ASTM E2799-22-protokol til evaluering af antimikrobiel effekt

Hielscher UIP400MTP er en kraftfuld og effektiv sonikeringsenhed til multibrøndplader, der er udviklet til at effektivisere sonikeringstrinnet i ASTM E2799-22-protokollen. Ved at tilføre ensartet ultralydsenergi over hele mikrotiterpladen sikrer UIP400MTP ensartet og pålidelig frigørelse af biofilm fra låg med tappe uden at beskadige cellerne eller kompromittere prøvernes integritet. Dens høje prøvekapacitet og brugervenlige betjening reducerer behandlingstiden betydeligt og forbedrer samtidig reproducerbarheden, hvilket gør den til en ideel løsning til laboratorier, der udfører analyser af biofilms levedygtighed og tester antimikrobiel effekt.

ASTM E2799

ASTM E2799 er en standardiseret testmetode, der er udviklet til at evaluere antimikrobielle midlers effekt mod biofilm med særligt fokus på Pseudomonas aeruginosa. Biofilm er komplekse mikrobielle samfund, der hæfter sig til overflader og udviser øget resistens over for antimikrobielle behandlinger, hvilket gør dem til en betydelig udfordring inden for sundhedsvæsenet, industrien og miljøområdet. Metoden anvender en analyse af den minimale biofilmeradikationskoncentration (MBEC) til at skabe en pålidelig og reproducerbar ramme for test af desinfektionsmidler under realistiske biofilmforhold.

Hvordan bidrager sonikering til ASTM E2799?

Sonikering spiller en afgørende rolle i ASTM E2799-protokollen ved at lette frigørelsen af biofilm fra testoverflader og dermed sikre en nøjagtig vurdering af mikroorganismernes levedygtighed efter behandling. Ved at anvende kontrolleret ultralydsenergi opnår protokollen effektiv og ensartet nedbrydning af biofilm uden at beskadige cellerne, hvilket muliggør præcise og reproducerbare resultater. Dette gør ASTM E2799 til et vigtigt værktøj til at fremme biofilmforskningen og udvikle effektive antimikrobielle strategier.

Sådan udføres MBEC-analysen i overensstemmelse med ASTM E2799-22

ASTM E2799-22-protokollen beskriver trinnene til evaluering af antimikrobielle midlers effekt mod biofilm. Ved brug af sonikeringsenheden Hielscher UIP400MTP til mikrotiterplader kan protokollen tilpasses, så denne avancerede sonikeringsmetode indgår i frigørelsen af biofilm. Nedenfor beskrives trinnene tilpasset brugen af sonikeringsenheden UIP400MTP til mikroplader:

1. Forberedelse af biofilm
   Klargør en steril 96-brønds mikrotiterplade med aftagelige stiftlåg.
   Inokulér brøndene med en standardiseret bakteriesuspension i et egnet vækstmedium.
   Placér stiftlåget på pladen, og sørg for, at stifterne er helt nedsænket i bakteriesuspensionen.
   Inkubér pladen under kontrollerede forhold (f.eks. temperatur og tid) for at tillade biofilmdannelse på stifterne.
2. Behandling med antimikrobielle midler
   Efter biofilmdannelse udskiftes mediet med frisk medium, der indeholder de testede antimikrobielle midler i forskellige koncentrationer.
   Sæt stiftlåget på igen, og inkubér under de betingelser, der er angivet i testdesignet.
3. Forberedelse til frigørelse af biofilm
   Efter behandlingen skylles stiftlåget ved at nedsænke det i en steril skylleopløsning for at fjerne resterende antimikrobielle midler og løst vedhæftede planktoniske celler.
4. Frigørelse af biofilm med sonikeringsenheden UIP400MTP
   Klargør en frisk 96-brønds mikrotiterplade indeholdende et genopretningsmedium (f.eks. neutraliserende bouillon).
   Løsriv biofilmene ved at placere stiftlåget i brøndene på genopretningsmediepladen.
   Indsæt pladen i ultralydsapparatet UIP400MTP, og sørg for, at låg og plade flugter korrekt.
   Indstil ultralydsapparatet til 70%-80% amplitude, og sonikér i 3-4 minutter i cyklustilstand for at sikre ensartet biofilmløsrivelse uden cellelyse.
5. Vurdering af biofilms levedygtighed
   Efter sonikering behandles genvindingsmediet, der indeholder frigjorte biofilmceller, ved hjælp af standardiserede mikrobiologiske eller analytiske teknikker, såsom:
   • Tælling af kolonidannende enheder (CFU): Udfør seriefortyndinger, og udpladér på agar til optælling af levedygtige celler.
   • Målinger af optisk densitet (OD): Brug spektrofotometrisk analyse til at vurdere celletætheden.
   • Fluorescensbaserede levedygtighedsanalyser: Kvantificer levende og døde celler ved hjælp af fluorescerende farvestoffer.
6. Dataanalyse
   Sammenlign data om levedygtighed for behandlede og ubehandlede biofilm for at bestemme de antimikrobielle midlers effekt.
   Beregn den minimale biofilmeradikationskoncentration (MBEC) ud fra den koncentration, der er nødvendig for at eliminere levedygtige biofilmceller.
7. Kvalitetskontrol
   Sørg for ensartede sonikeringsbetingelser ved regelmæssigt at kalibrere UIP400MTP og kontrollere, at processen til frigørelse af biofilm ikke medfører væsentlig cellelysis eller celledestruktion.
   Medtag passende kontroller, såsom ubehandlede biofilm og blindprøver, der kun indeholder medium, for at validere resultaterne.

De biofilmdannende celler på stifterne blev løsnet ved sonikering (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Tyskland, UIP250MTP) i 5 min i 96-brøndsplader indeholdende frisk dyrkningsmedium til genvinding af cellerne.
(Billede og studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Ved at integrere UIP400MTP i arbejdsgangen for ASTM E2799-22 optimeres processen til frigørelse af biofilm med hensyn til ensartethed, effektivitet og anvendelser med høj prøvekapacitet.