Staphylococcus biofilm dyrkning og løsrivelsesprotokol

Standardiserede metoder er afgørende for pålidelige forskningsresultater. Her kan du finde en dyrknings- og løsrivelsesprotokol for stafylokokbiofilm. Denne protokol fokuserer på strømlinet prøveforberedelse med høj kapacitet ved hjælp af UIP400MTP multi-brønds pladesoniker til effektiv biofilmløsning med høj kapacitet i 96-brønds plader. Protokollen indeholder også vigtige trin til dyrkning, vask og visualisering af biofilm med fokus på at minimere variabilitet og sikre reproducerbarhed.

Staphylococcus Biofilm og antibiotikaforskning

Staphylococcus biofilm spiller en afgørende rolle i vedvarende infektioner på grund af deres resistens over for antibiotika og immunresponser. Biofilmdannelse giver et beskyttende miljø for bakterier, hvilket gør infektioner vanskelige at behandle. Forskning i biofilm fokuserer ofte på at forstå deres dannelse, adfærd og modtagelighed for antimikrobielle stoffer, med vægt på metoder med høj kapacitet til at strømline eksperimentelle arbejdsgange.
Den UIP400MTP multi-brønds pladesoniker tilbyder en betydelig fordel inden for biofilmforskning ved at muliggøre hurtig og effektiv løsrivelse af biofilm fra 96-brønds plader. Denne enhed giver ensartet ultralydsenergi til alle brønde, hvilket sikrer ensartede resultater, samtidig med at variabiliteten minimeres.

Protokol for dyrkning og løsrivelse af Staphylococcus Biofilm

Nedenfor guider vi dig med en trin-for-trin instruktion gennem processen med at dyrke og løsne en stafylokokbiofilm. Som et eksemplarisk analytisk trin viser vi dig, hvordan du spektrofotometrisk kvantificerer den dyrkede biomasse ved krystalviolet farvning.

Dyrkning af Staphylococcus Biofilm

Krævede materialer:

• Sterile fladbundede 96-brønds polystyrenvævskulturbehandlede mikrotiterplader med låg
• Tryptisk sojabouillon (TSB) med 0,25% glukose
• Biologisk sikkerhedsskab

Trin:

1. Forbered et sterilt arbejdsmiljø i et biologisk sikkerhedsskab for at minimere kontaminering.
2. Tilsæt TSB indeholdende 0.25% glukose til mikrotiterpladebrøndene. TSB uden glukose understøtter generelt ikke biofilmdannelse og bør kun bruges som kontrol, hvis det er nødvendigt.
3. Brøndene podes med bakteriestammer fremstillet som beskrevet nedenfor:
4. Forbered bakterielle suspensioner, og sørg for, at der ikke er eksisterende celleklynger ved at homogenisere suspensionerne ved hjælp af sonikering eller ved at bryde klynger op med en 23-gauge nål og kort hvirvel.
5. Forsegl pladen med låget og inkuber under forhold, der er optimale for biofilmdannelse (f.eks. 37°C i 24 timer).
6. Udfør eksperimentet i tre eksemplarer for hver bakteriestamme (tre brønde pr. stamme) for at sikre pålidelighed.
7. Tildel seks brønde pr. plade til negative kontroller. Op til 30 stammer kan testes pr. 96-brønds plade.

Biofilmvisualisering og vask

1. Efter inkubation kasseres mediet forsigtigt for at undgå at forstyrre biofilmen.
2. Vask hver brønd fire gange med fysiologisk saltvand for at fjerne planktonbakterier.
3. Undersøg bunden af brøndene for hvide pletter, der tyder på tilstedeværelse af biofilm.

Biofilmløsrivelse ved hjælp af multi-brøndplade Sonicator UIP400MTP

Enhedsopsætning og parametre:

• UIP400MTP multi-brønds plade soniker
• Driftsindstillinger: 60 % amplitude, cyklustilstand med 60 sekunder ON / 30 sekunder OFF

Trin:

1. Placer den vaskede mikrotiterplade på den UIP400MTP platform.
2. Soniker prøverne ved anbefalede indstillinger (60% amplitude, 60 sekunder ON, 30 sekunder OFF). Juster indstillingerne til bakteriestammen.
3. Start sonikeringsprocessen for at løsne biofilmen. Ultralydsbølgerne forstyrrer biofilmmatrixen og frigiver de vedhæftede bakterier.
4. UIP400MTP sikrer ensartet eksponering på tværs af alle brønde for ensartede løsrivelsesresultater.

Analytisk trin: Kvantificering af løsrevne stafylokokkbiofilmbiomasse ved hjælp af krystalviolet (CV)

Krævede materialer:

• 01% krystalviolet (CV) opløsning
• 95% ethanol eller 30% eddikesyre (til opløselighed)
• Mikropladelæser, der kan læse ved 570 nm
• Sterile mikrotiterplader til farvning

Trin:

1. Forberedelse af farvningsplade: Overfør 100 μL af den løsrevne biofilmsuspension fra hver brønd i den sonikerede plade til tilsvarende brønde på en ren, steril 96-brønds mikrotiterplade. Dette sikrer et klart og ensartet miljø for farvning.
2. Farvning af den løsrevne biofilm: Tilsæt 150 μL 0,1 % krystalviolet opløsning til hver brønd, der indeholder den løsrevne biofilmsuspension. Pipetter forsigtigt for at sikre en jævn blanding af biofilmsuspensionen og krystalviolet.
3. Inkubation: Lad pladen inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter for at gøre det muligt for krystalviolet at plette biomassen effektivt.
4. Vask: Efter inkubation kasseres forsigtigt den krystalviolette opløsning fra brøndene uden at forstyrre biomassen. Vask hver brønd tre gange med sterilt fysiologisk saltvand for at fjerne ubundet plet.
5. Tørring: Lad pladen lufttørre ved stuetemperatur eller under en steril luftstrømshætte. Undgå opvarmning, da dette kan ændre resultaterne.
6. Opløselighed: Tilsæt 200 μL 95 % ethanol (eller 30 % eddikesyre, afhængigt af standard laboratoriepraksis) til hver brønd for at opløse den bundne krystalviolet. Bland forsigtigt ved at pipettere eller ryste pladen i 10 minutter ved stuetemperatur.
7. Måling: Mål den optiske densitet (OD) af den opløselige krystalviolette opløsning ved 570 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
8. Dataanalyse: Træk den gennemsnitlige OD570-værdi af negative kontroller (brønde med TSB, men intet bakterielt inokulum) fra eksperimentelle brønde for at tage højde for baggrundsfarvning. Registrer og analysér dataene.

Bemærk: Udfør eksperimentet i tre eksemplarer for hver betingelse for at sikre reproducerbarhed. Sørg for korrekt håndtering af krystalviolet og ethanol under overholdelse af sikkerheds- og bortskaffelsesprotokoller.
 

De vigtigste fordele ved UIP400MTP på et øjeblik:

• Behandling med høj kapacitet: Designet specielt til plader med flere brønde, så du kan behandle flere prøver samtidigt.
• Ensartet ultralydsfordeling: Sikrer ensartet ultralydsintensitet på tværs af brønde, hvilket giver ensartede resultater på tværs af alle prøver.
• Brug en hvilken som helst standardplade: UIP400MTP kan håndtere alle standard multi-brønds plader, petriskåle og rørstativer. Ingen dyre proprietære plader kræves!
• Brugervenlig grænseflade: Nem at sætte op og kontrollere, hvilket gør den til et fremragende værktøj til at øge laboratorieproduktiviteten. Programmerbare indstillinger og automatisering letter processtandardisering!