Protokol for analyse af minimal hæmmende koncentration (MIC)

Den biofilmbaserede analyse af minimal hæmmende koncentration (MIC) er en essentiel metode til at vurdere antimikrobielle midlers effektivitet mod biofilmassocierede mikroorganismer, som udviser øget resistens på grund af deres beskyttende ekstracellulære matrix. Et afgørende trin i denne analyse er at løsne biofilmstrukturer for at frigøre indlejrede celler til en nøjagtig vurdering af levedygtigheden. Sonikatoren til multibrøndplader UIP400MTP letter denne proces ved at anvende fokuseret ultralyd til at generere kontrolleret kavitation, som effektivt løsner biofilmceller og dispergerer dem i en ensartet suspension. Denne præcise og reproducerbare nedbrydning af biofilm forbedrer MIC-analysers pålidelighed og prøvegennemløb og gør UIP400MTP til et essentielt værktøj til at fremme biofilmforskningen.

Hvorfor bør jeg bruge sonikering under MIC-analyser?

• Nøjagtige, reproducerbare data: Opnå ensartede cellesuspensioner, som eliminerer matrixens beskyttende virkning og sikrer, at dine kolonitællinger og målinger af optisk densitet reelt afspejler de antimikrobielle midlers effektivitet.
• Effektivitet med højt prøvegennemløb: Behandl en hel 96-brøndsplade samtidigt på blot 1–3 minutter, og erstat langsom, uensartet manuel skrabning med en strømlinet arbejdsgang.
• Bevaret cellelevedygtighed: Løsn forsigtigt indlejrede celler uden de fysiske skader, som skrabning forårsager, og oprethold højere overlevelsesrater til pålidelige MIC/MBEC-beregninger.
• Ingen risiko for krydskontaminering: Drag fordel af et kontaktfrit design med et kopformet ultralydshorn, der behandler alle brønde ensartet, uden at sonder berører de enkelte prøver eller brønde.
• Overensstemmelse med standarder: Tilpas din metodik til validerede brancheprotokoller som ASTM E2799-22, så dine data får større troværdighed i forbindelse med myndighedskrav eller publikation.
• Pålidelig screening af lægemidler og behandlinger: Stol på dine resultater fra følsomhedsbestemmelser, så du kan træffe bedre beslutninger om antimikrobiel effektivitet, resistensprofilering eller udvikling af behandlinger.

Sonikering til løsning af biofilm

Den biofilmbaserede MIC-analyse måler typisk bakteriers levedygtighed eller væksthæmning ved hjælp af metoder som udpladning, kolonitælling eller måling af optisk densitet. Sonikering er et afgørende trin i biofilmbaserede MIC-analyser ved vurdering af biofilmassocierede mikroorganismers følsomhed over for antimikrobielle midler. Dens primære funktion er at løsne og dispergere celler, der er indlejret i biofilmmatrixen, i en ensartet suspension til nøjagtig analyse.
Biofilm er betydeligt mere resistente over for antimikrobielle midler end planktoniske celler, hvilket gør korrekt løsning afgørende for en nøjagtig analyse. Under denne proces genererer ultralydsbølger kontrolleret kavitation, som nedbryder biofilmmatrixen og frigør indlejrede celler i en ensartet suspension i genvindingsmediet. Dette trin muliggør præcise vurderinger af levedygtigheden af celler dispergeret fra biofilm ved hjælp af metoder som udpladning, fortynding og kolonitælling. Korrekt nedbrydning af biofilm ved sonikering forhindrer resterende matrixkomponenter i at beskytte cellerne, hvilket ellers kunne føre til en undervurdering af den antimikrobielle aktivitet. Sonikatoren til multibrøndplader UIP400MTP er særligt velegnet til dette formål og tilbyder præcise og reproducerbare sonikeringsbetingelser, som sikrer pålidelig klargøring af analyseplader med højt prøvegennemløb.

Hvorfor sonikering er nødvendig i biofilmbaserede analyser af minimal hæmmende koncentration

Måling af levedygtighed og celletælling kræver fuldstændig og pålidelig løsning og dispersion af enkeltceller. UIP400MTP fremmer ensartet løsning af biofilm og dispersion af celler uden at beskadige dem og giver dermed robuste analyseresultater.

• Biofilmens kompleksitet: Biofilm er strukturerede mikrobielle samfund, som er omsluttet af en matrix af ekstracellulære polymere stoffer (EPS), der beskytter mikroorganismerne og gør dem mere resistente over for antimikrobielle midler.
• Ensartet dispersion: For nøjagtigt at måle levedygtigheden af celler indlejret i biofilm eller deres følsomhed over for antimikrobielle midler skal biofilmen først løsnes og nedbrydes til en homogen suspension.

Protokol for biofilmbaseret analyse af minimal hæmmende koncentration

Analysen af minimal hæmmende koncentration (MIC) bestemmer den laveste koncentration af et antimikrobielt middel, som er nødvendig for at hæmme mikroorganismers synlige vækst. Denne protokol er udviklet til biofilmassocierede mikroorganismer og anvender sonikatoren til multibrøndplader UIP400MTP til nedbrydning af biofilm.

Trin 1: Klargøring af bakterielt inokulum

1. Klargør bakteriesuspensionen:
   Dyrk bakterier i egnede medier til midten af den logaritmiske vækstfase.
   Fortynd kulturen for at opnå en standardiseret celletæthed (f.eks. 0,5 McFarland-standard eller OD600 ~0,1).
2. Klargør antimikrobielle opløsninger:
   Fortynd det antimikrobielle middel i et egnet medium for at fremstille en række koncentrationer (f.eks. serielle tofoldsfortyndinger).
3. Fordel i 96-brøndspladen:
   Tilsæt de antimikrobielle opløsninger til brøndene i en standardplade med 96 brønde med et slutvolumen i hver brønd på ~150–200 µL.
   Medtag vækstkontroller (uden antimikrobielt middel) og sterilitetskontroller (uden bakterielt inokulum).

