FFPE-prøveforberedelse med høj prøvekapacitet: Proteinekstraktion og fragmentering af nukleinsyrer ved forskydning
Med ultralydsapparatet UIP400MTP med høj prøvekapacitet løser Hielscher Ultrasonics udfordringerne ved forberedelse af formalinfikseret og paraffinindstøbt (FFPE) væv. Lær, hvordan ultralydsbehandling behandler et stort antal FFPE-prøver til afparaffinering, vævslyse, homogenisering, proteinekstraktion og fragmentering af DNA/RNA ved forskydning! Udnyt fordelene ved ultralydsbaseret forberedelse af FFPE-væv – behandling af et stort antal prøver i multibrøndplader! Opnå prøver af høj kvalitet og et stort antal prøver til pålidelige forskningsresultater! Og sidst, men ikke mindst: Spar tid og penge!
FFPE-prøveforberedelse gjort lettere med sonikering med høj prøvekapacitet
Formalinfiksering og paraffinindstøbning (FFPE) er den mest almindelige metode til konservering og arkivering af fast væv. Ekstraktion af biomolekyler fra FFPE-vævsprøver medfører ofte betydelige udfordringer på grund af kvaliteten af de opbevarede prøver. Disse prøver, som er uvurderlige ressourcer inden for molekylærbiologi og klinisk forskning, udgør en rig kilde til biologisk information til retrospektive studier og validering af diagnostiske biomarkører. Selvom formalinfiksering og paraffinindstøbning bevarer vævets arkitektur og morfologi, vanskeliggør processen imidlertid ekstraktion af nukleinsyrer og proteiner af høj kvalitet. Formalin fremkalder krydsbinding af nukleinsyrer og proteiner, hvilket fører til molekylær fragmentering og kemiske modifikationer. Lær, hvordan ultralydsapparatet UIP400MTP med høj prøvekapacitet overvinder udfordringerne ved FFPE-prøveforberedelse!
Ultralydsapparat til effektiv FFPE-prøveforberedelse
- Brugervenlig arbejdsgang: Forenklede processer, der er nemme at anvende.
- Afparaffinering, proteinekstraktion, fragmentering af DNA / RNA ved forskydning
- Hurtig behandling med høj prøvekapacitet: Effektiv håndtering af multibrøndplader.
- Effektiv afparaffinering: Forbedret solubilisering af proteiner.
- Ikke-toksiske opløsningsmidler: Undgår brugen af skadelige organiske opløsningsmidler såsom xylen.
Ultralydsapparat UIP400MTP med høj prøvekapacitet til behandling af FFPE-prøver med høj prøvekapacitet i multibrøndplader
Fremskridt inden for teknikker til proteinekstraktion fra FFPE-væv
Hielscher Ultrasonics løser udfordringerne ved FFPE-prøveforberedelse med høj prøvekapacitet. Sonikering anvender ultralydsbølger til at skabe mekaniske vibrationer og fokuseret kavitation, som effektivt nedbryder cellulære strukturer og forbedrer solubiliseringen af biomolekyler. Denne teknik er blevet populær på grund af sin evne til at øge effektiviteten og udbyttet ved ekstraktion af nukleinsyrer og proteiner fra FFPE-væv samt ved fragmentering af DNA og RNA ved forskydning til biblioteksforberedelse. Det er meget vigtigt at fremhæve, at ultralydsbehandling med ultralydsapparatet UIP400MTP til multibrøndplader bevarer disse biomolekylers integritet til efterfølgende anvendelser.
Fragmentering af nukleinsyrer ved forskydning med ultralydsbehandling med høj prøvekapacitet
Ultralydsapparatet UIP400MTP til multibrøndplader, som anvendes i sammenhænge med høj prøvekapacitet, løfter forberedelsen af FFPE-prøver til et nyt niveau. Denne metode til sonikering i multibrøndplader giver en effektiv og pålidelig løsning til samtidig behandling af flere prøver. Den muliggør hurtig og reproducerbar ekstraktion af DNA, RNA og proteiner, som er afgørende for forskellige analyseteknikker, herunder næste generations sekventering (NGS), kvantitativ PCR og proteomiske analyser. Optimering af sonikeringsparametre såsom amplitude, varighed og temperatur forbedrer yderligere kvaliteten og mængden af de ekstraherede biomolekyler.
