforberedelse til MS-analyse
   • Supernatanten indeholdende peptider tørres i en vakuumcentrifuge.
   • Opbevar de tørrede peptider ved -20°C indtil yderligere analyse ved massespektrometri.