Protokol ved hjælp af Hielscher Multi-Sample Sonicators i biofilm og proteomisk analyse

Brugen af multi-sample sonikere, såsom VialTweeter Multi-Tube Sonicator og UIP400MTP Microplate Sonicator, strømliner laboratoriearbejdsgange til applikationer med høj gennemstrømning. Begge enheder tillader præcis og ensartet ultralydsbehandling på tværs af flere prøver, hvilket minimerer variabiliteten og forbedrer reproducerbarheden. Dette er især fordelagtigt i forsøg, der kræver konsekvent prøvelysering, biofilmløsning, proteinekstraktion eller proteolytisk fordøjelse, hvor manuelle eller enkeltprøvemetoder er mindre effektive og tilbøjelige til inkonsistens.

Strømlin arbejdsgange med multi-sample sonikere

UIP400MTP muliggør f.eks. samtidig ultralydsbehandling af mikropladebrønde, hvilket sikrer ensartet løsrivelse af biofilm eller cellulært materiale. I mellemtiden tilbyder VialTweeter præcis lysering og homogenisering af flere rørprøver uden krydskontaminering. Disse sonikere reducerer behandlingstiderne betydeligt, forbedrer eksperimentel reproducerbarhed og opretholder høj prøveintegritet, hvilket gør dem til uundværlige værktøjer inden for mikrobiologi, proteomik og molekylærbiologisk forskning.
Nedenfor er en detaljeret protokol, der eksemplificerer brugen af Hielscher multi-sample sonicator-modellerne, VialTweeter Multi-Tube Sonicator og Microplate Sonicator UIP400MTP, i en undersøgelse, der involverer E. coli biofilmdannelse og efterfølgende proteomisk analyse.

Protokol: Biofilmdannelse, løsrivelse og proteomisk analyse ved hjælp af Hielscher multi-sample sonikere

1. Forberedelse af bakteriekultur

• Kultur E. coli-bakterier (stamme W3110) ved 30 °C, en temperatur, der er gunstig for dannelse af E. coli-biofilm, i tryptonbouillon (TB) medium indeholdende:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• Suppler med antibiotika efter behov for at sikre plasmidretention.
• Til mikroskopi- og promotoraktivitetsundersøgelser anvendes W3110 E. coli-stammen med en genomisk forstærket GFP (eGFP) reporter under kontrol af rplL-promotoren.
• Brug GFP-reporterplasmider til forskellige promotorer (f.eks. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) til at måle initiativtagernes aktiviteter.

2. Dyrkning og løsrivelse af biofilm

• Frø 1,5 ml fortyndet bakteriekultur pr. brønd i en 12-brønds plade (CellStar 12-brønds plader, Greiner Bio-One).
• Inkuber for at tillade dannelse af biofilm.
• Fjern den planktoniske (ikke-vedhæftende) kultur forsigtigt.

– Vask hver brønd med 500 μL PBS.
– Afmonter vedhæftede celler ved at sonikere 12-brønds pladen i UIP400MTP mikroplade sonikator. UIP400MTP sikrer en ensartet løsrivelse ved at levere ensartet ultralydsenergi på tværs af alle brønde.
– Sonikeringsindstillinger: 60% amplitude, cyklustilstand: 60 sek ON / 30 sek OFF.

3. Cellehøst og lysis

• Separerede biofilmceller centrifugeres ved 4.500 g i 5 minutter.
• Vask pelleterede celler med PBS.
• Resuspender celler i 100 μL 2% natriumlaurylsarcosinat (SLS) og inkuber ved 95°C i 15 minutter.
• Soniker ved hjælp af VialTweeter Multi-Tube Sonicator for at sikre fuldstændig cellelyse.
  – Sonikeringsindstillinger: 100% amplitude, 50 s ON / 10 s OFF i 10 minutters samlet køretid; Hold prøverne på is.

4. Reduktion og alkylering

• Tilsæt 5 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) for at reducere disulfidbindinger og inkuber ved 95 ° C i 15 minutter.
• Alkylatproteiner med 10 mM iodoacetamid i 30 minutter ved 25°C.

5. Proteinkvantificering og fordøjelse

• Centrifuger lysater for at fjerne snavs.
• Kvantificer det samlede proteinindhold ved hjælp af Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Fordøjes 50 μg protein i alt med 1 μg trypsin i en opløsning indeholdende 2% SLS og 100 mM ammoniumbicarbonat.
• Inkuber fordøjelsesreaktionen natten over ved 30°C.

6. Peptid oprensning

• Udfæld SLS ved at tilsætte 1,5 % trifluoreddikesyre (TFA), og centrifuger derefter.
• Peptider renses ved hjælp af C18 microspin-kolonner.
• Tørrensede peptider og resuspenderes i 0,1% TFA.

7. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS)

• Analyser peptider på et Q-Exactive Plus massespektrometer kombineret med et Ultimate 3000 RSLC nanosystem.
• Adskil peptider ved hjælp af en omvendt fase HPLC-kolonne (75 μm × 42 cm) pakket med C18-harpiks (2,4 μm).
• Påfør en gradient fra 2 % til 35 % opløsningsmiddel B (acetonitril med 0,15 % myresyre) over 140 minutter.
• Indhent data ved hjælp af MS-scanninger i høj opløsning efterfulgt af tandem MS/MS-scanninger af de 10 mest intense ioner.

8. Analyse af data

• Behandl rå LC-MS-data ved hjælp af Progenesis-software.
• Eksporter .mgf-filer, og analysér dem med MASCOT.
• Udfør peptidkvantificering ved hjælp af SafeQuant til kvalitetskontrol og justering af falsk opdagelse.
• Udfør alle eksperimenter i dubletter eller tre eksemplarer for at sikre reproducerbarhed.

Multi-sample Sonicators til prøveforberedelse med høj kapacitet

Multi-sample sonikermodellerne VialTweeter og UIP400MTP forbedre præcisionen og effektiviteten af eksperimentelle arbejdsgange betydeligt, især inden for biofilmforskning og proteomics. Deres evne til at behandle flere prøver ensartet sikrer høj kapacitet, uden at gå på kompromis med datakvaliteten. Disse fordele, kombineret med de strømlinede arbejdsgange, der er skitseret ovenfor, gør Hielscher multi-sample sonicators til vigtige værktøjer til moderne biologisk forskning.

Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Hårde forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydsapparater.

Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.