Ultralydsapparatet UIP400MTP til multibrøndplader giver betydelige fordele ved fragmentering og fragmentering ved forskydning af DNA og RNA fra FFPE-væv. En af systemets fremtrædende egenskaber er dets evne til at opnå et snævert interval af fragmentstørrelser for DNA og RNA med præcis justering af sonikeringsintensiteten for at opnå korte fragmenter på 150–200 basepar (bp) eller længere fragmenter på 15–20 kilobasepar (kbp). Denne alsidighed gør UIP400MTP uundværlig til sekventering med både korte og lange læsninger og sikrer resultater af høj kvalitet ved næste generations sekventering (NGS) og helgenomsekventering (WGS). Den præcise kontrol over fragmentstørrelsen er afgørende for forskere inden for alle genomikkens områder, da den gør det muligt at forberede prøver i henhold til specifikationerne.
Kontakt os for avancerede løsninger til FFPE-væv
Oplev ultralydsapparatet UIP400MTP til multibrøndplader til effektiv udvinding af biomolekyler fra FFPE-prøver, som bevarer integriteten af ekstraherede nukleinsyrer og proteiner og sikrer reproducerbare resultater. Denne teknologi integreres problemfrit med andre præparative og analytiske arbejdsgange og strømliner og forbedrer molekylære undersøgelser ved hjælp af FFPE-vævsarkiver.
Fikseringsmidler og deres virkninger
Fiksering er et afgørende trin i prøveforberedelsen, som bevarer cellulære strukturer, standser biokemiske reaktioner og forhindrer nedbrydning. Forskellige fikseringsmidler anvendes afhængigt af de specifikke forsøgsbehov. De to mest almindelige fikseringsmidler er formaldehyd og paraformaldehyd, som krydsbinder proteiner og nukleinsyrer og dermed bevarer cellers og vævs morfologi og antigenicitet. Andre fikseringsmidler såsom ethanol, methanol og glutaraldehyd anvendes til specifikke formål.
Fikseringsmidler med formaldehyd og paraformaldehyd danner methylenbroer mellem aminogrupper, hvilket resulterer i krydsbinding af proteiner. Denne proces immobiliserer effektivt cellulære komponenter og bevarer deres integritet under efterfølgende analysetrin. Virkningerne af disse fikseringsmidler kan påvirkes af faktorer såsom koncentration, pH og temperatur, og optimering af disse parametre er afgørende for at sikre optimal bevarelse af cellulære strukturer.
Fordele ved ultralydsbaseret FFPE-forberedelse
Ultralydsbehandling er en effektiv teknik til nedbrydning af fikserede celler og væv, som overgår konventionelle teknikker. Den giver flere væsentlige fordele i forhold til traditionelle lysemetoder:
- Hastighed og effektivitet: Ultralydslyse giver hurtig nedbrydning af celler og væv og reducerer behandlingstiden betydeligt sammenlignet med mekaniske eller kemiske lysemetoder. Højfrekvente lydbølger genereret af ultralydssonden skaber mekaniske forskydningskræfter, som nedbryder de fikserede cellulære strukturer. Denne hurtige og effektive nedbrydning gør det muligt for forskere at behandle store prøvevolumener på kort tid.
- Skånsom og justerbar: Ultralydslyse giver en skånsom nedbrydningsmekanisme, der minimerer beskadigelse af følsomme biomolekyler såsom proteiner, nukleinsyrer og enzymer. I modsætning til mekaniske metoder, som genererer for meget varme eller for store forskydningskræfter, anvender ultralydslyse kontrolleret kavitation til at nedbryde celler, samtidig med at de intracellulære komponenters integritet og funktionalitet bevares.
- Alsidighed: Ultralydslyse kan anvendes på prøver behandlet med forskellige fikseringsmidler, hvilket gør det muligt for forskere at arbejde med en bred vifte af fikserede prøver. Uanset om der anvendes formaldehyd, paraformaldehyd eller alternative fikseringsmidler, giver ultralydslyse konsekvent effektiv nedbrydning og sikrer optimal udvinding af cellulære komponenter.
- Højt udbytte og høj kvalitet: Ultralydslyse muliggør høje udbytter af intakte cellulære komponenter takket være sin evne til at nedbryde fikserede celler og væv ensartet. Dette gør det muligt for efterfølgende anvendelser såsom proteinanalyse, nukleinsyreekstraktion og enzymatiske assays at give pålidelige og reproducerbare resultater.
- Kompatibilitet med automatisering: Ultralydslyse kan nemt integreres i automatiserede systemer og muliggør dermed prøvebehandling med høj prøvekapacitet. Denne kompatibilitet gør det muligt for forskere at strømline deres arbejdsgang og øge produktiviteten, især i studier i stor skala.
