Protokol med sonikatorer til flere prøver fra Hielscher til biofilm- og proteomanalyse

Brugen af sonikatorer til flere prøver, såsom VialTweeter Multi-Tube Sonicator og UIP400MTP Microplate Sonicator, strømliner laboratoriets arbejdsgange til anvendelser med høj prøvekapacitet. Begge enheder muliggør præcis og ensartet ultralydsbehandling af flere prøver, hvilket minimerer variationen og forbedrer reproducerbarheden. Dette er særligt fordelagtigt i forsøg, der kræver ensartet prøvelyse, biofilmløsning, proteinekstraktion eller proteolytisk nedbrydning, hvor manuelle metoder eller metoder til enkeltprøver er mindre effektive og tilbøjelige til at give uensartede resultater.

Strømlin arbejdsgange med sonikatorer til flere prøver

UIP400MTP muliggør eksempelvis samtidig ultralydsbehandling af brønde i mikroplader og sikrer dermed ensartet løsning af biofilm eller cellemateriale. VialTweeter tilbyder samtidig præcis lyse og homogenisering af flere prøver i rør uden krydskontaminering. Disse sonikatorer reducerer behandlingstiderne betydeligt, forbedrer forsøgenes reproducerbarhed og opretholder høj prøveintegritet, hvilket gør dem til uundværlige værktøjer inden for mikrobiologisk, proteomisk og molekylærbiologisk forskning.
Nedenfor findes en detaljeret protokol, der eksemplificerer brugen af Hielschers sonikatormodeller til flere prøver, VialTweeter Multi-Tube Sonicator og Microplate Sonicator UIP400MTP, i et studie af biofilmdannelse hos E. coli og efterfølgende proteomanalyse.

Protokol: Biofilmdannelse, løsning af biofilm og proteomanalyse med sonikatorer til flere prøver fra Hielscher

1. Forberedelse af bakteriekultur

• Dyrk E. coli-bakterier (stamme W3110) ved 30°C, en temperatur, der er gunstig for biofilmdannelse hos E. coli, i et tryptonbouillonmedium (TB), der indeholder:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• Tilsæt antibiotika efter behov for at sikre, at plasmiderne bevares.
• Til mikroskopi og undersøgelser af promotoraktivitet anvendes E. coli-stammen W3110 med en genomisk reporter for forstærket GFP (eGFP) under kontrol af rplL-promotoren.
• Anvend GFP-reporterplasmider til forskellige promotorer (f.eks., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) til at måle promotorernes aktivitet.

2. Dyrkning og løsning af biofilm

• Udså 1,5 mL fortyndet bakteriekultur pr. brønd i en plade med 12 brønde (CellStar-plader med 12 brønde, Greiner Bio-One).
• Inkubér for at muliggøre biofilmdannelse.
• Fjern forsigtigt den planktoniske (ikke-adhærerende) kultur.

– Vask hver brønd med 500 µL PBS.
– Løsn de adhærerende celler ved at sonikere pladen med 12 brønde i mikropladesonikatoren UIP400MTP. UIP400MTP sikrer ensartet løsning ved at levere ensartet ultralydsenergi til alle brønde.
– Sonikeringsindstillinger: 60% amplitude, cyklustilstand: 60 sek. TIL / 30 sek. FRA.

3. Høst og lyse af celler

• Centrifugér de løsnede biofilmceller ved 4.500 g i 5 minutter.
• Vask de pelleterede celler med PBS.
• Resuspendér cellerne i 100 µL 2% natriumlauroylsarcosinat (SLS), og inkubér ved 95°C i 15 minutter.
• Sonikér med VialTweeter Multi-Tube Sonicator for at sikre fuldstændig cellelyse.
  – Sonikeringsindstillinger: 100% amplitude, 50 s TIL / 10 s FRA med en samlet driftstid på 10 min; hold prøverne på is.

4. Reduktion og alkylering

• Tilsæt 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) for at reducere disulfidbindinger, og inkubér ved 95°C i 15 minutter.
• Alkylér proteinerne med 10 mM iodacetamid i 30 minutter ved 25°C.

5. Proteinkvantificering og nedbrydning

• Centrifugér lysaterne for at fjerne cellefragmenter.
• Kvantificér det samlede proteinindhold med Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Nedbryd 50 µg samlet protein med 1 µg trypsin i en opløsning, der indeholder 2% SLS og 100 mM ammoniumhydrogencarbonat.
• Inkubér nedbrydningsreaktionen natten over ved 30°C.

6. Peptidoprensning

• Udfæld SLS ved at tilsætte 1,5% trifluoreddikesyre (TFA), og centrifugér derefter.
• Oprens peptiderne med C18-mikrocentrifugekolonner.
• Tør de oprensede peptider, og resuspendér dem i 0,1% TFA.

7. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS)

• Analysér peptiderne på et Q-Exactive Plus-massespektrometer koblet til et Ultimate 3000 RSLC nano-system.
• Adskil peptiderne med en HPLC-kolonne med omvendt fase (75 µm × 42 cm) pakket med C18-resin (2,4 µm).
• Anvend en gradient fra 2% til 35% opløsningsmiddel B (acetonitril med 0,15% myresyre) over 140 minutter.
• Indsaml data ved hjælp af højopløselige scanninger med MS efterfulgt af scanninger med tandem MS/MS af de 10 mest intense ioner.

8. Dataanalyse

• Behandl rådata fra LC-MS med softwaren Progenesis.
• Eksportér .mgf-filer, og analysér dem med MASCOT.
• Udfør peptidkvantificering med SafeQuant til kvalitetskontrol og korrektion for falske fund.
• Udfør alle forsøg i duplikat eller triplikat for at sikre reproducerbarhed.

Sonikatorer til flere prøver til prøveforberedelse med høj prøvekapacitet

Sonikatormodellerne VialTweeter og UIP400MTP til flere prøver forbedrer forsøgsarbejdsgangenes præcision og effektivitet betydeligt, især inden for biofilmforskning og proteomik. Deres evne til at behandle flere prøver ensartet sikrer høj prøvekapacitet uden at gå på kompromis med datakvaliteten. Disse fordele kombineret med de strømlinede arbejdsgange, der er beskrevet ovenfor, gør Hielschers sonikatorer til flere prøver til væsentlige værktøjer i moderne biologisk forskning.

Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielschers ultralydsapparater er kendt for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores ultralydsapparater i industrianlæg. Hielschers ultralydsapparater håndterer nemt barske forhold og krævende miljøer.

Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater overholder naturligvis CE-kravene og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.