Proteomikprotokol: Kontaktfri sonikering forbedrer klargøringen af peptidprøver til MS
Bottom-up-proteomik er blevet en hjørnesten i moderne opdagelse af biomarkører, strukturbiologi og klinisk diagnostik. Ved at nedbryde proteiner til peptider før analyse med massespektrometri (MS) kan forskere opnå større sekvensdækning og mere pålidelig kvantificering. Klargøring af biologiske prøver med høj kompleksitet til MS er dog fortsat teknisk krævende. Nylige metodiske fremskridt fremhæver, hvordan kontrolleret ultralydsbehandling – specifikt med den kontaktfri multirørssonikator VialTweeter og mikropladesonikatoren UIP400MTP – kan strømline denne arbejdsgang betydeligt, forbedre reproducerbarheden og forebygge almindelige flaskehalse ved instrumenterne.
Find en detaljeret protokol til prøveklargøring for at opnå peptider af passende størrelse til analyse med MS.
Hvem bør bruge kontaktfri sonikering til klargøring af peptidprøver?
- Laboratorier for bottom-up-proteomik og opdagelsesbaseret forskning: Forskere, der klargør prøver med høj kompleksitet til arbejdsgange med LC-MS eller MALDI og har behov for ensartet peptidgenvinding med højt udbytte fra forskellige biologiske matricer.
- Brugere af S-Trap™ og suspensionsindfangning: Teams, der anvender oprensning med mikrokolonner og har behov for kontrolleret fragmentering af DNA ved forskydningskræfter for at forhindre tilstopning af kolonner og sikre problemfri prøvepåføring og nedbrydning.
- Kliniske og translationelle forskningsgrupper: Laboratorier, der behandler væv, celler, plasma, serum eller cerebrospinalvæske, hvor reproducerbarhed mellem batches og prøveintegritet er afgørende.
- Teams, der arbejder med kvantitativ og målrettet MS: Laboratorier, der udfører stringente sammenlignende studier, hvor sondesonikatorer medfører risiko for krydskontaminering, som kan kompromittere kvantificeringen af peptider med lav forekomst.
- Fællesfaciliteter og aktiviteter med høj prøvekapacitet: Grupper, der behandler flere biologiske replikater samtidigt og har fordel af bloksonikering af flere lukkede rør med VialTweeter, som eliminerer behovet for rengøring af sonden, reducerer den manuelle arbejdstid og opretholder aseptiske forhold.
- Forskere i PTM’er og proteinstruktur: Forskere, der har behov for skånsom, temperaturkontrolleret behandling for at bevare labile modifikationer og maksimere sekvensdækningen under cellelyse og homogenisering.
Sonikatoren til flere prøver “VialTweeter” til kontaktfri klargøring af prøver i flere forseglede prøveglas til proteomik
Protokoloversigt: Fra væv og celler til peptider klar til MS
Den udbredte arbejdsgang for bottom-up-proteomik, som Wojtkiewicz et al. beskriver, giver en robust, skalerbar metode til klargøring af peptidprøver fra forskellige biologiske matricer. Med 50–100 mg lynfrosset væv eller 1–20 millioner celler som udgangspunkt integrerer protokollen teknologi til suspensionsindfangning (S-Trap™) for effektivt at fjerne detergenter, salte og kontaminanter før enzymatisk nedbrydning.
Efter lyse, proteinkvantificering, reduktion og alkylering forsures prøven og påføres en S-Trap™-centrifugeringskolonne, hvor nedbrydning med trypsin/lysC finder sted. De resulterende peptider elueres, tørres og analyseres med LC-MS. Når denne arbejdsgang anvendes på 50 mg humant hjertevæv, giver den konsekvent tilstrækkeligt med peptider til 30–40 injektioner og identificerer over 4.000 unikke proteiner pr. kørsel. Selvom kemien og den kolonnebaserede oprensning er veldefinerede, afhænger arbejdsgangens succes i høj grad af de indledende trin med fysisk nedbrydning og håndtering af DNA.
Protokollen anbefaler brug af multirørssonikatoren VialTweeter til sonikering, der lyserer cellerne og fragmenterer DNA ved forskydningskræfter – begge trin er afgørende for peptidanalyse.
VialTweeter sonikerer forseglede Eppendorf-rør på 1,0, 1,5 og 2,0mL samt forskellige NUNC-prøveglas
Ultralydslyse af celler og væv til proteinekstraktion
I arbejdsgangen for bottom-up-proteomik er sonikering et centralt trin i lysen af celleprøver for at ekstrahere proteiner til efterfølgende massespektrometrisk analyse. Efter tilsætning af SDS-cellelysebuffer til cellepelleten ultralydsbehandles prøverne med multirørssonikatoren VialTweeter. Protokollen anvender 1,5 mL mikrocentrifugerør og angiver, at sonikatoren skal køre ved 30% effekt i 10 sekunder tændt og 10 sekunder slukket, gentaget over 3 cyklusser. Efter en ventetid på 1 minut gentages cyklussen yderligere to gange. Prøverne køles kontinuerligt med is.
