Proteomikprotokol: Berøringsfri ultralydsbehandling forbedrer forberedelsen af peptidprøver til MS

Bottom-up-proteomik er blevet en hjørnesten inden for moderne opdagelse af biomarkører, strukturbiologi og klinisk diagnostik. Ved at nedbryde proteiner til peptider inden massespektrometri (MS)-analyse kan forskere opnå en mere omfattende sekvensdækning og en mere pålidelig kvantificering. Det er dog stadig teknisk krævende at forberede biologiske prøver med høj kompleksitet til MS. Nylige metodologiske fremskridt understreger, hvordan kontrolleret ultralydsbehandling – navnlig med den berøringsfri VialTweeter Multi-Tube-sonikator og UIP400MTP-mikropladesonikatoren – kan i væsentlig grad strømline denne arbejdsgang, forbedre reproducerbarheden og forhindre almindelige flaskehalse i instrumenterne.
Her finder du en detaljeret vejledning i prøveforberedelse, der gør det muligt at fremstille peptider af en passende størrelse til analyse ved hjælp af MS.

Hvem bør anvende kontaktfri ultralydsbehandling til forberedelse af peptidprøver?

• Bottom-up-proteomik & Discovery Labs: Forskere, der forbereder meget komplekse prøver til LC-MS- eller MALDI-arbejdsgange, og som har behov for en ensartet peptidudvinding med højt udbytte på tværs af forskellige biologiske matricer.
• S-Trap™ & Suspension, der spærrer brugere: Teams, der anvender oprensning ved hjælp af mikrosøjler, og som har behov for kontrolleret DNA-opdeling for at forhindre tilstopning af søjlerne og sikre problemfri påfyldning og nedbrydning af prøverne.
• klinisk & Grupper inden for translationel forskning: Laboratorier, der behandler væv, celler, plasma, serum eller cerebrospinalvæske, hvor reproducerbarhed fra parti til parti og prøvernes integritet er af afgørende betydning.
• Kvantitativ & Målrettede MS Teams: Laboratorier, der gennemfører strenge sammenlignende undersøgelser, hvor ultralydsapparater med genanvendelige prober udgør en risiko for krydskontaminering, der kan kompromittere kvantificeringen af peptider med lav forekomst.
• Fællesfaciliteter & Drift med høj kapacitet: Grupper, der behandler flere biologiske replikater samtidigt, og som drager fordel af sonikering af lukkede rør i blokke med VialTweeter, hvilket eliminerer behovet for rengøring af prober, reducerer den manuelle arbejdstid og opretholder aseptiske forhold.
• Forældre-lærermøde & Forskere inden for strukturproteiner: Forskere, der har brug for skånsom, temperaturreguleret behandling for at bevare ustabile ændringer og maksimere sekvensdækningen under cellelyse og homogenisering.

Oversigt over protokollen: Fra væv og celler til peptider, der er klar til MS-analyse

Den bredt anvendte bottom-up-proteomik-arbejdsgang, som Wojtkiewicz et al. har beskrevet, udgør en robust og skalerbar metode til fremstilling af peptidprøver fra forskellige biologiske matricer. Med udgangspunkt i 50–100 mg hurtigfrosset væv eller 1–20 millioner celler integrerer protokollen suspension trapping (S-Trap™)-teknologi til effektiv fjernelse af detergenter, salte og forurenende stoffer før enzymatisk nedbrydning.
Efter lysering, proteinkvantificering, reduktion og alkylering forsures prøven og påføres en S-Trap™-spinkolonne, hvor trypsin/lysC-fordøjelsen finder sted. De resulterende peptider elueres, tørres og underkastes LC-MS-analyse. Når denne arbejdsgang anvendes på 50 mg humant hjertevæv, giver den konsekvent tilstrækkelige mængder peptider til 30–40 injektioner, hvilket muliggør identifikation af over 4.000 unikke proteiner pr. kørsel. Selvom kemien og den kolonnebaserede oprensning er veldefinerede, afhænger succesen af arbejdsgangen i høj grad af de indledende trin med fysisk nedbrydning og håndtering af DNA.
I protokollen anbefales det at anvende VialTweeter Multi-Tube Sonicator til sonikering med henblik på at lysere cellerne og nedbryde DNA’et – Begge trin er afgørende for peptidanalysen.

