Ekstraktion af ekstracellulær matrix med sonikatoren UIP400MTP til 96-brøndsplader

Traditionelle metoder til ekstraktion af ekstracellulær matrix (EM) omfatter ofte flere trin til at nedbryde biofilmens matrix. Disse teknikker kan dog være tidskrævende og give uensartede resultater, hvilket medfører variation i resultaterne. Med sonikatoren UIP400MTP til 96-brøndsplader lettes EM-ekstraktionen betydeligt, så biofilm kan nedbrydes yderst effektivt, præcist og ensartet i formater med høj prøvekapacitet. UIP400MTP bruger fokuseret ultralyd til at generere kontrolleret kavitation, som effektivt nedbryder biofilmens matrix, samtidig med at levedygtigheden og integriteten af celler indlejret i biofilmen bevares. Brug af UIP400MTP forbedrer reproducerbarheden og nøjagtigheden af efterfølgende analyser, såsom metabolomiske og proteomiske analyser, levedygtighedstests og undersøgelser af følsomhed over for antimikrobielle midler. Ved at effektivisere EM-ekstraktionen gør UIP400MTP det muligt for forskere at opnå ensartede resultater af høj kvalitet og få dybere indsigt i biofilmens dynamik og interaktioner med eksterne påvirkninger.

Ekstraktion af ekstracellulær matrix

Den ekstracellulære matrix (EM) er en afgørende bestanddel af biofilm dannet af mikroorganismer såsom Candida albicans. EM består af polysakkarider, proteiner, lipider og ekstracellulært DNA, sikrer strukturel integritet, formidler adhæsion til overflader og bidrager væsentligt til antimikrobiel resistens. Ekstraktion og analyse af EM er afgørende for at forstå biofilmens biologi, klarlægge mekanismerne bag lægemiddelresistens og identificere nye terapeutiske mål.

Protokol til ekstraktion af ekstracellulær matrix (EM) fra Candida albicans-biofilm med UIP400MTP

Denne protokol fokuserer på ekstraktion af den ekstracellulære matrix (EM) fra statiske Candida albicans-biofilm. Sonikatoren UIP400MTP integreres for at erstatte traditionelle skrabetrin eller enzymbaserede trin og dermed forbedre effektiviteten og reproducerbarheden.

Nødvendige materialer

Trinvise anvisninger til EM-ekstraktion

1. Dannelse af statisk biofilm
   For statiske biofilm inokuleres C. albicans i brøndene på en 96-brøndsplade med RPMI-1640-medium. Hver brønd bør indeholde samme volumen inokulum (f.eks. 200 µL pr. brønd).
   Inkubér pladen ved 37°C under statiske betingelser i 24 timer, så der kan dannes biofilm på brøndenes overflader.
2. Klargøring af biofilm til ekstraktion
   Efter inkubation aspireres og kasseres det brugte medium forsigtigt fra hver brønd uden at forstyrre biofilmen.
   Skyl hver brønd forsigtigt med steril PBS (f.eks. 200 µL) for at fjerne løst bundne celler og planktoniske rester. Gentag dette trin to gange.
   Tilsæt frisk PBS eller ekstraktionsbufferen (f.eks. 200 µL) til hver brønd som forberedelse til sonikering.
3. Sonikering med UIP400MTP
   Anbring 96-brøndspladen med PBS eller ekstraktionsbuffer i bakken på sonikatoren UIP400MTP. Følg anvisningerne i manualen for at placere multibrøndspladen korrekt.
   Sonikér i 5–6 minutter ved en skånsom indstilling (60% amplitude, pulstilstand), så biofilmens struktur nedbrydes ensartet, og EM-komponenterne frigives.
   Brug temperaturstyringen på sonikatoren UIP400MTP (temperatursensor og indstillinger) for at undgå overdreven opvarmning eller beskadigelse af prøverne.
4. Behandling med kationbytterharpiks (CER)
   Overfør den sonikerede væske fra hver brønd til en ny 96-brøndsplade.
   Tilsæt et dobbelt så stort volumen CER-suspension (fremstillet i PBS eller buffer) til hver brønd (f.eks. 400 µL samlet volumen pr. brønd).
   Forsegl pladen, og inkubér den på en pladeryster eller rotator ved 400 rpm i 3 timer for at muliggøre binding og isolering af EM-komponenter.
5. Separation og filtrering
   Centrifugér pladen ved 2.000 × g i 10 minutter for at adskille harpiksen og cellerne fra supernatanten.
   Overfør forsigtigt den EM-holdige supernatant fra hver brønd til en ny 96-brøndsplade.
   Filtrér supernatanten gennem et 0,22 µm filter ved hjælp af et vakuummanifoldsystem til plader eller et tilsvarende system for at opnå et rent EM-ekstrakt.
6. Analyse af EM
   Brug teknikker såsom UPLC-Q-TOF-MS til ikke-målrettet metabolitprofilering, eller anvend specifikke analyser (f.eks. BCA til proteiner samt kits til kvantificering af triglycerider og kulhydrater) til at karakterisere EM-komponenter.

Ekstraktion af ekstracellulær matrix med høj prøvekapacitet

Den høje effektivitet ved ekstraktion af ekstracellulær matrix (EM) med sonikatoren UIP400MTP har revolutioneret prøveforberedelsen til analyser, der kræver nøjagtig undersøgelse af biofilmens egenskaber. UIP400MTP bruger ultralydsbølger til præcist og ensartet at nedbryde biofilmens matrix, så EM-komponenterne frigives effektivt, samtidig med at cellernes levedygtighed og integritet bevares. Denne fremgangsmåde forbedrer betydeligt pålideligheden af analyser såsom tests af biofilmens levedygtighed, proteomiske og metabolomiske undersøgelser samt vurderinger af følsomhed over for antimikrobielle midler.

Ved analyser af genvinding af biofilmceller, såsom optælling af kolonidannende enheder (CFU), sikrer EM-ekstraktion med UIP400MTP, at reagenser får uhindret adgang til celler indlejret i biofilmen. Tilsvarende drager proteomiske og metabolomiske analyser, såsom UPLC-Q-TOF-MS, fordel af isolering af proteiner, lipider og metabolitter med højt udbytte. UIP400MTP understøtter også præcis testning af følsomhed over for antimikrobielle midler, hvilket muliggør nøjagtig bestemmelse af biofilmens MIC- og MBEC-værdier. Desuden understøtter den effektive ekstraktion med UIP400MTP analyser af enzymaktivitet, kvantificering af komponenter og strukturelle undersøgelser og giver værdifuld indsigt i ekstracellulære matricers rolle i biofilmens arkitektur, adhæsion og resistensmekanismer.

Denne reproducerbare ekstraktionsmetode med høj prøvekapacitet optimerer EM-præparationen og sikrer overlegne resultater i en række biofilmrelaterede analyser.