Protokol for dyrkning og frigørelse af Staphylococcus-biofilm

Standardiserede metoder er afgørende for pålidelige forskningsresultater. Her finder du en protokol for dyrkning og frigørelse af stafylokokbiofilm. Denne protokol fokuserer på effektiviseret prøveforberedelse med høj prøvekapacitet ved hjælp af sonikatoren UIP400MTP til multibrøndsplader til effektiv frigørelse af biofilm i 96-brøndsplader med høj prøvekapacitet. Protokollen indeholder også centrale trin til dyrkning, vask og visualisering af biofilm med fokus på at minimere variation og sikre reproducerbarhed.

Forskning i Staphylococcus-biofilm og antibiotika

Staphylococcus-biofilm spiller en afgørende rolle ved vedvarende infektioner på grund af deres modstandsdygtighed over for antibiotika og immunreaktioner. Biofilmdannelse giver bakterier et beskyttende miljø, hvilket gør infektioner vanskelige at behandle. Forskning i biofilm fokuserer ofte på at forstå deres dannelse, adfærd og følsomhed over for antimikrobielle midler med vægt på metoder med høj prøvekapacitet, der effektiviserer forsøgsarbejdsgange.
Sonikatoren UIP400MTP til multibrøndsplader giver en væsentlig fordel i biofilmforskningen ved at muliggøre hurtig og effektiv frigørelse af biofilm fra 96-brøndsplader. Dette apparat tilfører ensartet ultralydsenergi til alle brønde, hvilket sikrer konsistente resultater og samtidig minimerer variation.

Protokol for dyrkning og frigørelse af Staphylococcus-biofilm

Nedenfor guider vi dig trin for trin gennem processen med at dyrke og frigøre en Staphylococcus-biofilm. Som eksempel på et analytisk trin viser vi dig, hvordan du kvantificerer den dyrkede biomasse spektrofotometrisk ved hjælp af krystalvioletfarvning.

Dyrkning af Staphylococcus-biofilm

Nødvendige materialer:

• Sterile, fladbundede 96-brønds mikrotiterplader af polystyren med låg, overfladebehandlet til vævskultur
• Tryptisk sojabouillon (TSB) med 0,25% glukose
• Biologisk sikkerhedskabinet

Trin:

1. Klargør et sterilt arbejdsmiljø i et biologisk sikkerhedskabinet for at minimere kontaminering.
2. Tilsæt TSB med 0,25% glukose til mikrotiterpladens brønde. TSB uden glukose understøtter generelt ikke biofilmdannelse og bør kun bruges som kontrol, hvis det er nødvendigt.
3. Inokulér brøndene med bakteriestammer, der er klargjort som beskrevet nedenfor:
4. Klargør bakteriesuspensioner, og sørg for, at der ikke er eksisterende celleansamlinger, ved at homogenisere suspensionerne ved hjælp af sonikering eller ved at bryde ansamlingerne op med en 23-gauge nål og kortvarig vortexblanding.
5. Luk pladen med dens låg, og inkubér under optimale betingelser for biofilmdannelse (f.eks. ved 37°C i 24 timer).
6. Udfør forsøget i triplikat for hver bakteriestamme (tre brønde pr. stamme) for at sikre pålidelighed.
7. Afsæt seks brønde pr. plade til negative kontroller. Op til 30 stammer kan testes pr. 96-brøndsplade.

Visualisering og vask af biofilm

1. Kassér forsigtigt mediet efter inkubation for at undgå at forstyrre biofilmen.
2. Vask hver brønd fire gange med fysiologisk saltvand for at fjerne planktoniske bakterier.
3. Undersøg bunden af brøndene for hvide områder, som tyder på tilstedeværelse af biofilm.

