Afparaffinering og proteinekstraktion fra FFPE

Gør proteinekstraktion fra formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) vævssnit lettere ved hjælp af en optimeret kombination af afparaffinering, solubilisering og sonikering med et VialTweeter ultralydsapparat til flere rør. Denne protokol understøtter efterfølgende massespektrometribaseret proteomik og er kompatibel med arbejdsgange til SP3-oprensning og enzymatisk nedbrydning.

Denne standardprocedure (SOP) er beregnet til laboratoriepersonale, der arbejder med proteomisk analyse af FFPE-vævsprøver ved hjælp af højtydende sonikering. Den er optimeret til op til ti FFPE-prøver, der behandles parallelt med VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokol: Proteinekstraktion fra FFPE-prøver med VialTweeter

Materialer og reagenser

Reagenser

• Xylen (histologisk kvalitet)
• Ethanol (absolut 96%)
• Lysebuffer:

6 M guanidinhydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
40 mM CAA (2-chloracetamid)

• Proteasehæmmer (valgfri; f.eks. cOmplete™ mini EDTA-free)

Udstyr

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1,5 mL eller 2,0 mL mikrocentrifugerør med lav bindingskapacitet
• Varmeblok eller inkubator (indstillinger på 95°C og 80°C)
• Mikrocentrifuge
• Termomixer (valgfri, men anbefalet)

Prøvemængde

• 1–2 snit af 10 µm tykt FFPE-væv pr. prøve (dvs. pr. hætteglas)

ELLER

• I alt ~100 µg væv pr. prøve (dvs. pr. hætteglas)

Bemærk: Brug nye blade til mikrotomi for at minimere kontaminering med paraffinrester.

Fremgangsmåde

1. Afparaffinering
   1. Overfør FFPE-snittene til mikrocentrifugerør med lav bindingskapacitet.
   2. Tilsæt 1 mL xylen, og vortex kortvarigt.
   3. Inkubér i 10 minutter ved stuetemperatur.
   4. Centrifugér ved 14.000 × g i 2 minutter; kassér supernatanten.
   5. Gentag xylenvasken én gang mere (trin 2–4).
   6. Vask pelleten med 1 mL 96% ethanol, vortex, og centrifugér derefter ved 14.000 × g i 2 minutter. Kassér supernatanten.
   7. Gentag ethanolvasken én gang mere (i alt 2 ethanolvask).
   8. Lufttør pelleten i 10 minutter ved stuetemperatur med åbne låg for at fordampe den resterende ethanol.
2. Proteinekstraktion og sonikering
   1. Tilsæt 200 µL lysebuffer til hver tør pellet.

      Bemærk: Selvom sonikatoren kan rumme op til 1 mL, er 200 µL optimalt til den efterfølgende behandling.

   2. Bland ved vortexbehandling eller forsigtig pipettering.
3. Første termiske inkubation
   1. Inkubér rørene ved 95 °C i 30 min under omrystning ved 400 rpm med en termomixer eller varmeblok.
   2. Lad prøverne køle af ved stuetemperatur i 5 min.
4. Første sonikering med VialTweeter
   1. Placér rørene i VialTweeter.
   2. Indstil VialTweeter UP200St til nedenstående værdier, og sonikér.
Sonikatorindstillinger
• Indstil amplituden (A) til 100%
• Indstil pulseringstilstanden (C) til 100%
• Periodetimer: Til
• Aktiv tid: 60s
• Pausetid: 30s
• Grænseværdi: 15 min (svarer til 10 cyklusser)
(Beregningsbemærkning: (60 s aktiv + 30 s pause) × 10 cyklusser = 900 s = 15 min)
5. Anden termiske inkubation
   Tag rørene ud, og inkubér igen ved 95 °C i 15 min, 400 rpm.
6. Anden sonikering
   Gentag sonikeringen med VialTweeter med de samme indstillinger (som ovenfor) i yderligere 10 cyklusser (15 min i alt).
7. Klaring af lysatet
   1. Centrifugér prøverne ved 13.000 × g i 10 min ved 23°C (stuetemperatur).
   2. Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt 2,0 mL Safe-lock Eppendorf-rør. Undgå at forstyrre pelleten.
8. Efterfølgende behandling
   Lysatet er nu klar til SP3-oprensning og enzymatisk nedbrydning.

Bemærkninger og anbefalet praksis

1. Risikoen for overophedning under sonikering reduceres ved programmerede TIL/FRA-cyklusser.
2. Undgå vortexbehandling efter sonikering for at forhindre proteinaggregering.

Affaldsbortskaffelse og sikkerhed

Tabellen nedenfor giver en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydsapparater i laboratoriestørrelse: