Protokol til analyse af minimum hæmmende koncentration (MIC)
Biofilm-Based Minimum Inhibitory Concentration (MIC)-analysen er en væsentlig metode til at evaluere effektiviteten af antimikrobielle midler mod biofilmassocierede mikroorganismer, som udviser øget resistens på grund af deres beskyttende ekstracellulære matrix. Et afgørende skridt i denne analyse er forstyrrelsen af biofilmstrukturer for at frigive indlejrede celler til nøjagtig levedygtighedsvurdering. Den UIP400MTP multi-brønds plade soniker letter denne proces ved at anvende fokuseret ultralyd til at generere kontrolleret kavitation, effektivt løsne biofilmceller og sprede dem i en ensartet suspension. Denne præcise og reproducerbare biofilmafbrydelse forbedrer pålideligheden og gennemstrømningen af MIC-analyser, hvilket gør UIP400MTP til et vigtigt værktøj til at fremme biofilmforskning.
Sonikering til biofilmløsrivelse
Den biofilmbaserede MIC-analyse måler typisk bakteriel levedygtighed eller væksthæmning ved hjælp af metoder såsom plettering, kolonitælling eller målinger af optisk tæthed. Sonikering er et kritisk trin i biofilmbaserede MIC-analyser ved vurdering af den antimikrobielle modtagelighed af biofilm-associerede mikroorganismer. Dens primære funktion er at løsne og sprede celler indlejret i biofilmmatrixen til en ensartet suspension for nøjagtig analyse.
Biofilm er betydeligt mere modstandsdygtige over for antimikrobielle midler sammenlignet med planktonceller, hvilket gør korrekt løsrivelse afgørende for nøjagtig analyse. Under denne proces genererer ultralydsbølger kontrolleret kavitation, der bryder biofilmmatrixen fra hinanden og frigiver indlejrede celler til en ensartet suspension i genvindingsmediet. Dette trin muliggør præcise levedygtighedsvurderinger af biofilmdispergerede celler gennem metoder som plettering, fortynding og kolonitælling. Korrekt biofilmafbrydelse via sonikering forhindrer resterende matrixkomponenter i at afskærme celler, hvilket ellers kan føre til en undervurdering af antimikrobiel aktivitet. Multi-brønds plade sonicator UIP400MTP er særligt velegnet til dette formål og tilbyder præcise og reproducerbare sonikeringsbetingelser for at sikre pålidelig og høj gennemstrømningsforberedelse af analyseplader.
UIP400MTP mikroplade sonikator til præcist kontrollerbar biofilmløsning i MIC- og MBEC-analyser.
Hvorfor sonikering er nødvendig i biofilmbaserede minimumshæmningskoncentrationsanalyser
Til levedygtighedsmålinger og celletælling kræves en komplet og pålidelig løsrivelse og spredning af enkelte celler. UIP400MTP fremmer en ensartet, ikke-skadelig biofilmløsning og celledispersion for robuste analyseresultater.
- Biofilm kompleksitet: Biofilm er strukturerede mikrobielle samfund indkapslet i en ekstracellulær polymer substans (EPS) matrix, som beskytter mikroorganismerne og gør dem mere modstandsdygtige over for antimikrobielle midler.
- Ensartet spredning: For nøjagtigt at måle levedygtigheden af biofilmindlejrede celler eller deres modtagelighed over for antimikrobielle stoffer, skal biofilmen først løsnes og nedbrydes til en homogen suspension.
Biofilmbaseret minimumshæmmende koncentrationsanalyseprotokol
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)-analysen bestemmer den laveste koncentration af et antimikrobielt middel, der kræves for at hæmme den synlige vækst af mikroorganismer. Denne protokol er designet til biofilm-associerede mikroorganismer ved hjælp af UIP400MTP multi-brønds plade soniker til biofilmafbrydelse.
Trin 1: Forberedelse af bakterielt inokulum
- Forbered bakteriesuspensionen:
Dyrk bakterier i passende medier til den midterste logaritmiske fase.
Fortynd kulturen for at opnå en standardiseret celletæthed (f.eks. 0,5 McFarland-standard eller OD600 ~0,1). - Forbered antimikrobielle opløsninger:
Det antimikrobielle middel fortyndes i et egnet medium for at skabe en række koncentrationer (f.eks. dobbelte seriefortyndinger). - Dispenser i 96-brøndspladen:
Tilsæt de antimikrobielle opløsninger i brøndene på en standard 96-brønds plade med et endeligt brøndvolumen på ~150-200 μL.
Inkluder vækstkontroller (ingen antimikrobielle stoffer) og sterilitetskontroller (ingen bakterielt podemateriale).