Frigørelse af biofilm ved hjælp af sonikatoren UIP400MTP til multibrøndsplader

Opsætning af apparatet og parametre:

• Sonikator UIP400MTP til multibrøndsplader
• Driftsindstillinger: 60% amplitude, cyklustilstand med 60 sekunder TIL / 30 sekunder FRA

Trin:

1. Placér den vaskede mikrotiterplade på platformen på UIP400MTP.
2. Sonikér prøverne med de anbefalede indstillinger (60% amplitude, 60 sekunder TIL, 30 sekunder FRA). Tilpas indstillingerne til bakteriestammen.
3. Start sonikeringen for at frigøre biofilmen. Ultralydsbølgerne bryder biofilmmatricen op, hvorved de adhærente bakterier frigøres.
4. UIP400MTP sikrer ensartet eksponering i alle brønde, så der opnås konsistente resultater ved frigørelsen.

Analytisk trin: Kvantificering af frigjort Staphylococcus-biofilmbiomasse ved hjælp af krystalviolet (CV)

Nødvendige materialer:

• 0,1% krystalvioletopløsning (CV)
• 95% ethanol eller 30% eddikesyre (til opløsning)
• Mikropladelæser, der kan måle ved 570 nm
• Sterile mikrotiterplader til farvning

Trin:

1. Klargøring af farvningspladen: Overfør 100 µL af suspensionen af frigjort biofilm fra hver brønd i den sonikerede plade til de tilsvarende brønde i en ren, steril 96-brønds mikrotiterplade. Dette sikrer et rent og ensartet miljø til farvningen.
2. Farvning af den frigjorte biofilm: Tilsæt 150 µL 0,1% krystalvioletopløsning til hver brønd, der indeholder suspensionen af frigjort biofilm. Pipettér forsigtigt for at sikre ensartet blanding af biofilmsuspensionen og krystalviolet.
3. Inkubation: Lad pladen inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter, så krystalviolet kan farve biomassen effektivt.
4. Vask: Kassér efter inkubation forsigtigt krystalvioletopløsningen fra brøndene uden at forstyrre biomassen. Vask hver brønd tre gange med sterilt fysiologisk saltvand for at fjerne ubundet farvestof.
5. Tørring: Lad pladen lufttørre ved stuetemperatur eller i en steril luftstrømsbænk. Undgå opvarmning, da dette kan ændre resultaterne.
6. Opløsning: Tilsæt 200 µL 95% ethanol (eller 30% eddikesyre, afhængigt af laboratoriets standardpraksis) til hver brønd for at opløse det bundne krystalviolet. Bland forsigtigt ved at pipettere eller ryste pladen i 10 minutter ved stuetemperatur.
7. Måling: Mål den optiske densitet (OD) af opløsningen med det opløste krystalviolet ved 570 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
8. Dataanalyse: Træk den gennemsnitlige OD570-værdi for de negative kontroller (brønde med TSB, men uden bakterieinokulum) fra værdierne for forsøgsbrøndene for at korrigere for baggrundsfarvning. Registrér og analysér dataene.

Bemærk: Udfør forsøget i triplikat for hver betingelse for at sikre reproducerbarhed. Sørg for korrekt håndtering af krystalviolet og ethanol, og følg sikkerheds- og bortskaffelsesprocedurerne.
 

De vigtigste fordele ved UIP400MTP i overblik:

• Behandling med høj prøvekapacitet: Designet specifikt til multibrøndsplader, så du kan behandle flere prøver samtidigt.
• Ensartet ultralydsfordeling: Sikrer samme ultralydsintensitet i alle brønde og giver dermed konsistente resultater for alle prøver.
• Brug enhver standardplade: UIP400MTP kan håndtere alle standardmultibrøndsplader, petriskåle og rørstativer. Der kræves ingen dyre proprietære plader!
• Brugervenlig grænseflade: Nem at sætte op og styre, hvilket gør den til et fremragende værktøj til at øge laboratoriets produktivitet. Programmerbare indstillinger og automatisering letter standardiseringen af processer!