Ultralydsbaseret filterassisteret prøveforberedelse (FASP): Forbedring af proteomiske arbejdsgange med avanceret sonikering
Ultralydsbaseret filterassisteret prøveforberedelse (FASP) vinder frem som en yderst effektiv og reproducerbar metode inden for moderne proteomik. Ved at integrere kontrolleret sonikering i etablerede FASP-arbejdsgange kan forskere forbedre proteinekstraktionen, spaltningseffektiviteten og den samlede datakvalitet betydeligt. Med den stigende efterspørgsel efter reproducerbar prøveforberedelse med høj prøvekapacitet får fokuserede sonikatorer såsom mikropladesonikatoren UIP400MTP større videnskabelig og praktisk relevans.
Videnskabelig kontekst: Hvorfor FASP er vigtig inden for proteomik
Filterassisteret prøveforberedelse (FASP) er blevet en guldstandard inden for bottom-up-proteomik på grund af metodens evne til at fjerne detergenter, salte og andre forureninger og samtidig muliggøre effektiv enzymatisk spaltning. Klassiske FASP-protokoller har dog ofte begrænsninger i forbindelse med ufuldstændig lyse, uensartet spaltning og prøvevariabilitet – især ved arbejde med komplekse eller modstandsdygtige biologiske celler eller væv.
Her giver fokuseret ultralydsenergi (sonikering) en afgørende fordel. Ved at frembringe mekaniske forskydningskræfter og kavitation forbedrer sonikering flere kritiske trin i FASP-arbejdsgangen uden at kompromittere proteinernes integritet.
Sonikator til multibrøndplader UIP400MTP letter filterassisteret prøveforberedelse (FASP)
Sonikeringens positive virkninger i ultralydsbaseret FASP
Sonikering frembringer kontrolleret akustisk kavitation – dannelse og kollaps af mikroskopiske bobler – som genererer lokale forskydningskræfter og mikrostrømning.
Sonikering forbedrer både alkylerings- og spaltningstrinnene i ultralydsbaseret FASP ved at forbedre masseoverførslen og accelerere reaktionskinetikken. Tilførslen af ultralydsenergi genererer kavitation, hvilket fører til lokal mikrostrømning og kortvarige forskydningskræfter, der fremmer hurtig blanding og effektiv indtrængning af reagenser i proteinmatricen eller filtermiljøet. Under alkyleringen medfører dette en mere ensartet og hurtigere modifikation af cysteinrester med iodacetamid. I spaltningstrinnet øger sonikering tilgængeligheden af proteolytiske spaltningssteder og forbedrer enzym–substrat-interaktionerne, hvorved trypsinaktiviteten accelereres, og spaltningseffektiviteten forbedres. Samlet set reducerer ultralydsbehandling behandlingstiden, samtidig med at reaktionernes fuldstændighed og reproducerbarhed opretholdes eller forbedres.
Ved prøveforberedelse til proteomik giver ultralydsbaseret FASP:
- Mere effektiv celleopbrydning og proteinekstraktion, selv i modstandsdygtigt væv eller mikrobielle prøver
- Forbedret solubilisering af proteiner
- Forbedret adgang for enzymer under spaltningen
- Reduceret behandlingstid og øget reproducerbarhed
I modsætning til konventionelle mekaniske eller kemiske lysemetoder kan ultralydsbehandling styres og skaleres i høj grad, hvilket gør den særligt velegnet til standardiserede proteomiske arbejdsgange.
Fordele ved ultralydsbaseret FASP sammenlignet med konventionelle metoder
Integrationen af sonikering i FASP-protokoller giver målbare fordele, som direkte påvirker resultaterne af den efterfølgende massespektrometri.
Ultralydsbaseret FASP muliggør en mere fuldstændig genvinding af proteiner, især fra udfordrende prøver såsom fibrøst væv eller biofilm. Den ensartede energifordeling sikrer ensartet behandling på tværs af replikater og reducerer dermed variabiliteten – et væsentligt krav inden for kvantitativ proteomik.
Desuden accelererer sonikering spaltningskinetikken ved at forbedre enzym–substrat-interaktionen. Dette resulterer ofte i kortere spaltningstider og højere peptidudbytte, samtidig med at sekvensdækningen opretholdes.
Set fra et arbejdsgangsperspektiv reducerer ultralydssystemer behovet for manuelle indgreb og eliminerer behovet for aggressive kemiske behandlinger, hvilket bevarer prøvernes integritet og forenkler standardiseringen af protokoller.
