FFPE prøveforberedelse med høj kapacitet: Proteinekstraktion og nukleinsyreklipning
Med ultralydsapparaten UIP400MTP med høj kapacitet løser Hielscher Ultrasonics udfordringerne ved formalinfiksering og paraffinindlejret (FFPE) vævsforberedelse. Lær, hvordan ultralydbehandling behandler FFPE-prøve i stort antal til FFPE-deparaffinering, vævslyse, homogenisering, proteinekstraktion og DNA / RNA-klipning! Udnyt ultralyds FFPE-vævsforberedelse – Behandling af store prøveantal i multibrøndplader! Få prøver af høj kvalitet og få høje prøveantal på pålidelige forskningsresultater! Og sidst, men ikke mindst, spar tid og penge!
FFPE-prøveforberedelse lettet ved sonikering med høj kapacitet
Formalinfiksering og paraffinindlejring (FFPE) er den mest almindelige metode til konservering og arkivering af fast væv. Udvinding af biomolekyler fra FFPE-vævsprøver giver ofte betydelige udfordringer på grund af kvaliteten af de lagrede prøver. Disse prøver, som er uvurderlige aktiver inden for molekylærbiologi og klinisk forskning, giver en rig kilde til biologisk information til retrospektive undersøgelser og diagnostisk biomarkørvalidering. Processen med formalinfiksering og paraffinindlejring, samtidig med at vævsarkitektur og morfologi bevares, komplicerer imidlertid ekstraktionen af nukleinsyrer og proteiner af høj kvalitet. Formalin inducerer tværbinding af nukleinsyrer og proteiner, hvilket fører til molekylær fragmentering og kemiske modifikationer. Lær, hvordan ultralydsapparatet med høj kapacitet UIP400MTP overvinder udfordringerne ved FFPE-prøveforberedelse!
Ultralydsapparat til effektiv FFPE-prøveforberedelse
- Brugervenlig arbejdsgang: Forenklede processer, der er brugervenlige.
- Deparafinisering, Proteinekstraktion, DNA/RNA-klipning
- Hurtig bearbejdning med høj gennemstrømning: Effektiv håndtering af plader med flere brønde.
- Effektiv deparaffinering: Forbedret opløselighed af proteiner.
- Ikke-giftige opløsningsmidler: Undgår brugen af skadelige organiske opløsningsmidler såsom xylen.
UIP400MTP ultralydator med høj kapacitet til FFPE-prøvebehandling med høj kapacitet i multibrøndplader
Fremskridt inden for proteinekstraktionsteknikker fra FFPE-væv
Hielscher Ultrasonics adresserer udfordringerne ved FFPE-prøveforberedelse med høj kapacitet. Sonikering anvender ultralydsbølger til at generere mekaniske vibrationer og fokuseret kavitation, hvilket effektivt forstyrrer cellulære strukturer og forbedrer opløseligheden af biomolekyler. Denne teknik har vundet popularitet for sin evne til at øge effektiviteten og udbyttet af nukleinsyre- og proteinekstraktion fra FFPE-væv samt DNA- og RNA-klipning til biblioteksforberedelse. Det er meget vigtigt at fremhæve, at ultralydbehandling ved hjælp af UIP400MTP multiwell plade sonicator opretholder integriteten af disse biomolekyler til downstream-applikationer.
Nukleinsyreklipning ved hjælp af ultralydbehandling med høj gennemstrømning
Multi-well ultralydsapparaten UIP400MTP til brug i indstillinger med høj gennemstrømning bringer forberedelsen af FFPE-prøver til et nyt niveau. Denne multiwell-plate sonikeringsmetode giver en effektiv og pålidelig løsning til samtidig behandling af flere prøver. Det letter hurtig og reproducerbar ekstraktion af DNA, RNA og proteiner, som er afgørende for forskellige analytiske teknikker, herunder næste generations sekventering (NGS), kvantitativ PCR og proteomiske analyser. Optimering af sonikeringsparametre, såsom amplitude, varighed og temperatur, forbedrer yderligere kvaliteten og kvantiteten af de ekstraherede biomolekyler.
