Ultralydsbaseret celledisaggregering af bakterieprøver

Bakterieprøver foreligger sjældent som egentlige enkeltcellesuspensioner. Kulturer vokser i kæder og flokker, miljøisolater danner aggregater bundet af ekstracellulære polymere stoffer, og centrifugerede bundfald modstår ofte resuspension trods grundig omrystning. Tælling af levedygtige celler, optisk densitet, flowcytometri og mikrobiomprofilering forudsætter alle, at én partikel svarer til én celle. Ultralydsbaseret celledisaggregering løser denne konflikt: korte, kontrollerede sonikeringsimpulser adskiller aggregaterne i enkeltceller uden at lysere dem.

Hvorfor celleaggregering forringer dine resultater

Aggregering er et biologisk fænomen, ikke en fejl i præparatet. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces og mange miljøbakterier vokser i kæder, klynger eller biofilmfragmenter, og ekstracellulært DNA og polysaccharider binder cellerne sammen i bundfald og i eluatet fra podninger. De analytiske konsekvenser er systematiske:

• Antallet af kolonier undervurderes, fordi én klump tæller som én koloni, uanset hvor mange celler den indeholder.
• Optisk tæthed og partikeltællere registrerer aggregater i stedet for celler, hvilket forvrider vækstkurverne.
• Ved flowcytometri og cellesortering tælles sammenklumpede hændelser forkert, og de udelades fra analysen.
• DNA- og proteinekstraktioner omfatter kun cellerne på aggregatets overflade, hvilket forvrider dataene vedrørende mikrobiomet og omics-analyserne.

Traditionelle metoder er langsomme, ufuldstændige eller medfører kemiske ændringer. Kraftig pipettering og vortexbehandling efterlader mikroaggregater. Enzymatisk eller chelatorbaseret dispersion ændrer celleoverfladen, som man måske ønsker at analysere. Mekanisk desaggregering ved kontrolleret kavitation virker på få sekunder og kræver ingen tilsætningsstoffer.

Hvordan ultralydsbehandling adskiller celler uden at ødelægge dem

Ultralydsbaseret celledisaggregering udnytter en forskel i mekanisk styrke. Bakterieaggregater holdes sammen af relativt svage intercellulære bindinger og en ekstracellulær matrix, mens en intakt cellevæg kan modstå betydeligt større forskydningskræfter. Når kalibreret ultralyd trænger ind i suspensionen, genererer akustisk kavitation mikrostrømninger, trykimpulser og forskydningskræfter, der først virker på aggregaternes grænseflader. Klumper, kæder og biofilmfragmenter skæres fra hinanden (deagglomerering), inden det energiniveau, hvor membranerne brister (lyse), nås.

Ultralydsopløsning af bakterielle celleklumper

Opdeling eller nedbrydning – Hvorfor ultralydsparametre er vigtige

Den praktiske konsekvens er, at disaggregering og lysis udføres med det samme instrument, blot indstillet på forskellige parametre. Ved moderat amplitude, korte pulscyklusser og kontrolleret temperatur opnås en levedygtig enkeltcellesuspension. Ved at øge amplituden, eksponeringstiden eller prøvetemperaturen skifter processen mod fuldstændig celleopbrydning med henblik på intracellulære mål. Med Hielscher-generatorer kan man indstille amplitud, effekt, puls og energitilførsel præcist og gemme metoden, så disaggregeringstrinnet er reproducerbart på tværs af prøver, operatører og kørsler.