Trin 2: Biofilmdannelse på pindlåg
- Fastgør pløkkelåget:
Placer det specialiserede pløklåg på de inokulerede brønde, og sørg for, at pindene er helt nedsænket i bakteriesuspensionen. - Inkuber pladen:
Inkuber ved den passende temperatur (f.eks. 37 °C) i en bestemt varighed (f.eks. 24 timer) under statiske forhold for at tillade biofilmdannelse på pindene. - Skyl pindene:
Fjern pindlåget fra bakteriesuspensionen og skyl forsigtigt i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne løst fastgjorte planktonceller. - Udsæt for antimikrobielle stoffer:
Overfør pløklåget til en ny 96-brønds plade indeholdende de antimikrobielle fortyndinger, der er fremstillet tidligere.
Inkuber i en bestemt periode (f.eks. 24 timer) under statiske forhold for at tillade det antimikrobielle middel at virke på biofilmene.
Trin 3: Antimikrobiel eksponering
Multi-brønds plade soniker UIP400MTP til prøveforberedelse med høj kapacitet
Trin 4: Sonikering med mikroplade Sonicator UIP400MTP
Sonikeringstrinnet er afgørende for at løsne biofilm fra pindlågene for at vurdere levedygtigheden. Følg disse trin for den UIP400MTP soniker:
- Forbered opsætningen:
Fyld en frisk 96-brønds plade med genopretningsmedium (f.eks. neutraliserende bouillon eller sterilt vækstmedium) i hver brønd. - Overfør pløklåget:
Fjern pløklåget fra den antimikrobielle behandlingsplade.
Skyl pindlåget i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne resterende antimikrobielle midler. - Placer pladen i sonikeren:
Fastgør pløklåget til genvindingsmediepladen.
Placer gendannelsesmediepladen i UIP400MTP sonicator, og sørg for, at pladen sidder centreret og stabil som i den beskrevne manual. - Juster sonikeringsparametre:
Indstil sonikeringsparametrene på UIP400MTP (indstillingerne kan justeres til biofilmen):
Amplitude: 70-100%.
Sonikeringstid: 1-3 minutter (juster baseret på biofilmstruktur) i cyklustilstand. - Ultralydsbad:
Start sonikeringsprocessen. Ultralydsbølgerne vil forstyrre biofilmmatrixen og løsne cellerne i gendannelsesmediet. - Overvåg processen:
Brug den tilsluttelige temperatursensor til at overvåge sample temperatur i brøndene. UIP400MTP kan tilsluttes en laboratoriekøler til køling. - Håndtering efter sonikering:
Genvindingsmediet indeholdende løsrevne biofilm overføres straks til en ny steril plade til efterfølgende analyse.
(A) Plade indeholdende TSB med 2% glukose brugt til biofilmdannelse, cellegenvinding og bestemmelse af MIC og MBEC; B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm.
Trin 4: Vurdering af levedygtighed
Folie- og kulturløsrevne biofilm:
- Udfør serielle fortyndinger af genvindingsmediet og pladen på agar for at tælle kolonidannende enheder (CFU).
- Evaluer MIC:
Bestem MIC som den laveste antimikrobielle koncentration, der fuldstændigt hæmmer synlig mikrobiel vækst i genvindingsmediet.
MIC Minimum Inhibitory Concentration: Eksempel på mikrotiterplade og fortolkning af mikrofortyndingsresultater.
Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Barske forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher sonikere.
Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
Strømlin prøveforberedelse i 96-brønds plader og analyseplader Brug af multi-well plate sonicator UIP400MTP
Litteratur? Referencer
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Ofte stillede spørgsmål
Hvad er MIC-analysen?
MIC-analysen (Minimum Inhibitory Concentration) er en standardiseret test, der anvendes til at bestemme den laveste koncentration af et antimikrobielt middel, der er nødvendigt for at hæmme den synlige vækst af en mikroorganisme. Det udføres almindeligvis ved hjælp af bouillonmikrofortynding eller agarfortyndingsmetoder, hvor mikroorganismer udsættes for serielle fortyndinger af det antimikrobielle middel. MIC-analyser er afgørende for at evaluere antimikrobiel effektivitet, vejlede klinisk behandling og vurdere resistensniveauer i både planktoniske og biofilmassocierede mikroorganismer.
Hvad er forskellen mellem den biofilmbaserede minimumshæmmende koncentrationsanalyse og MBIC-analysen?
Den biofilmbaserede MIC-analyse (Minimum Inhibitory Concentration) og MBIC-analysen (Minimum Biofilm Inhibitory Concentration) er beslægtede, men forskellige i deres formål og metode.
Den biofilmbaserede MIC-analyse evaluerer den laveste koncentration af et antimikrobielt middel, der er nødvendigt for at hæmme synlig biofilmvækst eller levedygtighed, med fokus på biofilmassocierede celler snarere end planktonbakterier. I modsætning hertil måler MBIC-analysen specifikt et antimikrobielt middels evne til at forhindre biofilmdannelse i stedet for at behandle præformede biofilm. Mens begge analyser omhandler biofilmassocierede bakterier, adresserer det biofilmbaserede MIC-assay behandling, og MBIC-analysen lægger vægt på forebyggelse, hvilket gør dem til komplementære værktøjer til at studere antimikrobiel effekt mod biofilm.