Ultralydsapparat UIP400MTP til 96-brøndplader til sonikering af mikrotiter- og multibrøndplader
Ultralydslyse har revolutioneret nedbrydningen af fikserede celler og væv og giver talrige fordele i forhold til traditionelle lysemetoder. Dens hastighed, effektivitet, selektivitet, alsidighed, høje udbytte og kompatibilitet med automatisering gør den til et uundværligt værktøj inden for molekylærbiologisk og bioteknologisk forskning. Hielscher Ultrasonics tilbyder både kontaktfrie ultralydsapparater og ultralydsapparater med sonde og dermed den bedst egnede ultralydshomogenisator til din anvendelse inden for biovidenskab. Uanset om du ønsker at behandle enkeltprøver, flere prøver eller et meget stort antal prøver samtidig, tilbyder vi dig det bedste ultralydsapparat, der matcher dine forsknings- og diagnostikbehov.
Læs mere om Hielschers kontaktfrie ultralydsapparater til forberedelse af flere prøver og prøveforberedelse med høj prøvekapacitet!
- engangsinvestering
- brug dine egne forbrugsvarer
- ingen tilbagevendende omkostninger til proprietært tilbehør og proprietære forbrugsvarer
- høj prøvekapacitet
- præcis styring
- den nyeste teknologi
- pålidelighed & robusthed
- justerbar, præcis processtyring
- industrikvalitet: kan være i kontinuerlig drift 24/7
- nem og sikker at betjene
- lavt vedligeholdelsesbehov
Læs mere om anvendelserne af ultralydsapparater inden for biovidenskab!
Pladeultralydsapparat UIP400MTP til alle 96-brøndplader, mikrotiterplader og multibrøndplader.
Design, fremstilling og rådgivning – kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielschers ultralydsapparater er velkendte for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores ultralydsapparater i industrianlæg. Barske forhold og krævende miljøer håndteres nemt af Hielschers ultralydsapparater.
Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater opfylder naturligvis CE-kravene og kravene fra UL, CSA og RoHs.
Kontakt os! / Spørg os!
Ultralydsapparat UIP400MTP: FFPE-prøveforberedelse med høj prøvekapacitet i multibrøndplader
Ofte stillede spørgsmål
Nedenfor besvarer vi ofte stillede spørgsmål, som er relevante for forberedelse af FFPE-væv og ultralydsbehandling af FFPE-prøver.
Hvordan forberedes FFPE-væv?
Trin i forberedelsen af FFPE-væv: Omhyggelig håndtering og behandling af friskt væv er afgørende for at fremstille FFPE-prøver af høj kvalitet. Det er nødvendigt at sikre bevarelsen af den cellulære arkitektur, nukleinsyrer og proteiner for at opnå præcise efterfølgende analyser. Hvert trin – fra indsamling til indstøbning – kræver præcision for at bevare prøvens integritet til forskellige analyser, herunder histologisk undersøgelse, immunhistokemi og molekylære studier. Når fikserings- og indstøbningsprocessen udføres korrekt, sikrer den, at det konserverede væv præcist afspejler tilstanden in vivo, hvilket muliggør pålidelige diagnostiske resultater og forskningsresultater.
Vi gennemgår de 6 hovedtrin i indstøbningsprocessen for FFPE-vævsprøver.
- Vævsindsamling
Både biopsier fra levende pattedyr og vævskulturer er egnede kilder til friskt væv til FFPE-prøveforberedelse.
Det er vigtigt at anvende aseptisk teknik: Brug sterile instrumenter og handsker for at undgå kontaminering. Ideelt set indsamles væv i et sterilt miljø, såsom en operationsstue eller en laminar flow-bænk.
Da prøven er meget skrøbelig, er skånsom håndtering afgørende: Minimer forsinkelser i behandlingen, og påbegynd den efterfølgende vævsbehandling umiddelbart efter excisionen. Dette er afgørende for at forhindre autolyse og nedbrydning. Hold vævet ved stuetemperatur; undgå nedfrysning, da det kan medføre dannelse af iskrystaller og vævsskader. - Vævsfiksering
Først behandles vævet med en fikseringsopløsning: Brug 10% neutralbufret formalin (NBF), som svarer til 4% formaldehyd i vand, bufret til neutral pH.
Nedsænk vævet helt i formalin. Sørg for et volumenforhold mellem fikseringsmiddel og væv på mindst 10:1. Fikseringstiden er typisk fra 6 til 24 timer, afhængigt af vævstype og størrelse. Det er vigtigt, at fikseringsmidlet kan trænge grundigt ind i vævet. Overfiksering kan dog føre til krydsbinding, som vanskeliggør antigengenfinding, mens underfiksering kan medføre dårlig vævskonservering. - Tilskæring af vævet
For det andet tilskæres vævet til en tykkelse på cirka 3–5 mm for at sikre tilstrækkelig indtrængning af fikseringsmidlet. Sørg for korrekt orientering af vævet for at få relevante histologiske strukturer med. Dette letter ekstraktionsprocessen, når vævet senere anvendes til analyse. - Behandling af den fikserede prøve
Nu skal det fikserede væv dehydreres: Efter fiksering skal vævet dehydreres for at sikre, at paraffinvoksen trænger grundigt ind. Før vævet gennem en gradueret ethanolserie (70%, 80%, 90% og 100%) for at fjerne vand.
Klaring med xylen: Paraffinvoks er uopløselig i vand, men opløselig i xylen. Derfor skal vandet i vævet erstattes med xylen. Xylen er imidlertid selv uopløseligt i vand, men opløseligt i alkohol, hvilket nødvendiggør et mellemtrin, hvor vandet først erstattes med alkohol. Nedsænk vævet i xylen eller en xylenerstatning for at fjerne ethanol og forberede vævet til paraffininfiltration.
Infiltration med paraffin: Indstøb vævet i smeltet paraffinvoks, og sørg for fuldstændig infiltration. Dette trin omfatter typisk flere skift af paraffin for at sikre grundig imprægnering. - Indstøbning af vævet
I dette trin formes vævet til en vævsblok: Placer vævet i en form med den ønskede orientering, og hæld smeltet paraffin over det. Lad paraffinen størkne ved afkøling ved stuetemperatur eller på en kold plade. - Snitning og montering
Mikrotomi: Brug en mikrotom til at skære tynde snit (typisk 4–5 mikrometer) af det indstøbte væv fra paraffinblokken. Derefter monteres prøven ved at placere snittene på objektglas til efterfølgende farvning og mikroskopisk analyse.
Kontroller til sidst histologiens kvalitet: Vurder de første snit under et mikroskop for at sikre korrekt fiksering og behandling. Tilpas protokollerne efter behov på baggrund af vævstype og observeret kvalitet.
FFPE-væv kan anvendes til at udvinde RNA, DNA og proteiner samt til at opdage tegn på kræft eller anden sygdom. Det kan opbevares i årevis og er en væsentlig del af forskeres og lægers anvendelse af vævsprøver til diagnostik og forskning.
Hvad er almindelige problemer og udfordringer med FFPE-væv?
Formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) vævsprøver anvendes i vid udstrækning inden for forskning og diagnostik, men de medfører flere udfordringer og almindelige problemer:
- Nedbrydning af biomolekyler: Langvarig fiksering kan føre til nedbrydning af DNA, RNA og proteiner, hvilket gør det vanskeligt at ekstrahere nukleinsyrer eller proteiner af høj kvalitet til efterfølgende anvendelser. Korrekt fiksering (hvor under- og overfiksering undgås) er afgørende for vævskonservering.
- Antigenmaskering: Fikseringsprocessen kan maskere antigene steder og dermed reducere effektiviteten af antistofbinding ved immunhistokemi og andre immunologiske assays. Dette kræver ofte antigengenfinding, en procedure, hvor maskeringen af en epitop ophæves, og bindingen mellem epitop og antistof genoprettes. Fuld antigenicitet kan dog muligvis ikke altid genoprettes.
- Varierende fikseringskvalitet: Forskelle i fikseringstider og -betingelser kan føre til uensartet prøvekvalitet og påvirke resultaternes reproducerbarhed og sammenlignelighed. Brug pålidelige fikseringsprotokoller, og undgå under- og overfiksering.
- DNA-skader og fragmentering: Formalinfiksering af FFPE-prøver kan forårsage forskellige typer DNA-skader, herunder deaminering af cytosin (C til T-mutationer), oxidative skader (f.eks. 8-oxo-guanin, der fører til G til T-mutationer) samt fysiske skader såsom enkeltstrengsbrud, huller og abasiske steder, der hæmmer DNA-polymeraseaktiviteten. Formalinfikseringsprocessen kan medføre fragmentering af DNA, hvilket vanskeliggør genetiske og genomiske analyser såsom PCR og sekventering.
- RNA-kvalitet: RNA ekstraheret fra FFPE-væv er ofte fragmenteret og kemisk modificeret, hvilket gør det udfordrende at udføre transkriptomiske analyser af høj kvalitet.
- Proteinmodifikationer: Formalin kan fremkalde kemiske modifikationer i proteiner, som påvirker deres struktur og funktion og kan forstyrre proteomiske analyser.
- Artefakter fra prøvebehandling: Under indstøbnings- og snitningsprocessen kan mekanisk belastning og varme medføre artefakter og yderligere beskadigelse af vævet.
- Variation mellem batcher: Variationer i fikserings- og indstøbningsprotokoller mellem forskellige batcher kan føre til betydelig variation i resultaterne, hvilket vanskeliggør sammenligninger mellem studier.
- Opbevaringsproblemer: Langvarig opbevaring af FFPE-blokke kan medføre yderligere nedbrydning og tab af nukleinsyrernes integritet over tid, hvilket påvirker arkivprøvers anvendelighed til retrospektive studier.
Krydsbinding: Formalinfiksering medfører krydsbinding af proteiner og nukleinsyrer, hvilket kan hæmme molekylær analyse og påvirke nøjagtigheden af immunhistokemi og andre assays.
Brug af optimerede protokoller, omhyggelig prøvehåndtering og anvendelse af avancerede teknikker bidrager til at forbedre kvaliteten og pålideligheden af data fra FFPE-væv.
Hvad er forskellen mellem FFPE-væv og frosset væv?
FFPE-væv (formalinfikseret, paraffinindstøbt væv) konserveres ved fiksering med formalin og indstøbes derefter i paraffinvoks, hvilket muliggør langvarig opbevaring ved stuetemperatur, samtidig med at vævets morfologi bevares. Frosset væv konserveres derimod hurtigt ved nedfrysning, hvilket bedre bevarer nukleinsyrers og proteiners integritet, men kræver opbevaring ved meget lave temperaturer.
Hvilke kemikalier anvendes til FFPE-indstøbning?
De kemikalier, der anvendes til FFPE-indstøbning, omfatter normalt formalin til fiksering og paraffinvoks til indstøbning. Ved FFPE-indstøbning fikseres væv typisk med enten 10% (v/v) neutralbufret formalin (FA) eller en friskfremstillet 4% (w/v) formaldehydopløsning (PFA), som er fremstillet af paraformaldehydpulver. Formalin, som er en opløsning af formaldehyd i vand, bufres til neutral pH for at bevare vævets morfologi og forhindre overdreven krydsbinding. Den paraformaldehydbaserede opløsning giver også effektiv fiksering ved at krydsbinde proteiner og dermed stabilisere vævsstrukturen til efterfølgende indstøbning i paraffinvoks. Disse kemikalier er afgørende for at bevare vævets integritet og morfologi under fikserings- og indstøbningsprocessen.
Hvordan fjernes paraffinen fra FFPE-prøver?
For at fjerne paraffin fra FFPE-prøver gennemgår vævssnittene typisk en række vasketrin med xylen efterfulgt af rehydrering gennem en gradueret alkoholserie og til sidst vand. Da xylen er meget toksisk og medfører sundhedsrisici såsom luftvejsproblemer, hudirritation og potentielle langtidsvirkninger ved gentagen eksponering, vinder ultralydsbaseret paraffinfjernelse frem som et lovende alternativ i mange laboratorier. Denne metode anvender intense ultralydsbølger til effektivt og sikkert at fjerne paraffin uden behov for toksiske opløsningsmidler såsom xylen og reducerer dermed risikoen for laboratoriepersonalet og skaber et sikrere arbejdsmiljø.
Hvor længe bør jeg fiksere mit væv for at opnå god FFPE-prøvekvalitet?
Generelle anbefalinger for fikseringsvarighed foreslår typisk fiksering af vævsprøver i formalin i 24 til 48 timer. Denne varighed er generelt tilstrækkelig til at bevare vævets morfologi og cellulære strukturer, samtidig med at overfiksering minimeres, da den kan føre til overdreven krydsbinding og nedbrydning af nukleinsyrer og proteiner. Den optimale fikseringstid kan dog variere afhængigt af vævets størrelse og type, og mindre eller mere sarte prøver kræver kortere fikseringstider. Det er afgørende at finde en balance, hvor tilstrækkelig fiksering forhindrer autolyse og nedbrydning af vævet, samtidig med at langvarig fiksering, som kan vanskeliggøre efterfølgende molekylære analyser, undgås.