MBEC Assay Protocol ved hjælp af 96-brønds Plate Sonicator UIP400MTP

MBEC-analysen bruges til at bestemme koncentrationen af antimikrobielle midler, der er nødvendige for at eliminere biofilm dannet på pindlåg. For at vurdere biofilmens levedygtighed skal biofilmene først løsnes fra pindlågene på en plade med 96 brønde. Sonikering er den mest pålidelige og effektive metode til denne løsrivelse. Multi-brønds plade soniker UIP400MTP er specielt designet til at behandle analyseplader med maksimal effektivitet og bekvemmelighed, strømline og accelerere MBEC-analyser med høj gennemstrømning.

Sonikering til biofilmløsrivelse

Sonikering er et afgørende skridt i MBEC-analyser (Minimum Biofilm Eradication Concentration), der muliggør effektiv løsrivelse af biofilmceller fra deres overfladevedhæftning. Biofilm er i sagens natur strukturerede samfund af mikroorganismer indkapslet i en ekstracellulær matrix, hvilket gør dem betydeligt mere modstandsdygtige over for antimikrobielle midler sammenlignet med planktonceller. Under MBEC-analyser bruger sonikering ultralydbølger til at generere kontrolleret kavitation, forstyrre biofilmmatrixen og frigive indlejrede celler i en suspension. Dette trin sikrer, at biofilmcellerne er jævnt fordelt i genvindingsmediet, hvilket letter nøjagtige levedygtighedsvurderinger gennem plettering, fortynding eller spektrofotometriske metoder. Uden korrekt biofilmløsning kan resterende matrixkomponenter beskytte celler, hvilket fører til undervurdering af antimikrobiel effektivitet. Derfor er sonikering uundværlig for at opnå pålidelige og reproducerbare MBEC-værdier, der afspejler det sande udryddelsespotentiale for de testede midler. Multi-brønds plade sonicator giver UIP400MTP mulighed for letkøbsprøveforberedelse med høj kapacitet i analyseplader.

Mindste analyseprotokol for biofilmudryddelse (MBEC)

Trin 1: Biofilmdannelse

1. Forbered bakteriesuspensionen:
   Dyrk bakterier i passende medier til log-fase vækst.
   Fortynd bakteriekulturen til en defineret optisk tæthed (f.eks. OD600 ~0,1).
2. Inokuler pladen med 96 brønde:
   Tilsæt bakteriesuspensionen (f.eks. 150-200 μL) i hver brønd i en standard 96-brønds mikrotiterplade.
3. Fastgør pløkkelåget:
   Placer pløklåget på den inokulerede plade for at tillade biofilmdannelse på pløkoverfladerne.
4. Inkuber pladen:
   Inkuber opsætningen ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i 24-48 timer uden at ryste for at fremme biofilmvækst.

Trin 2: Behandling med antimikrobielle midler

• Forbered antimikrobielle opløsninger:
  Forbered en række antimikrobielle koncentrationer i friske medier.
  Udsæt biofilm for antimikrobielle midler:
  Fjern pindlåget fra bakteriekulturen og skyl det i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne planktonceller.
  Placer pløklåget i en ny 96-brønds plade, der indeholder de antimikrobielle opløsninger.
• Inkuber pladen:
  Inkuber i en defineret periode (f.eks. 24 timer) for at muliggøre antimikrobiel eksponering.

Trin 3: Sonikering med 96-brønds plade Sonicator UIP400MTP

Sonikeringstrinnet er afgørende for at løsne biofilm fra pindlågene for at vurdere levedygtigheden. Følg disse trin for den UIP400MTP soniker:

1. Forbered opsætningen:
   Fyld en frisk 96-brønds tallerken med genopretningsmedium (f.eks. neutraliserende bouillon eller frisk vækstmedium) i hver brønd.
2. Overfør pløklåget:
   Fjern pløklåget fra den antimikrobielle behandlingsplade.
   Skyl pindlåget i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne resterende antimikrobielle midler.
3. Placer pladen og sonikeren:
   Fastgør pløklåget til genvindingsmediepladen.
   Placer gendannelsesmediepladen på den UIP400MTP sonikerplatform, og sørg for, at pladen er centreret og stabil.
4. Juster sonikeringsparametre:
   Indstil sonikeringsparametrene på UIP400MTP (Indstillinger kan justeres til biofilmen):
   Amplitude: 70-100%.
   Sonikeringstid: 1-3 minutter (juster baseret på biofilmens robusthed) i cyklustilstand.
5. Ultralydsbad:
   Start sonikeringsprocessen. Ultralydsvibrationen vil løsne biofilmene fra pindoverfladerne til genvindingsmediet.
6. Overvåg processen:
   Brug den tilsluttelige temperatursensor til at overvåge sample temperatur i brøndene. UIP400MTP kan tilsluttes en laboratoriekøler til køling.
7. Håndtering efter sonikering:
   Genvindingsmediet (nu indeholdende løsrevne biofilm) overføres straks til en frisk steril plade til downstream-analyse.

(A) Plade indeholdende TSB med 2% glukose, der anvendes til biofilmdannelse, cellegenvinding og
bestemmelse af MIC og MBCB; B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm. bestemmelse af MIC og MBCB; B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm.
Biofilmcellerne dannet på stifterne blev løsnet ved sonikering (Hielscher ultralydsteknologi) i 5 minutter i 96-brønds plader indeholdende frisk dyrkningsmedium til gendannelse af cellerne.
(Billede og studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Trin 4: Vurdering af levedygtighed

Folie- og kulturløsrevne biofilm:

1. Udfør serielle fortyndinger af genvindingsmediet og pladen på agar for at tælle kolonidannende enheder (CFU).
   Alternativt kan du bruge en kolorimetrisk eller fluorescensbaseret levedygtighedsanalyse.
2. Rekord resultater:
   Bestem MBEC som den laveste koncentration af antimikrobielt stof, der udryddede påviselig biofilmlevedygtighed.

Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Barske forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher sonikere.

Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.

Læs her, hvordan UIP400MTP bruges til biofilmløsning som et prøveforberedelsestrin under ASTM E2799-protokollen til test af desinfektionsmiddeleffektivitet mod Pseudomonas aeruginosa biofilm ved hjælp af MBEC-analysen.