Hvilke biofilm bruges i MIC-analyser?
Mikrobielle biofilm og planktonceller bruges begge i MIC-assays (Minimum Inhibitory Concentration) til at studere antimikrobiel effekt under forskellige forhold.
- Planktoniske celler:
Planktonceller er fritflydende, enkeltmikrobielle celler, der fungerer som standardmodel for traditionelle MIC-analyser. Almindelige mikroorganismer omfatter Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans. Disse analyser bestemmer den MIC, der kræves for at hæmme væksten af fritlevende celler, og er afgørende for indledende antimikrobiel screening. - Biofilm-associerede celler:
Biofilmceller er mikroorganismer indlejret i en ekstracellulær matrix, hvilket øger deres modstandsdygtighed over for antimikrobielle stoffer betydeligt. Biofilm MIC-analyser omfatter ofte:- Gramnegative bakterier: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae, kendt for biofilmdannelse i infektioner og industrielle omgivelser.
- Grampositive bakterier: Staphylococcus aureus (inklusive MRSA), Staphylococcus epidermidis og Enterococcus faecalis, der almindeligvis er involveret i enhedsrelaterede infektioner.
- Svampe: Candida albicans og beslægtede arter, vigtige i biofilm-relaterede svampeinfektioner.
- Biofilm af blandede arter: Disse bruges nogle gange til at replikere naturlige polymikrobielle biofilm, såsom dem, der findes i kroniske sår eller industriel biofouling.
Ved at sammenligne MIC-værdier for planktonceller og biofilmassocierede celler kan forskere vurdere den øgede resistens af biofilm og identificere midler, der er effektive mod disse mere modstandsdygtige mikrobielle samfund.
Hvad er forskellen mellem MIC og MBEC?
Den mindste hæmmende koncentration (MIC) er den laveste koncentration af et antimikrobielt middel, der kræves for at forhindre dannelse af biofilm, mens den mindste koncentration af udryddelse af biofilm (MBEC) er den laveste koncentration, der er nødvendig for at udrydde en etableret biofilm. MIC fokuserer på forebyggelse af biofilm, mens MBEC vurderer behandlingseffekten mod modne biofilm.
Hvilke plader bruges almindeligvis til MBEC-analyser?
Mikrotiterplader, der almindeligvis bruges til MBEC-analyser, er typisk 96-brønds plader lavet af polystyren eller polypropylen. Disse materialer giver en egnet overflade til biofilmdannelse og er kemisk resistente over for de antimikrobielle midler, der testes under analysen. Polystyrenplader foretrækkes i vid udstrækning på grund af deres optiske klarhed, hvilket er fordelagtigt til nedstrømsanalyser såsom spektrofotometriske eller fluorescensbaserede målinger. Designet af disse plader inkluderer aftagelige pløklåg, som er afgørende for analysen, da der dannes biofilm på pløkkerne, der er nedsænket i brøndene indeholdende vækstmedier. Standardiserede plader, såsom dem, der er i overensstemmelse med MBEC-analyseprotokollen, er specielt konstrueret til at sikre reproducerbarhed og kompatibilitet med UIP400MTP sonicator eller andet behandlingsudstyr.
Hvad er PEG-lågplader?
PEG-lågplader er specialiserede pladesystemer med flere brønde, hvor låget er udstyret med små polyethylenglycol (PEG) pinde eller stifter, der strækker sig ind i hver brønd. Disse pinde giver en overflade til mikrobiel biofilmdannelse under kontrollerede forhold, der efterligner biofilmvækst i den virkelige verden. Designet gør det muligt at udvikle biofilm på pløkkerne, mens brøndene indeholder vækstmedier eller antimikrobielle midler, hvilket muliggør high-throughput test af biofilmens følsomhed over for behandlinger, såsom i MBEC-, MBIC- og MIC-analyser.
Hvad er fordelen ved ultralydsbiofilm-forskydning sammenlignet med celleskrabning?
Ultralydsbiofilm-forskydning giver en betydelig fordel i forhold til celleskrabning ved at give en ikke-invasiv, ensartet og yderst effektiv metode til fjernelse af biofilm fra overflader. I modsætning til skrabning, som kan være inkonsekvent og beskadige den underliggende overflade eller celler, trænger ultralydsbølger ind i biofilmmatrixen og bryder den fra hinanden uden at kompromittere integriteten af tilstødende strukturer. Denne metode sikrer reproducerbarhed, minimerer risikoen for kontaminering og er særlig effektiv til applikationer, der kræver præcis fjernelse af biofilm, såsom i mikrobiologiske undersøgelser eller test af medicinsk udstyr. Læs mere, hvordan UIP400MTP Sonicator udmærker celleskrabning!
Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.