Ultralydsbaseret celle- og vævslysering til proteinekstraktion

I den bottom-up-baserede proteomik-arbejdsgang er ultralydsbehandling et centralt trin i lyseringen af celleprøver med henblik på ekstraktion af proteiner til efterfølgende massespektrometrianalyse. Efter tilsætning af SDS-cellelyseringsbuffer til cellepelleten underkastes prøverne ultralydsbehandling ved hjælp af VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Protokollen anvender 1,5 ml mikrocentrifugerør og angiver, at sonikatoren skal køre ved 30 % effekt i 10 sekunder tændt og 10 sekunder slukket, gentaget i 3 cyklusser. Efter at have ventet 1 minut gentages cyklussen yderligere to gange. Prøverne afkøles løbende med is.
Denne proces bidrager ikke blot til nedbrydningen af cellerne, men er også specifikt nødvendig for at fragmentere det genomiske DNA, der frigives under lyseringen. En effektiv fragmentering af DNA’et er afgørende for at reducere prøvens viskositet og forhindre tilstopning af S-Trap™-kolonnerne, hvilket sikrer en optimal proteinudvinding og en pålidelig efterfølgende peptidfordøjelse.

Den afgørende rolle, som ultralydsbaseret DNA-opdeling spiller

En af de hyppigste fejl i S-Trap™-baserede arbejdsgange er tilstopning af kolonnen, hvilket næsten udelukkende skyldes genomisk DNA med høj molekylvægt, der frigives under homogenisering af celler eller væv. Intakt DNA øger prøvens viskositet markant, fastholder peptider og blokerer det mikroporøse S-Trap™-sorbentlag.
Ultralydsbehandling løser dette problem ved mekanisk at nedbryde DNA til små, opløselige fragmenter. Ved at påføre kontrolleret akustisk energi skærer VialTweeter effektivt nukleinsyrerne i stykker uden at generere overdreven varme eller tilføre fremmede forurenende stoffer. Denne reduktion af viskositeten sikrer problemfri påfyldning af prøver, ensartede gennemstrømningshastigheder og uafbrudt fordøjelseskinetik.

Optimerede sonikeringsparametre for VialTweeter

Protokollen beskriver et sonikeringsforløb med høj reproducerbarhed, der er optimeret med henblik på at bevare biologiske prøvers integritet og sikre kompatibilitet med efterfølgende MS-analyser. For prøver i 1,5 ml mikrocentrifugerør, hvor der anvendes Hielscher VialTweeter-sonikatoren med berøringsfri blok, sikrer følgende parametre lysering og optimal DNA-opdeling, samtidig med at proteinstrukturen bevares:

• Amplitude: 30 % effekt
• Cyklusmønster: 10 sekunder TÆNDT / 10 sekunder SLUKKET
• Varighed: 3 cyklusser (10 sek. på/10 sek. fra) → 1 minuts pause på is → gentag yderligere 2 gange
• Temperaturstyring: Prøverne anbringes på is under behandlingen for at forhindre termisk denaturering og for tidlig enzymatisk aktivitet

Denne metode med pulserende ultralyd forhindrer lokal overophedning, minimerer oxidationen af peptiderne og sikrer en ensartet akustisk eksponering på tværs af alle hætteglas. Opstillingen med lukkede rør eliminerer desuden behovet for rengøring af sonden mellem prøverne, hvilket drastisk reducerer den manuelle arbejdstid og variationen mellem operatører.

De vigtigste fordele ved moderne proteomik-arbejdsgange

Integrationen af VialTweeter i din bottom-up-proteomik-pipeline giver en række operationelle og videnskabelige fordele:

1. Konsekvent DNA-fragmentering: En ensartet tilførsel af akustisk energi til alle hætteglas sikrer en reproducerbar viskositetsreduktion og forhindrer variationer mellem de enkelte batcher ved påfyldning af S-Trap™.
2. Bevarelse af labile modifikationer: Behandling ved lav temperatur i et isbad beskytter posttranslationelle modifikationer (PTM’er) og forhindrer varmeinduceret proteinaggregering under cellelyse.
3. Strømlinet efterbehandling: Lysater, der er behandlet med VialTweeter, kan klares direkte ved centrifugering og kvantificeres uden yderligere oprensningstrin, hvilket fremskynder processen frem mod S-Trap™-fordøjelsen.
4. Skalerbarhed & Fleksibilitet: De samme ultralydsindstillinger gælder både for vævsprøver med høj kompleksitet og for cellesuspensioner, hvilket understøtter arbejdsgange inden for opdagelsesproteomik, målrettet kvantificering og glykoproteomik. Hielschers ultralydsapparater til mikroplader muliggør nem opskalering til store prøveantal i mikroplader med flere brønde.

Litteratur / Referencer