Hielscher Ultrasonics
Vi vil med glæde diskutere din proces.
Ring til os: +49 3328 437-420
Send os en mail: [email protected]

Deparaffinering og proteinekstraktion fra FFPE

Lette proteinekstraktion fra formalin-fikseret paraffin-indlejret (FFPE) vævssektioner ved hjælp af en optimeret kombination af deparaffinering, solubilisering og sonikering med en VialTweeter multi-tube ultralydsapparat. Denne protokol understøtter downstream massespektrometri-baseret proteomics og er kompatibel med SP3-oprydning og enzymatiske fordøjelsesarbejdsgange.

Denne SOP er beregnet til laboratoriepersonale, der er involveret i proteomisk analyse af FFPE-vævsprøver ved hjælp af højtydende sonikering. Det er optimeret til op til ti FFPE-prøver behandlet parallelt ved hjælp af VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Anmodning om oplysninger



VialTweeter på ultralydsprocessoren UP200ST

VialTweeter soniker til samtidig sonikering af 10 prøver, f.eks. til lysis og proteinekstraktion fra FFPE-prøver

Protokol: Proteinekstraktion fra FFPE-prøver ved hjælp af VialTweeter

Materialer og reagenser

Reagenser

  • Xylen (histologi kvalitet)
  • Ethanol (absolut 96%)
  • Lysis buffer:

    • 6 M Guanidinhydrochlorid
    50 mM Tris-HCl, pH 8,5
    10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
    40 mM CAA (2-chloracetamid)

  • Proteasehæmmer (valgfrit; f.eks. cOmplete™ mini EDTA-fri)

 
 

Udstyr

  • VialTweeter Multi-Tube Ultralydsapparat
  • 1,5 ml eller 2,0 ml lavbindende mikrocentrifugerør
  • Varmeblok eller inkubator (95 °C og 80 °C indstillinger)
  • Mikrocentrifuge
  • Termomixer (valgfrit, men anbefales)

Eksempel på input

  • 1-2 sektioner af 10 μm tykt FFPE-væv pr. prøve (dvs. pr. hætteglas)

    • eller

  • I alt ~100 μg væv pr. prøve (dvs. pr. hætteglas)

Bemærk: Brug friske knive til mikrotomi for at minimere forurening af paraffinrester.

Procedure

  1. deparaffinering
    1. Overfør FFPE-sektioner til lavbindende mikrocentrifugerør.
    2. Tilsæt 1 ml xylen, hvirvel kortvarigt.
    3. Inkuber 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Centrifuger ved 14.000 × g i 2 minutter; Kassér supernatant.
    5. Gentag xylenvask en gang til (trin 2-4).
    6. Vask pillen med 1 ml 96% ethanol, hvirvel, centrifuger derefter ved 14,000 × g i 2 minutter. Kassér supernatant.
    7. Gentag ethanolvask en gang til (i alt 2 ethanolvaske).
    8. Lufttør pillen i 10 minutter ved stuetemperatur med åbne låg for at fordampe resterende ethanol.
  2. Proteinekstraktion og sonikering
    1. Tilsæt 200 μL lysisbuffer til hver tør pellet.
      Bemærk: Selvom sonikeren kan rumme op til 1 ml, er 200 μL optimal til downstream-behandling.

    2. Bland ved hvirvel eller skånsom pipettering.
  3. Første termiske inkubation
    1. Inkuber rørene ved 95 °C i 30 min., med omrøring ved 400 omdr./min. ved hjælp af en termomixer eller varmeblok.
    2. Lad prøverne køle af ved stuetemperatur i 5 min.
  4. Første sonikering med VialTweeter
    1. Placer rørene i VialTweeter.
    2. Indstil VialTweeter UP200St til nedenstående værdier og soniker.
    5. Sonicator indstillinger
    • Indstil amplituden (A) til 100 %
    • Indstil pulseringstilstanden (C) til 100 %
    • Periodeur: Tændt
    • Til tiden: 60'erne
    • Slukket tid: 30s
    • Grænseværdi: 15 min (svarer til 10 cyklusser)
    (Beregningsbemærkning: (60 s tændt + 30 s slukket) × 10 cyklusser = 900 s = 15 min)
  5. Anden termisk inkubation
    Fjern rørene og inkuber igen ved 95 °C i 15 min, 400 omdr./min.
  6. Anden sonikering
    Gentag sonikering på VialTweeter ved hjælp af de samme indstillinger (som ovenfor) i yderligere 10 cyklusser (15 minutter i alt).
  7. Klaring af lysat
    1. Centrifuger prøverne ved 13.000 × g i 10 minutter ved 23 °C (stuetemperatur).
    2. Saml forsigtigt supernatanten i et nyt 2,0 ml Safe-lock Eppendorf-rør. Undgå at forstyrre pillen.
  8. Downstream-behandling
    Lysatet er nu klar til SP3-oprydning og enzymatisk fordøjelse.