Denne proces hjælper ikke kun med at nedbryde cellerne, men er specifikt nødvendig for at fragmentere det genomiske DNA, der frigives under lysen, ved forskydningskræfter. Effektiv fragmentering af DNA ved forskydningskræfter er afgørende for at reducere prøvens viskositet og forhindre tilstopning af S-Trap™-kolonnerne og dermed sikre optimal proteingenvinding og pålidelig efterfølgende peptidnedbrydning.
Den afgørende rolle, som ultralydsinduceret fragmentering af DNA ved forskydningskræfter spiller
En af de hyppigste fejl i S-Trap™-baserede arbejdsgange er tilstopning af kolonner, som næsten udelukkende skyldes genomisk DNA med høj molekylvægt, der frigives under homogenisering af celler eller væv. Intakt DNA øger prøvens viskositet dramatisk, indfanger peptider og blokerer den mikroporøse S-Trap™-sorbentmasse.
Ultralydsbehandling løser dette problem ved mekanisk at fragmentere DNA til små, opløselige fragmenter. Ved at tilføre kontrolleret akustisk energi fragmenterer VialTweeter effektivt nukleinsyrer ved forskydningskræfter uden at generere for meget varme eller tilføre fremmede kontaminanter. Denne reduktion af viskositeten sikrer problemfri prøvepåføring, ensartede gennemstrømningshastigheder og uafbrudt nedbrydningskinetik.
Optimerede sonikeringsparametre for VialTweeter
Protokollen angiver et sonikeringsforløb med høj reproducerbarhed, som er optimeret til biologisk prøveintegritet og kompatibilitet med efterfølgende MS. For prøver i 1,5mL mikrocentrifugerør, der behandles med den kontaktfri bloksonikator Hielscher VialTweeter, giver følgende parametre lyse og optimal fragmentering af DNA ved forskydningskræfter, samtidig med at proteinstrukturen bevares:
- Amplitude: 30% effekt
- Cyklusmønster: 10 sekunder TÆNDT / 10 sekunder SLUKKET
- Varighed: 3 cyklusser (10sek TÆNDT/10sek SLUKKET) → 1 minuts hvile på is → gentag yderligere 2 gange
- Temperaturstyring: Prøverne placeres på is under behandlingen for at forhindre termisk denaturering og for tidlig enzymatisk aktivitet
Denne fremgangsmåde med pulseret sonikering forhindrer lokal overophedning, minimerer peptidoxidation og sikrer ensartet akustisk eksponering af alle prøveglas. Opsætningen med lukkede rør eliminerer også behovet for at rengøre sonden mellem prøverne og reducerer dermed den manuelle arbejdstid og variationen mellem operatører drastisk.
Vigtige fordele for moderne proteomikarbejdsgange
Integration af VialTweeter i din arbejdsgang for bottom-up-proteomik giver flere driftsmæssige og videnskabelige fordele:
- Ensartet DNA-fragmentering: Ensartet tilførsel af akustisk energi til alle prøveglas sikrer reproducerbar reduktion af viskositeten og forhindrer variation mellem batches ved påføring på S-Trap™.
- Bevarelse af labile modifikationer: Behandling ved lav temperatur i et isbad beskytter posttranslationelle modifikationer (PTM’er) og forhindrer varmeinduceret proteinaggregering under cellelyse.
- Strømlinet efterfølgende behandling: Lysater behandlet med VialTweeter kan direkte klares ved centrifugering og kvantificeres uden yderligere oprensningstrin, hvilket fremskynder forløbet frem til S-Trap™-nedbrydning.
- Skalerbarhed og fleksibilitet: De samme sonikeringsindstillinger kan anvendes på både vævsprøver med høj kompleksitet og cellesuspensioner og understøtter arbejdsgange inden for opdagelsesbaseret proteomik, målrettet kvantificering og glykoproteomik. Hielschers mikropladesonikatorer gør det let at opskalere til store antal prøver i multibrøndsplader.
Den kontaktfri multirørssonikator VialTweeter kan anvendes i køleskabe
Sonikatorer til proteomisk prøveklargøring
Klargøring af peptidprøver af høj kvalitet til massespektrometri kræver mere end effektiv lyse – det kræver præcis kontrol over fragmentering af DNA ved forskydningskræfter, temperatur og forebyggelse af kontaminering. Ved at integrere Hielscher VialTweeter i din arbejdsgang for bottom-up-proteomik kan du eliminere tilstopning af S-Trap™, sikre reproducerbar proteingenvinding og opretholde den renhed, der kræves til følsomme analyser med MS. Uanset om du behandler humant væv, dyrkede celler eller komplekse lysater, giver ultralydsbehandling i blok den pålidelighed, skalerbarhed og proceskontrol, som moderne proteomiklaboratorier kræver.
For at opskalere til større antal prøver kan du benytte de fokuserede, kontaktfri mikropladesonikatorer fra Hielscher, modellerne UIP400MTP og UIP550MTP! Behandl enhver standardmultibrøndsplade til proteomik med høj prøvekapacitet!
Behandling i lukkede rør sammenlignet med traditionelle sondesonikatorer
Historisk har forskere anvendt sondesonikatorer med direkte kontakt til at fragmentere DNA ved forskydningskræfter. Selvom sondesystemer er effektive, medfører de flere afgørende begrænsninger i proteomikarbejdsgange:
- Risiko for krydskontaminering: Genbrug af en sonde til flere prøver medfører overførsel via aerosoler og tilfører krydskontaminanter, der forvrænger kvantitative resultater fra MS.
- Prøvetab: Direkte indføring kan føre til stænk, fordampning og vedhæftning af værdifulde peptider til sondens overflade.
- Rengøring: Grundig dekontaminering af sonden mellem kørsler er tidskrævende og ofte ufuldstændig, hvilket kompromitterer studier af proteiner med lav forekomst.
Bloksonikatoren VialTweeter behandler prøver udelukkende inde i forseglede mikrocentrifugerør. Dette lukkede system eliminerer kontakt mellem sonde og prøve, forhindrer aerosoldannelse og opretholder strengt aseptiske forhold under hele homogeniseringen og lysen. For laboratorier, der behandler vævslysater med høj kompleksitet eller flere cellelinjer, betyder det renere data fra MS, højere peptidgenvinding og mere pålidelige biologiske replikater.
Opskalering til prøveklargøring med høj prøvekapacitet i multibrøndsplader
Med mikropladesonikatorerne UIP400MTP og UIP550MTP, kan behandlingen i rør let opskaleres til prøvebehandling med høj prøvekapacitet i enhver standardmultibrøndsplade.
Sonikator til multibrøndsplader UIP400MTP til proteinekstraktion med høj prøvekapacitet fra prøver
Ofte stillede spørgsmål om sonikering til klargøring af peptidprøver
Hvorfor er sonikering nødvendig før behandling af peptider med S-Trap™?
Sonikering er nødvendig for ved forskydningskræfter at fragmentere genomisk DNA med høj molekylvægt, der frigives under celle- eller vævslyse. Intakt DNA øger prøvens viskositet drastisk, hvilket kan tilstoppe mikrokolonnen S-Trap™ og indfange peptider og dermed kraftigt reducere genvindingen og kompatibiliteten med MS.
Hvordan forbedrer bloksonikatoren VialTweeter prøveklargøringen sammenlignet med traditionelle sondesonikatorer?
I modsætning til sondesonikatorer med direkte kontakt, som kræver omhyggelig rengøring mellem kørsler og indebærer risiko for overførsel via aerosoler, behandler VialTweeter prøver udelukkende inde i forseglede prøveglas og mikrocentrifugerør. Dette design med lukkede rør eliminerer krydskontaminering, forhindrer prøvetab og opretholder strengt aseptiske forhold under hele homogeniseringen og cellelysen.
Hvad er de optimale sonikeringsparametre til proteomisk prøveklargøring?
Til biologiske prøver såsom celler og væv anvender den anbefalede protokol en sonikator af typen VialTweeter ved 30% effekt med en cyklus på 10 sekunder tændt / 10 sekunder slukket, gentaget 3 gange. Prøverne bør holdes på is under behandlingen, og cyklussen bør gentages yderligere to gange, hvis der behandles ≥5 millioner celler. (jf. Wojtkiewicz et al., 2021)
Hvad skal jeg gøre, hvis min S-Trap™-kolonne tilstoppes under prøvepåføringen?
Tilstopning af kolonner skyldes typisk høj viskositet på grund af DNA eller utilstrækkelig klaring. For at løse dette skal du centrifugere dit lysat grundigt før pipettering og sikre, at DNA fragmenteres tilstrækkeligt ved forskydningskræfter gennem sonikering.
Hvordan gavner kontaktfri sonikering kvantitative proteomikarbejdsgange?
I kvantitative studier kan selv spor af krydskontaminering mellem prøver forvrænge målinger af peptider med lav forekomst. VialTweeters behandling af flere prøveglas i lukkede rør eliminerer indføring af en sonde, sikrer reproducerbarhed mellem batches og opretholder prøveintegriteten med henblik på nøjagtige sammenlignende analyser.
Hvilket proteinudbytte og hvilken analysedybde med MS kan jeg forvente med denne protokol?
Med 50 mg humant hjertevæv eller 5 millioner celler som udgangspunkt giver arbejdsgangen med S-Trap™ typisk tilstrækkeligt med peptider til 30–50 injektioner til LC-MS og identificerer konsekvent over 4.000 unikke proteiner pr. kørsel. (jf. Wojtkiewicz et al., 2021)
Litteratur / Referencer
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics leverer kraftige kontaktfri sonikatorer til prøveklargøring og klinisk analyse. Sonikatoren til multibrøndsplader UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn og gennemstrømningssonikatoren GDmini2 behandler prøverne uden at berøre dem.