Den UIP400MTP soniker til multiwell-plader giver betydelige fordele for fragmentering og klipning af DNA og RNA fra FFPE-væv. En af de iøjnefaldende funktioner i dette system er dets evne til at opnå smalle fragmentstørrelser af DNA og RNA, hvilket giver præcis tunbarhed af sonikeringsintensitet for at opnå korte fragmenter af 150-200 basepar (bp) eller længere fragmenter af 15-20 kilobasepar (kbp). Denne alsidighed gør UIP400MTP uundværlig til både kortlæse- og long-read-sekventeringsapplikationer, hvilket sikrer resultater af høj kvalitet til næste generations sekventering (NGS) og helgenomsekventering (WGS). Dens præcise kontrol over fragmentstørrelsen er afgørende for forskere inden for alle områder af genomforskning, da den gør det muligt at forberede prøver i henhold til specifikationer.
Kontakt os for avancerede løsninger inden for FFPE-væv
Oplev den UIP400MTP multiwell plade soniker til effektiv biomolekylegenvinding fra FFPE-prøver, opretholdelse af integriteten af ekstraherede nukleinsyrer og proteiner og sikring af reproducerbarhed af resultater. Denne teknologi integreres problemfrit med andre forberedende og analytiske arbejdsgange, strømliner og forbedrer molekylære undersøgelser ved hjælp af FFPE-vævsarkiver.
Fikseringsmidler og deres virkninger
Fiksering er et afgørende trin i prøveforberedelsen, der bevarer cellulære strukturer, standser biokemiske reaktioner og forhindrer nedbrydning. Forskellige fikseringsmidler anvendes afhængigt af de specifikke eksperimentelle krav. De to mest almindelige fikseringsmidler er formaldehyd og paraformaldehyd, som tværbinder proteiner og nukleinsyrer, hvilket bevarer morfologien og antigeniciteten af celler og væv. Andre fikseringsmidler, såsom ethanol, methanol og glutaraldehyd, bruges til specifikke applikationer.
Formaldehyd- og paraformaldehydfikseringsmidler danner methylenbroer mellem aminogrupper, hvilket resulterer i proteintværbinding. Denne proces immobiliserer effektivt cellulære komponenter og bevarer deres integritet under efterfølgende analysetrin. Virkningerne af disse fikseringsmidler kan påvirkes af faktorer som koncentration, pH og temperatur, og optimering af disse parametre er afgørende for at sikre optimal bevarelse af cellulære strukturer.
Fordele ved ultralyd FFPE-forberedelse
Ultralydbehandling er en kraftfuld teknik til at forstyrre fikserede celler og væv, der udmærker konventionelle teknikker. Det giver flere bemærkelsesværdige fordele i forhold til traditionelle lyseringsmetoder:
- Hastighed og effektivitet: Ultralydslyse giver hurtig forstyrrelse af celler og væv, hvilket reducerer behandlingstiden betydeligt sammenlignet med mekaniske eller kemiske lysemetoder. Højfrekvente lydbølger genereret af ultralydssonden skaber mekaniske forskydningskræfter, hvilket forårsager forstyrrelse af de fikserede cellulære strukturer. Denne hurtige og effektive afbrydelse gør det muligt for forskere at behandle store prøvemængder inden for en kort tidsramme.
- Skånsom og justerbar: Ultralydslyse tilbyder en blid forstyrrelsesmekanisme, der minimerer skader på følsomme biomolekyler såsom proteiner, nukleinsyrer og enzymer. I modsætning til mekaniske metoder, der genererer overdreven varme eller forskydningskræfter, bruger ultralydslyse kontrolleret kavitation til at forstyrre celler, samtidig med at integriteten og funktionaliteten af de intracellulære komponenter bevares.
- Alsidighed: Ultralydslyse kan anvendes på forskellige fikseringsmidler, hvilket giver forskere mulighed for at arbejde med en bred vifte af fikserede prøver. Uanset om du bruger formaldehyd, paraformaldehyd eller alternative fikseringsmidler, leverer ultralydslyse konsekvent effektiv forstyrrelse, hvilket sikrer optimal gendannelse af cellulære komponenter.
- Højt udbytte og kvalitet: Ultralydslyse letter høje udbytter af intakte cellulære komponenter på grund af dets evne til at forstyrre fikserede celler og væv ensartet. Dette gør det muligt for downstream-applikationer såsom proteinanalyse, nukleinsyreekstraktion og enzymatiske assays at give pålidelige og reproducerbare resultater.
- Kompatibilitet med automatisering: Ultralydslysis kan nemt integreres i automatiserede systemer, hvilket giver mulighed for prøvebehandling med høj kapacitet. Denne kompatibilitet gør det muligt for forskere at strømline deres arbejdsgange og øge produktiviteten, især i store undersøgelser.
