Ultrasonic Filter-Aided Sample Preparation (FASP): Forbedring af proteomiske arbejdsgange med avanceret sonikering

Ultralydsfilterstøttet prøveforberedelse (FASP) er ved at udvikle sig til en yderst effektiv og reproducerbar metode i moderne proteomik. Ved at integrere kontrolleret sonikering i etablerede FASP-workflows kan forskere forbedre proteinekstraktion, fordøjelseseffektivitet og den samlede datakvalitet betydeligt. Med den stigende efterspørgsel efter høj gennemstrømning og reproducerbar prøveforberedelse får fokuserede sonikatorer som mikropladesonikatoren UIP400MTP større videnskabelig og praktisk relevans.

Videnskabelig kontekst: Hvorfor FASP er vigtig i proteomik

Filterstøttet prøveforberedelse (FASP) er blevet en guldstandard inden for bottom-up proteomik på grund af dens evne til at fjerne vaskemidler, salte og andre forurenende stoffer, samtidig med at den muliggør effektiv enzymatisk fordøjelse. Men klassiske FASP-protokoller står ofte over for begrænsninger i forbindelse med ufuldstændig lysis, inkonsekvent fordøjelse og prøvevariabilitet. – especially when dealing with complex or resilient biological cells or tissues.
Det er her, fokuseret ultralydsenergi (sonikering) giver en afgørende fordel. Ved at indføre mekaniske forskydningskræfter og kavitation forbedrer sonikering flere kritiske trin i FASP-arbejdsgangen uden at gå på kompromis med proteinintegriteten.

De positive effekter af sonikering i Ultrasonic FASP

Sonikering introducerer kontrolleret akustisk kavitation – Mikroskopisk bobledannelse og -kollaps – hvilket skaber lokale forskydningskræfter og mikrostrømning.
Sonikering forbedrer både alkylerings- og fordøjelsestrinene i ultralyds-FASP ved at forbedre masseoverførslen og fremskynde reaktionskinetikken. Anvendelsen af ultralydsenergi genererer kavitation, hvilket fører til lokal mikrostrømning og forbigående forskydningskræfter, der fremmer hurtig blanding og effektiv indtrængning af reagenser i proteinmatrixen eller filtermiljøet. Under alkylering resulterer dette i mere ensartet og hurtigere modifikation af cysteinrester med iodoacetamid. I fordøjelsestrinnet øger sonikering tilgængeligheden af proteolytiske spaltningssteder og forbedrer enzym-substratinteraktioner og derved fremskynder trypsinaktiviteten og forbedrer fordøjelseseffektiviteten. Samlet set reducerer ultralydsbehandling behandlingstiden, samtidig med at reaktionens fuldstændighed og reproducerbarhed opretholdes eller forbedres.

I proteomisk prøveforberedelse oversættes ultralyds-FASP til:

• Mere effektiv celleopdeling og proteinekstraktion, selv i hårde væv eller mikrobielle prøver
• Forbedret opløselighed af proteiner
• Forbedret enzymtilgængelighed under fordøjelsen
• Reduceret behandlingstid og øget reproducerbarhed

I modsætning til konventionelle mekaniske eller kemiske lysemetoder er ultralydsbehandling meget kontrollerbar og skalerbar, hvilket gør den særligt velegnet til standardiserede proteomics-arbejdsgange.

Fordele ved ultralyds-FASP i forhold til konventionelle metoder

Integrationen af sonikering i FASP-protokoller giver målbare fordele, der direkte påvirker downstream-massespektrometri-resultaterne.
Ultrasonic FASP muliggør en mere komplet proteinudvinding, især fra udfordrende prøver som fibrøst væv eller biofilm. Den ensartede energifordeling sikrer ensartet behandling på tværs af replikater, hvilket reducerer variabiliteten. – et væsentligt krav til kvantitativ proteomik.
Derudover fremskynder sonikering fordøjelseskinetikken ved at forbedre interaktionen mellem enzym og substrat. Dette resulterer ofte i kortere fordøjelsestider og højere peptidudbytte, samtidig med at sekvensdækningen opretholdes.
Fra et workflow-perspektiv reducerer ultralydssystemer manuel indgriben og eliminerer behovet for aggressive kemiske behandlinger, hvilket bevarer prøveintegriteten og forenkler protokolstandardisering.

Venn-diagram, der viser det øgede antal identificerede proteiner ved Ultrasonic FASP sammenlignet med Over-Night FASP
Billede og undersøgelse: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: Ultrasonic FASP med høj gennemstrømning med UIP400MTP

For laboratories processing large sample cohorts, the UIP400MTP microplate sonicator enables simultaneous sonication of standard multi-well plates (e.g., 96-well plates), significantly increasing throughput and reproducibility.
I dette format forberedes prøver (typisk 50-200 µL pr. brønd) direkte i mikroplader, der er kompatible med ultrafiltrering eller downstream-behandling. Lysis-buffere svarer til dem, der bruges i standard FASP-protokoller.

UIP400MTP anvender ensartet ultralydsenergi på tværs af alle brønde. Sonikering udføres typisk ved 60-80% amplitude i 2-4 minutter, afhængigt af prøvetypen. Overvåg temperaturen ved hjælp af den stikbare temperatursensor. Ved hjælp af pulserende sonikering og eventuelt til en laboratoriekøler.

Et eksempel på en protokol:

1. For the alkylation step, samples are sonicated using the microplate sonicator (UIP400MTP) at 40% amplitude for 7 cycles (30 s ON, 15 s OFF; total sonication time: 5 min 45 s).
2. Efter sonikering fjernes iodoacetamid-opløsningen (IAA) ved centrifugering. Før trypsinfordøjelsen skal prøverne vaskes for at fjerne resterende urea, et stærkt kaotropisk middel, der hæmmer enzymaktiviteten. Derfor vaskes prøverne to gange med 200 μL 25 mM ammoniumbicarbonat (AmBic).
3. Derefter tilsættes 100 μL trypsinopløsning (1:30 enzym-til-protein-forhold) fremstillet i 12,5 mM ammoniumbicarbonat. Proteinfordøjelsen udføres derefter ved hjælp af UIP400MTP under de samme sonikeringsbetingelser (40 % amplitude, 7 cyklusser, 30 s ON / 15 s OFF; samlet tid: 5 min 45 s).
4. Efter sonikering overføres prøverne til filterplader eller behandles ved hjælp af pladebaserede FASP-systemer. Reduktions- og alkyleringstrin udføres in-plate, hvilket giver en strømlinet arbejdsgang.
5. Trypsinfordøjelsen udføres under kontrollerede forhold (f.eks. 37 °C, 4-16 timer) med mulighed for kort ultralydsstimulering for at fremskynde den enzymatiske aktivitet og forbedre peptidudbyttet.
6. Peptiderne udvindes ved centrifugering og er klar til LC-MS/MS-analyse.

Den vigtigste fordel ved dette system er dets evne til at levere identiske behandlingsbetingelser på tværs af alle brønde, hvilket minimerer batch-effekter og muliggør robuste kvantitative sammenligninger i store proteomikstudier.

Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Hårde forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydsapparater.

Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.

Litteratur / Referencer