Trin 2: Biofilmdannelse på låg med stifter

• Sæt låget med stifter på:
  Anbring det særlige låg med stifter over de inokulerede brønde, og sørg for, at stifterne er helt nedsænket i bakteriesuspensionen.
• Inkubér pladen:
  Inkubér ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i et angivet tidsrum (f.eks. 24 timer) under statiske betingelser for at muliggøre biofilmdannelse på stifterne.

Trin 3: Eksponering for antimikrobielle midler

• Skyl stifterne:
  Fjern låget med stifter fra bakteriesuspensionen, og skyl forsigtigt i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne løst fastsiddende planktoniske celler.
• Eksponér for antimikrobielle midler:
  Overfør låget med stifter til en ny 96-brøndsplade, som indeholder de tidligere fremstillede fortyndinger af det antimikrobielle middel.
  Inkubér i et defineret tidsrum (f.eks. 24 timer) under statiske betingelser, så det antimikrobielle middel kan virke på biofilmene.

Trin 4: Sonikering med sonikatoren til mikroplader UIP400MTP

Sonikeringstrinnet er afgørende for at løsne biofilm fra lågene med stifter, så levedygtigheden kan vurderes. Følg disse trin for sonikatoren UIP400MTP:

1. Klargør opstillingen:
   Fyld hver brønd i en ny 96-brøndsplade med genvindingsmedium (f.eks. neutraliserende bouillon eller sterilt vækstmedium).
2. Overfør låget med stifter:
   Fjern låget med stifter fra pladen til antimikrobiel behandling.
   Skyl låget med stifter i sterilt saltvand eller PBS for at fjerne rester af antimikrobielle midler.
3. Placér pladen i sonikatoren:
   Sæt låget med stifter på pladen med genvindingsmedium.
   Anbring pladen med genvindingsmedium i sonikatoren UIP400MTP, og sørg for, at pladen står centreret og stabilt som beskrevet i manualen.
4. Justér sonikeringsparametrene:
   Indstil sonikeringsparametrene på UIP400MTP (indstillingerne kan tilpasses biofilmen):
   Amplitude: 70–100%.
   Sonikeringstid: 1–3 minutter (tilpas efter biofilmens struktur) i cyklisk tilstand.
5. Sonikér:
   Start sonikeringsprocessen. Ultralydsbølgerne vil nedbryde biofilmmatrixen og løsne cellerne, så de frigøres til genvindingsmediet.
6. Overvåg processen:
   Brug den tilslutbare temperatursensor til at overvåge prøvetemperaturen i brøndene. UIP400MTP kan tilsluttes en laboratoriekøler til køling.
7. Håndtering efter sonikering:
   Overfør straks genvindingsmediet, som indeholder de løsnede biofilm, til en ny steril plade til efterfølgende analyse.

(A) Plade med TSB tilsat 2% glukose anvendt til biofilmdannelse, genvinding af celler og bestemmelse af MIC og MBEC; (B) Låg med stifter til dannelse af stafylokokbiofilm.
Biofilmcellerne, som var dannet på stifterne, blev løsnet ved sonikering (Hielscher Ultrasound Technology) i 5 min i 96-brøndsplader med frisk dyrkningsmedium til genvinding af cellerne.
(Billede og studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Trin 4: Vurdering af levedygtighed

Udplad og dyrk de løsnede biofilm:

1. Udfør serielle fortyndinger af genvindingsmediet, og udplad på agar for at tælle kolonidannende enheder (CFU).
2. Vurdér MIC:
   Bestem MIC som den laveste koncentration af det antimikrobielle middel, der fuldstændigt hæmmer synlig mikrobiel vækst i genvindingsmediet.

MIC minimal hæmmende koncentration: Eksempel på en mikrotiterplade og fortolkning af mikrofortyndingsresultater.
(Studie og billede: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Hvem har gavn af sonikering under MIC-analyser?

• Producenter af medicinsk udstyr: Til at teste overfladebelægningers effektivitet og validere rengøringsprotokoller for udstyr, der er udsat for biofilmdannelse.
• Kliniske mikrobiologer: Til nøjagtigt at diagnosticere implantatassocierede infektioner (såsom PJI) ved at genvinde bakterier fra medicinsk udstyr.
• Lægemiddeludviklere: Til at vurdere nye antimikrobielle midlers effektivitet mod modstandsdygtige patogener indlejret i biofilm.
• Akademiske forskere: Til at gennemføre reproducerbare studier med højt prøvegennemløb af biofilmbiologi og mekanismer for antimikrobiel resistens.
• Industrielle kvalitetskontrolteams: Til at vurdere biologisk tilgroning og desinfektionsmidlers effektivitet i industrielle miljøer (f.eks. ved hjælp af ASTM E2799-22-standarder).

Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland

Hielschers ultralydsapparater er kendt for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening gør det muligt at integrere vores ultralydsapparater problemfrit i industrianlæg. Hielschers sonikatorer håndterer nemt barske forhold og krævende miljøer.

Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater er naturligvis CE-kompatible og opfylder kravene fra UL, CSA og RoHs.

Læs her, hvordan UIP400MTP bruges til løsning af biofilm i ASTM E2799-protokollen – test af desinfektionsmidlers effektivitet mod Pseudomonas aeruginosa-biofilm ved hjælp af MBEC-analysen.