96-brønds plade soniker UIP400MTP til sonikering af mikrotiter- og multiwell-plader
Ultralydslyse har revolutioneret forstyrrelsen af fikserede celler og væv og giver adskillige fordele i forhold til traditionelle lysemetoder. Dens hastighed, effektivitet, selektivitet, alsidighed, høje udbytte og automatiseringskompatibilitet gør den til et uundværligt værktøj inden for molekylærbiologi og bioteknologisk forskning. Hielscher Ultrasonics tilbyder berøringsfri sonikere såvel som sonde-type soniker og tilbyder den bedst egnede ultralydshomogenisator til din biovidenskabelige applikation. Uanset om du ønsker at behandle enkeltprøver, flere prøver eller meget høje prøvenumre samtidigt, tilbyder vi dig den bedste soniker, der matcher dine forsknings- og diagnostiske krav.
Læs mere om Hielscher berøringsfri sonikere til forberedelse af prøver med flere prøver og høj kapacitet!
- engangsinvestering
- Brug dine egne forbrugsvarer
- Ingen tilbagevendende omkostninger til proprietært tilbehør og forbrugsvarer
- Høj kapacitet
- Præcisionskontrol
- Avanceret teknologi
- pålidelighed & Robusthed
- justerbar, præcis processtyring
- Industriel kvalitet: Kan betjenes kontinuerligt 24/7
- Nem og sikker at betjene
- lav vedligeholdelse
Pladesoniker UIP400MTP til alle 96-brønds plader, mikrotiterplader og multi-brøndplader.
Design, produktion og rådgivning – Kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Hårde forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydsapparater.
Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
Kontakt os! / Spørg os!
UIP400MTP Ultralydsapparat: Forberedelse af FFPE-prøver med høj kapacitet i Multi-Well-Plate
Ofte stillede spørgsmål
Nedenfor besvarer vi ofte stillede spørgsmål, som er relevante for FFPE-vævsforberedelse og ultralydbehandling af FFPE-prøver.
Hvordan fremstilles FFPE-væv?
Trin til forberedelse af FFPE-væv: Den omhyggelige håndtering og behandling af frisk væv er afgørende for at generere FFPE-prøver af høj kvalitet. Sikring af bevarelse af cellulær arkitektur, nukleinsyrer og proteiner er afgørende for nøjagtig downstream-analyse. Hvert trin - fra indsamling til indlejring - kræver præcision for at opretholde prøvens integritet til forskellige analyser, herunder histologisk undersøgelse, immunhistokemi og molekylære undersøgelser. Korrekt udført sikrer denne fikserings- og indlejringsproces, at det bevarede væv nøjagtigt afspejler in vivo-tilstanden, hvilket muliggør pålidelige diagnostiske og forskningsresultater.
Vi leder dig gennem de 6 hovedtrin i indlejringsprocessen af FFPE-vævsprøver.
- Indsamling af væv
Biopsier fra levende pattedyr og vævskulturer er begge levedygtige kilder til at opnå frisk væv til forberedelse af FFPE-prøver.
Det er vigtigt at bruge en aseptisk teknik: Brug sterile instrumenter og handsker for at undgå kontaminering. Ideelt set skal du indsamle væv i et sterilt miljø, såsom en kirurgisk suite eller laminær flowhætte.
Da prøven er meget skrøbelig, er dens følsomme håndtering afgørende: Minimer forsinkelser i behandlingen og start straks efterfølgende vævsbehandlingen efter excisionen. Dette er afgørende for at forhindre autolyse og nedbrydning. Opbevar vævet ved stuetemperatur; Undgå frysning, da det kan forårsage dannelse af iskrystaller og vævsskader. - Vævsfiksering
Først behandles vævet med en fikseringsopløsning: Brug 10 % neutral-bufret formalin (NBF), hvilket svarer til 4 % formaldehyd i vand, bufret til en neutral pH.