Effektiv kontaktfri ultralydsbehandling

Ultralydsbehandling i bad kan ikke måle sig med denne præcision. Ultralydsrensningsbade og -tanke leverer kun lav ultralydsenergi, hvilket resulterer i en ufuldstændig forberedelse, og kavitationen forekommer ujævnt, så hvert rør behandles afhængigt af dets placering i badet. VialTweeter overfører intense, fokuserede ultralydskræfter direkte gennem beholdervæggen til op til 10 forseglede prøver på samme tid. Behandlinger, der kræver lang, variabel eksponering i et bad, udføres i et standardiseret pulsmønster.
Hielschers berøringsfrie ultralydsenheder påfører intens, fokuseret ultralyd gennem væggene på lukkede hætteglas. VialTweeter-enheden behandler op til 10 hætteglas samtidigt med identisk intensitet, uden at der er en sonde i prøven, uden krydskontaminering og uden frigivelse af aerosoler. Hvor kapaciteten kræver det, udvider mikroplade-ultralydsapparatet UIP400MTP og UIP550MTP den samme kontrollerede energioverførsel til multi-well-plader.

Fordelene ved berøringsfri ultralydsdisaggregering

• Ingen krydskontaminering: Da hætteglassene forbliver lukket hele tiden, og der ikke nedsænkes nogen sonde i prøven, undgås krydskontaminering og prøvetab fuldstændigt. Der er intet, der skal steriliseres mellem prøverne, og den ene analyse kan ikke påvirke den næste.
• Beskyttelse mod aerosoler: Ultralydsbehandling med åben sonde genererer smittefarlige aerosoler og forurener instrumenternes overflader. Ultralydsbehandling i lukkede hætteglas holder prøven inde i sit eget rør, hvilket er vigtigt ved håndtering af patogene bakterier såsom Mycobacterium tuberculosis og andre BSL-2- eller BSL-3-agenser.
• Ingen tab af drikkepenge: Titansonder kan under drift frigive en lille mængde mikropartikler i prøven. Disse partikler påvirker den optiske tæthed og partikeltællingen i den efterfølgende proces. Indirekte ultralydsbehandling gennem beholdervæggen eliminerer denne kilde til faste stoffer fuldstændigt.
• Ensartet gennemstrømning: VialTweeter leverer den samme ultralydsintensitet til hver af op til 10 hætteglas, hvilket sikrer ensartede og reproducerbare sonikeringsresultater. De positionseffekter, der er et problem ved ultralydsbade og sondering af enkeltprøver, forsvinder, og dine basislinjer forbliver sammenlignelige på tværs af gentagelser.
• Prøvens integritet: Rørene forbliver lukkede under hele behandlingsforløbet, så prøven ikke kan blive forurenet, ødelagt eller fordampet. Små mængder kan behandles uden fortynding, herunder værdifulde kliniske pelletprøver, hvor der ikke er plads til et ekstra overførselstrin.
• Proceskontrol: Amplituden kan indstilles fra 20 til 100 %, pulsmodus fra 0 til 100 %, og systemerne understøtter temperaturovervågning, så termofølsomme stammer og proteiner holdes under de skadelige tærskelværdier.

Typiske anvendelser

• Analyse af mikrobiomet og tarmindholdet: Spredning af Lactobacillus, Bifidobacterium og fækalprøver inden udpladning eller sekventering, så antallet ikke undervurderes på grund af klumper.
• Mikrobiologi i fødevarer og vand: Opdeling af flokker i podninger, skyllevæsker og berigelsesbouillon med henblik på nøjagtig bestemmelse af kolonier og levedygtighed.
• Biofilmforskning: udvinding af celler fra bærere og overflader som enkeltcellesuspensioner uden enzymatisk behandling, der ville fjerne overfladeproteinerne.
• Klinisk diagnostik: resuspension af sputum, pus og udtog fra podninger under indeslutningsbetingelser.
• Cellekultur: adskillelse af sammenklumpede aggregater fra pattedyr, insekter og CHO-celler inden tælling og passering.
• Forberedelse af hele arbejdsgangen: Det samme instrument, der udfører opdeling ved lav amplitude, foretager fuldstændig celleopbrydning ved højere indstillinger, så lysis, proteinekstraktion og DNA-fragmentering kan foregå uden overførsel mellem rør.

Litteratur / Referencer