MBEC-analyseprotokol med sonikatoren UIP400MTP til 96-brøndsplader

MBEC-analysen bruges til at bestemme den koncentration af antimikrobielle midler, der er nødvendig for at eliminere biofilm dannet på stiftlåg. For at vurdere biofilmens levedygtighed skal biofilmen først løsnes fra stiftlågene på en 96-brøndsplade. Sonikering er den mest pålidelige og effektive metode til denne løsrivelse. Sonikatoren UIP400MTP til flerbrøndsplader er specielt udviklet til at behandle analyseplader med maksimal effektivitet og brugervenlighed og dermed effektivisere og fremskynde MBEC-analyser med høj prøvekapacitet.

Sonikering til løsrivelse af biofilm

Sonikering er et afgørende trin i analyser af minimumskoncentrationen til eradikation af biofilm (MBEC) og muliggør effektiv løsrivelse af biofilmceller fra den overflade, de er fastgjort til. Biofilm er i deres natur strukturerede samfund af mikroorganismer indlejret i en ekstracellulær matrix, som gør dem væsentligt mere resistente over for antimikrobielle midler end planktoniske celler. Under MBEC-analyser anvender sonikering ultralydsbølger til at frembringe kontrolleret kavitation, som bryder biofilmmatricen op og frigiver de indlejrede celler til en suspension. Dette trin sikrer, at biofilmcellerne fordeles jævnt i restitutionsmediet, hvilket muliggør nøjagtige vurderinger af levedygtigheden ved udpladning, fortynding eller spektrofotometriske metoder. Uden korrekt løsrivelse af biofilmen kan resterende matrixkomponenter beskytte cellerne og føre til en undervurdering af den antimikrobielle effekt. Sonikering er derfor uundværlig for at opnå pålidelige og reproducerbare MBEC-værdier, som afspejler de testede midlers reelle eradikationspotentiale. Sonikatoren UIP400MTP til flerbrøndsplader muliggør enkel prøveforberedelse med høj prøvekapacitet i analyseplader.

Analyseprotokol for minimumskoncentrationen til eradikation af biofilm (MBEC)

Trin 1: Dannelse af biofilm

1. Forbered bakteriesuspensionen:
   Dyrk bakterier i egnede medier, indtil de er i den logaritmiske vækstfase.
   Fortynd bakteriekulturen til en defineret optisk densitet (f.eks. OD600 ~0,1).
2. Inokulér 96-brøndspladen:
   Tilsæt bakteriesuspensionen (f.eks. 150–200 µL) til hver brønd i en standardmikrotiterplade med 96 brønde.
3. Sæt stiftlåget på:
   Anbring stiftlåget på den inokulerede plade, så biofilm kan dannes på stifternes overflader.
4. Inkubér pladen:
   Inkubér opstillingen ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i 24–48 timer uden omrystning for at fremme biofilmvækst.

Trin 2: Behandling med antimikrobielle midler

• Forbered antimikrobielle opløsninger:
  Forbered en række koncentrationer af antimikrobielle midler i friske medier.
  Eksponér biofilmene for antimikrobielle midler:
  Fjern stiftlåget fra bakteriekulturen, og skyl det i steril saltvandsopløsning eller PBS for at fjerne planktoniske celler.
  Anbring stiftlåget i en ny 96-brøndsplade, der indeholder de antimikrobielle opløsninger.
• Inkubér pladen:
  Inkubér i en defineret periode (f.eks. 24 timer), så biofilmene eksponeres for de antimikrobielle midler.

Trin 3: Sonikering med sonikatoren UIP400MTP til 96-brøndsplader

Sonikeringstrinnet er afgørende for at løsne biofilmene fra stiftlågene, så levedygtigheden kan vurderes. Følg disse trin ved brug af sonikatoren UIP400MTP:

1. Forbered opstillingen:
   Fyld hver brønd i en ny 96-brøndsplade med restitutionsmedium (f.eks. neutraliserende bouillon eller frisk vækstmedium).
2. Overfør stiftlåget:
   Fjern stiftlåget fra pladen til antimikrobiel behandling.
   Skyl stiftlåget i steril saltvandsopløsning eller PBS for at fjerne rester af antimikrobielle midler.
3. Placér pladen og sonikatoren:
   Sæt stiftlåget på pladen med restitutionsmedium.
   Anbring pladen med restitutionsmedium på platformen på sonikatoren UIP400MTP, og sørg for, at pladen er centreret og står stabilt.
4. Justér sonikeringsparametrene:
   Indstil sonikeringsparametrene på UIP400MTP (indstillingerne kan tilpasses biofilmen):
   Amplitude: 70–100%.
   Sonikeringstid: 1–3 minutter (justér efter biofilmens robusthed) i cyklustilstand.
5. Sonikér:
   Start sonikeringsprocessen. Ultralydsvibrationerne vil løsne biofilmene fra stifternes overflader og overføre dem til restitutionsmediet.
6. Overvåg processen:
   Brug temperatursensoren med stiktilslutning til at overvåge prøvetemperaturen i brøndene. UIP400MTP kan tilsluttes en laboratoriekøler til køling.
7. Håndtering efter sonikering:
   Overfør straks restitutionsmediet (som nu indeholder løsrevne biofilm) til en ny steril plade til efterfølgende analyse.

(A) Plade med TSB med 2% glukose anvendt til biofilmdannelse, genvinding af celler og
bestemmelse af MIC og MBCB; (B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm. bestemmelse af MIC og MBCB; (B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm.
Biofilmcellerne, der var dannet på stifterne, blev løsnet ved sonikering (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 min i 96-brøndsplader med frisk dyrkningsmedium til genvinding af cellerne.
(Billede og undersøgelse: ©de Oliveira et al., 2016)

Trin 4: Vurdering af levedygtighed

Udplad og dyrk de løsrevne biofilm:

1. Foretag seriefortyndinger af restitutionsmediet, og udplad på agar for at tælle kolonidannende enheder (CFU).
   Brug alternativt en kolorimetrisk eller fluorescensbaseret levedygtighedsanalyse.
2. Registrér resultaterne:
   Bestem MBEC som den laveste koncentration af det antimikrobielle middel, der eliminerede påviselig levedygtighed i biofilmen.

Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielschers ultralydsapparater er kendt for deres højeste standarder for kvalitet og design. Robusthed og nem betjening gør det muligt at integrere vores ultralydsapparater problemfrit i industrianlæg. Hielschers sonikatorer håndterer let barske forhold og krævende miljøer.

Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater er naturligvis CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.

Læs her, hvordan UIP400MTP bruges til løsrivelse af biofilm som et prøveforberedelsestrin i ASTM E2799-protokollen til test af desinfektionsmidlers effekt mod Pseudomonas aeruginosa-biofilm ved hjælp af MBEC-analysen.