 

VialTweeter er et unikt ultralydssystem til samtidig sonikering af op til 10 hætteglas under nøjagtig de samme forhold uden krydskontaminering.

UP200St med VialTweeter til sonikering af lukkede hætteglas

Video Miniature

 

VialTweeter med 2,0 ml Eppendorf-rør til pålidelig prøveforberedelse under sterile forhold

Hielscher VialTweeter med 10 Eppendorf-rør

Anmodning om oplysninger



Noter og bedste praksis

  1. Risiko for overophedning under sonikering mindskes ved programmeret ON / OFF-cykling.
  2. Undgå hvirvler efter sonikering for at forhindre proteinaggregering.

Bortskaffelse af affald og sikkerhed

  • Xylen og guanidinhydrochlorid er farlige kemikalier; håndtag under et stinkskab.
  • Bortskaf alt opløsningsmiddel og biologisk affald i henhold til institutionens biosikkerheds- og kemikaliehygiejneprotokoller.

    •  
     

    Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater i laboratoriestørrelse:

    Anbefalede enheder Batch volumen Flowhastighed
    UIP400MTP 96-brønds plade soniker Multi-brønd / mikrotiterplader n.a.
    Ultralyd CupHorn CupHorn til hætteglas eller bægerglas n.a.
    GDmini2 ultralyd mikro-flow reaktor n.a.
    VialTweeter 0.5 til 1,5 ml n.a.
    UP100H 1 til 500 ml 10 til 200 ml/min
    UP200Ht, UP200St 10 til 1000 ml 20 til 200 ml/min
    UP400St 10 til 2000 ml 20 til 400 ml/min
    Ultralyd sigte ryster n.a. n.a.

    Bed om mere information

    Brug formularen nedenfor til at anmode om yderligere oplysninger om ultralydsprocessorer, applikationer og pris. Vi vil med glæde diskutere din proces med dig og tilbyde dig et ultralydssystem, der opfylder dine krav!




    Ultralydshomogenisatorer med høj forskydning anvendes i laboratorie-, bord-top-, pilot- og industriel behandling.

    Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer til blandingsapplikationer, dispersion, emulgering og ekstraktion i laboratorie-, pilot- og industriel skala.

    Relaterede emner

    Litteratur / Referencer

    Ofte stillede spørgsmål

    Hvorfor er vævsprøver fikseret som FFPE?

    Formalinfikseret paraffin-indlejret (FFPE) konservering stabiliserer vævsmorfologi og proteinstrukturer ved at danne kovalente tværbindinger via formaldehyd. Indlejring i paraffin muliggør langtidsopbevaring ved stuetemperatur, samtidig med at histologisk og molekylær integritet opretholdes til retrospektive analyser.

    Hvordan afparaffinerer jeg FFPE-prøver?

    Deparaffinering involverer sekventielle opløsningsmiddelvaske for at fjerne paraffin: typisk to inkubationer med xylen, efterfulgt af to vaske med ethanol (96%). Efter centrifugering og tørring er vævet klar til nedstrøms ekstraktion. Denne proces genopretter prøvetilgængeligheden til lysis og enzymatisk fordøjelse.

    Hvad er formålet med termisk inkubation?

    Termisk inkubation refererer til kontrolleret eksponering af en prøve for en defineret temperatur i en bestemt periode for at inducere biokemiske eller fysiske ændringer. I proteomics bruges det almindeligvis til at denaturere proteiner, vende formaldehyd-tværbindinger i FFPE-væv eller forbedre lysisbufferens effektivitet. Temperaturen og varigheden er kritiske parametre, der er skræddersyet til målreaktionen eller prøvetypen.

    Hvad er SP3 Digestion?

    Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) er en perlebaseret proteomics-arbejdsgang. Den bruger paramagnetiske perler til at binde proteiner, hvilket muliggør effektiv oprydning, koncentration og enzymatisk fordøjelse på perlen under denatureringsforhold. SP3 minimerer prøvetab og er yderst kompatibel med lav-input og FFPE-prøver.

    Højtydende ultralyd! Hielscher-produktsortimentet dækker hele spektret fra den kompakte laboratorieultralydsapparat over bordenheder til fuldindustrielle ultralydssystemer.

    Hielscher Ultrasonics fremstiller højtydende ultralydshomogenisatorer fra Lab til industriel størrelse.

    Vi vil med glæde diskutere din proces.

    ✕