Nedsænk vævet helt i formalin. Sørg for et fikseringsmiddel-til-vævsvolumenforhold på mindst 10:1. Fikseringstiden varierer typisk fra 6 til 24 timer, afhængigt af vævstype og størrelse. Det er vigtigt, at fikseringsmidlet kan trænge grundigt ind i vævet. Overfiksering kan dog føre til tværbinding, der komplicerer antigenhentning, mens underfiksering kan resultere i dårlig vævsbevarelse. - Trimning af væv
For det andet skal vævet trimmes til en tykkelse på ca. 3-5 mm for at tillade tilstrækkelig penetration af fikseringsmiddel. Sørg for korrekt orientering af vævet for at fange relevante histologiske strukturer. Dette letter ekstraktionsprocessen, når vævet senere bruges til analyse. - Behandling af den fikserede prøve
Nu skal det faste væv dehydreres: Efter fiksering skal vævet dehydreres for at sikre grundig penetration af paraffinvoksen. Før vævet gennem en graderet serie af ethanol (70%, 80%, 90% og 100%) for at fjerne vand.
Rensning med xylen: Paraffinvoks er uopløseligt i vand, men opløseligt i xylen. Derfor skal vandet i vævet erstattes med xylen. Xylen i sig selv er imidlertid uopløseligt i vand, men opløseligt i alkohol, hvilket nødvendiggør et mellemtrin, hvor vand først erstattes med alkohol. Nedsænk vævet i xylen eller en xylenerstatning for at fjerne ethanol og forberede vævet til paraffininfiltration.
Infiltration ved hjælp af paraffin: Integrer vævet i smeltet paraffinvoks, hvilket sikrer fuldstændig infiltration. Dette trin involverer typisk flere udskiftninger af paraffin for at sikre grundig imprægnering. - Indlejring af vævet
I dette trin støbes vævet til en vævsblok: Placer vævet i en form med den ønskede orientering og hæld smeltet paraffin over det. Lad paraffinen størkne ved afkøling ved stuetemperatur eller på en kold plade. - Sektionering og montering
Mikrotomi: For at skære det indlejrede væv i skiver skal du bruge en mikrotom til at skære tynde sektioner (typisk 4-5 mikrometer) fra paraffinblokken. Derefter monteres prøven, og sektionerne placeres på glasglas til efterfølgende farvning og mikroskopisk analyse.
Til sidst skal du kontrollere kvaliteten af histologien: Evaluer de første sektioner under et mikroskop for at sikre korrekt fiksering og behandling. Juster protokoller efter behov baseret på vævstype og observeret kvalitet.
FFPE-væv kan bruges til at gendanne RNA, DNA og proteiner samt opdage tegn på kræft eller anden sygdom. De kan opbevares i årevis og er en væsentlig del af, hvordan forskere og læger udnytter vævsprøver til diagnose og forskning.
Hvad er almindelige problemer og udfordringer med FFPE-væv?
Formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver bruges i vid udstrækning i forskning og diagnostik, men de giver flere udfordringer og almindelige problemer:
- Nedbrydning af biomolekyler: Langvarig fiksering kan føre til nedbrydning af DNA, RNA og proteiner, hvilket gør det vanskeligt at udvinde nukleinsyrer eller proteiner af høj kvalitet til downstream-applikationer. Korrekt fiksering (undgå under- og overfiksering) er afgørende for vævsbevarelse.
- Antigen-maskering: Fikseringsprocessen kan maskere antigene steder, hvilket reducerer effektiviteten af antistofbinding i immunhistokemi og andre immunologiske assays. Dette kræver ofte antigenhentning, en procedure derved, at maskeringen af en epitop vendes, og epitop-antistofbinding genoprettes. Fuld antigenicitet kan dog ikke altid genoprettes.
- Variabel fikseringskvalitet: Forskelle i fikseringstider og -betingelser kan føre til inkonsekvent prøvekvalitet, hvilket påvirker reproducerbarheden og sammenligneligheden af resultaterne. Brug pålidelige fikseringsprotokoller og undgå under- og overfiksering.
- DNA-skader og fragmentering: Formalinfiksering af FFPE-prøver kan forårsage forskellige typer DNA-skader, herunder cytosindeaminering (C til T-mutationer), oxidativ skade (f.eks. 8-oxo-guanin, der fører til G til T-mutationer), samt fysiske forstyrrelser såsom hakker, huller og abasiske steder, der hindrer DNA-polymeraseaktivitet. Formalinfikseringsprocessen kan forårsage fragmentering af DNA, hvilket komplicerer genetiske og genomiske analyser såsom PCR og sekventering.
- RNA-kvalitet: RNA ekstraheret fra FFPE-væv er ofte fragmenteret og kemisk modificeret, hvilket gør det udfordrende at udføre transkriptomiske analyser af høj kvalitet.