Venndiagram, der viser det øgede antal identificerede proteiner ved ultralydsbaseret FASP sammenlignet med FASP udført natten over
Billede og studie: ©Carvalho et al., 2020
Sonikator til multibrøndplader UIP400MTP til filterassisteret prøveforberedelse (FASP)
Protokol: Ultralydsbaseret FASP med høj prøvekapacitet med UIP400MTP
For laboratorier, der behandler store prøvekohorter, muliggør mikropladesonikatoren UIP400MTP samtidig sonikering af standardmultibrøndplader (f.eks. 96-brøndsplader), hvilket øger prøvekapaciteten og reproducerbarheden betydeligt.
I dette format forberedes prøverne (typisk 50–200 µL pr. brønd) direkte i mikroplader, der er kompatible med ultrafiltrering eller efterfølgende behandling. Lysebufferne ligner dem, der anvendes i standard-FASP-protokoller.
UIP400MTP tilfører ensartet ultralydsenergi til alle brønde. Sonikering udføres typisk ved 60–80% amplitude i 2–4 minutter, afhængigt af prøvetypen. Overvåg temperaturen med den tilslutbare temperatursensor. Brug pulseret sonikering og eventuelt en laboratoriekøler.
Eksempel på en protokol:
- Til alkyleringstrinnet sonikeres prøverne med mikropladesonikatoren (UIP400MTP) ved 40% amplitude i 7 cyklusser (30 s TIL, 15 s FRA; samlet sonikeringstid: 5 min 45 s).
- Efter sonikering fjernes iodacetamidopløsningen (IAA) ved centrifugering. Før spaltning med trypsin skal prøverne vaskes for at fjerne resterende urinstof, et stærkt kaotropt middel, der hæmmer enzymaktiviteten. Derfor vaskes prøverne to gange med 200 μL 25 mM ammoniumbicarbonat (AmBic).
- Derefter tilsættes 100 μL trypsinopløsning (enzym-protein-forhold på 1:30) fremstillet i 12,5 mM ammoniumbicarbonat. Proteinspaltningen udføres derefter med UIP400MTP under de samme sonikeringsbetingelser (40% amplitude, 7 cyklusser, 30 s TIL / 15 s FRA; samlet tid: 5 min 45 s).
- Efter sonikering overføres prøverne til filterplader eller behandles med pladebaserede FASP-systemer. Reduktions- og alkyleringstrinnene udføres i pladen, hvilket opretholder en strømlinet arbejdsgang.
- Spaltning med trypsin udføres under kontrollerede betingelser (f.eks. 37°C, 4–16 timer) med mulighed for kortvarig ultralydsstimulering for at accelerere enzymaktiviteten og forbedre peptidudbyttet.
- Peptiderne genvindes ved centrifugering og er klar til analyse med LC-MS/MS.
Den vigtigste fordel ved dette system er dets evne til at levere identiske behandlingsbetingelser i alle brønde, hvilket minimerer batcheffekter og muliggør robuste kvantitative sammenligninger i proteomiske studier i stor skala.
Sonikatoren VialTweeter til flere prøverør accelererer og forbedrer filterassisteret prøveforberedelse (FASP) inden for proteomik
Videnskabelig relevans
Integrationen af sonikering i FASP-arbejdsgange er ikke blot en teknisk forbedring – den repræsenterer et metodologisk fremskridt inden for prøveforberedelse til proteomik. Efterhånden som området bevæger sig mod højere prøvekapacitet, automatisering og reproducerbarhed, afhjælper ultralydsteknologier grundlæggende flaskehalse i prøvebehandlingen.
Nyere studier fremhæver i stigende grad betydningen af ensartet prøveforberedelse for pålidelig opdagelse af biomarkører og kvantitativ proteomik. Ultralydsbaseret FASP bidrager direkte til dette mål ved at forbedre ekstraktionseffektiviteten, spaltningens ensartethed og den samlede arbejdsgangs robusthed.
Desuden matcher ultralydssystemernes skalerbarhed – fra individuelle prøveglas med VialTweeter til hele mikroplader med UIP400MTP – den stigende efterspørgsel efter både eksplorative proteomiske studier og proteomiske studier med store kohorter.
Få en sonikator, der letter din FASP-arbejdsgang!
Ultralydsbaseret filterassisteret prøveforberedelse kombinerer FASP’s dokumenterede styrker med sonikeringens fysiske fordele. Ved at forbedre lyse og spaltning samt standardisere arbejdsgange tilbyder ultralydssystemer en effektiv løsning til moderne proteomik.
Sonikatoren til flere prøverør VialTweeter og mikropladesonikatoren UIP400MTP illustrerer, hvordan fokuseret ultralydsenergi kan omdanne rutinemæssig prøveforberedelse til en mere effektiv, reproducerbar og videnskabeligt robust proces – hvilket i sidste ende fører til proteomiske data af højere kvalitet og dybere biologisk indsigt.
Vælg den bedst egnede sonikator til din filterassisterede prøveforberedelse
| Sonikatormodel | Fordele for FASP | Bedst egnet til |
| Mikropladesonikator UIP400MTP | Ensartet sonikering på tværs af hele mikroplader; yderst reproducerbar energitilførsel; accelererer alkylering og enzymatisk spaltning i arbejdsgange med høj prøvekapacitet; kompatibel med automatiseret prøveforberedelse. | FASP-arbejdsgange med høj prøvekapacitet i 96-brøndsformater eller lignende pladeformater, herunder screeningsanvendelser inden for proteomik. |
| Sonikator VialTweeter til flere prøverør | Samtidig, ensartet sonikering af flere lukkede prøverør; minimerer krydskontaminering og prøvetab; forbedrer reagensernes indtrængning og blandingen, hvilket forbedrer alkylerings- og spaltningseffektiviteten. | Parallel behandling af flere FASP-prøver med moderat prøvekapacitet og høj reproducerbarhed. |
| CupHorn (indirekte sonikering i et “højintensitetsbad” til forseglede prøverør) | Indirekte sonikering med høj intensitet til forseglede beholdere; fremragende temperaturkontrol og kontamineringsfri behandling; fremmer effektiv masseoverførsel uden direkte kontakt med sonden. | Behandling af prøver i forskellige prøvebeholdere / følsomme eller farlige prøver, der kræver lukkede beholdere og ensartet energifordeling. |
| Sondesonikatorer til laboratoriet (direkte sonikering) | Maksimal ultralydsintensitet og energioverførsel; hurtig opbrydning og acceleration af reaktioner; effektiv til proteinprøver, der er vanskelige at spalte eller meget komplekse. | Behandling af enkeltprøver, større prøver eller udfordrende matricer, hvor maksimal effekt og hastighed er påkrævet. |
Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland
Sonikatorer fra Hielscher er kendt for deres højeste standarder for kvalitet og design. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores sonikatorer i industrianlæg. Sonikatorer fra Hielscher håndterer nemt barske forhold og krævende miljøer.
Hielscher Ultrasonics er en virksomhed certificeret efter ISO og lægger særlig vægt på højtydende sonikatorer med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Sonikatorer fra Hielscher overholder naturligvis kravene til CE og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
Ofte stillede spørgsmål
Hvad bruges filterassisteret prøveforberedelse til?
Filterassisteret prøveforberedelse (FASP) bruges til forberedelse af proteinprøver til massespektrometribaseret proteomisk analyse. Metoden muliggør effektiv fjernelse af detergenter, salte og andre forureninger med lav molekylvægt, samtidig med at proteinerne tilbageholdes på et filter med en molekylvægtgrænse, hvor de kan denatureres, reduceres, alkyleres og spaltes enzymatisk til peptider, der er egnede til analyse med LC–MS/MS.
Hvad er fordelene ved FASP inden for proteomik?
De vigtigste fordele ved FASP inden for proteomik er metodens evne til at håndtere komplekse og detergentholdige prøver og samtidig producere meget rene peptidblandinger, der er kompatible med massespektrometri. Metoden forbedrer spaltningseffektiviteten og reproducerbarheden ved at udføre reaktionerne i et afgrænset filtermiljø, reducerer prøvetab sammenlignet med udfældningsbaserede metoder og muliggør effektiv bufferudskiftning. Samlet set forbedrer FASP peptidgenvindingen, datakvaliteten og proteomdækningen, hvilket gør metoden til en robust og udbredt arbejdsgang inden for bottom-up-proteomik.
Litteratur / referencer
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Sonikatoren UIP400MTP uden kontakt med prøverne letter FASP i 96-brøndsplader
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra laboratoriestørrelse til industristørrelse.