- Protein modifikationer: Formalin kan inducere kemiske modifikationer i proteiner, hvilket påvirker deres struktur og funktion, hvilket kan forstyrre proteomiske analyser.
- Eksempel på behandlingsartefakter: Under indlejrings- og sektioneringsprocessen kan mekanisk belastning og varme introducere artefakter og forårsage yderligere skade på vævet.
- Batch-til-batch-variabilitet: Variationer i fikserings- og indlejringsprotokoller mellem forskellige batcher kan føre til betydelig variation i resultaterne, hvilket komplicerer sammenligninger mellem undersøgelser.
- Problemer med opbevaring: Langtidsopbevaring af FFPE-blokke kan føre til yderligere nedbrydning og tab af nukleinsyreintegritet over tid, hvilket påvirker levedygtigheden af arkivprøver til retrospektive undersøgelser.
Tværbinding: Formalinfiksering forårsager tværbinding af proteiner og nukleinsyrer, hvilket kan hindre molekylær analyse og påvirke nøjagtigheden af immunhistokemi og andre analyser.
Brug af optimerede protokoller, omhyggelig prøvehåndtering og anvendelse af avancerede teknikker hjælper med at forbedre kvaliteten og pålideligheden af data opnået fra FFPE-væv.
Hvad er forskellen mellem FFPE og frosset væv?
FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) væv konserveres ved hjælp af formalin til at fiksere vævet og derefter indlejret i paraffinvoks, hvilket giver mulighed for langtidsopbevaring ved stuetemperatur, samtidig med at vævsmorfologien opretholdes. I modsætning hertil bevares frosset væv hurtigt ved frysning, hvilket bedre opretholder integriteten af nukleinsyrer og proteiner, men kræver opbevaring ved meget lave temperaturer.
Hvilke kemikalier bruges til FFPE-indstøbning?
De kemikalier, der anvendes til FFPE-indstøbning, omfatter normalt formalin til fiksering og paraffinvoks til indstøbning. Til FFPE-indlejring fikseres væv typisk ved hjælp af enten 10 % (v/v) neutral bufret formalin (FA) eller en frisklavet 4 % (w/v) formaldehydopløsning (PFA) fremstillet af paraformaldehydpulver. Formalin, som er en opløsning af formaldehyd i vand, er bufret til en neutral pH for at bevare vævsmorfologi og forhindre overdreven tværbinding. Den paraformaldehydbaserede opløsning giver også effektiv fiksering ved tværbindingsproteiner og stabiliserer derved vævsstrukturen til efterfølgende indlejring i paraffinvoks. Disse kemikalier er afgørende for at opretholde vævets integritet og morfologi under fikserings- og indlejringsprocessen.
Hvordan fjernes paraffinen fra FFPE-prøver?
For at fjerne paraffin fra FFPE-prøver udsættes vævssektionerne typisk for en række xylenvaske efterfulgt af rehydrering gennem en gradueret serie af alkoholer og til sidst vand. Da xylen er meget giftigt og udgør sundhedsrisici såsom luftvejsproblemer, hudirritation og potentielle langsigtede virkninger ved gentagen eksponering, dukker ultralydsparaffinfjernelse op som et lovende alternativ i mange laboratorier. Denne metode bruger intense ultralydsbølger til effektivt og sikkert at fjerne paraffin uden behov for giftige opløsningsmidler som xylen, hvilket reducerer risikoen for laboratoriepersonale og skaber et sikrere arbejdsmiljø.
Hvor længe skal jeg fiksere mine væv for god FFPE-prøvekvalitet?
Generelle anbefalinger for fikseringsvarighed foreslår typisk fiksering af vævsprøver i formalin i 24 til 48 timer. Denne varighed er generelt tilstrækkelig til at bevare vævsmorfologi og cellulære strukturer og samtidig minimere overfiksering, hvilket kan føre til overdreven tværbinding og nedbrydning af nukleinsyrer og proteiner. Den optimale fikseringstid kan dog variere afhængigt af størrelsen og typen af væv, hvor mindre eller mere sarte prøver kræver kortere fikseringstider. Det er afgørende at afbalancere tilstrækkelig fiksering for at forhindre vævsautolyse og nedbrydning, samtidig med at man undgår langvarig fiksering, der kan komplicere nedstrøms molekylære analyser.