Lyse af gærceller i mikroplader ved hjælp af højintensiv ultralydsbehandling

Mikrobiologer og forskere inden for biovidenskab, der arbejder med Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, og andre, der arbejder med gærsystemer, kender udfordringen: Gærceller er robuste, det kan være svært at opnå en reproducerbar lysering, og manuel opbrydning af prøverne bliver hurtigt en flaskehals, når der skal screenes mange stammer, kloner, dyrkningsbetingelser eller ekspressionskonstruktioner.

Gærlysering med høj kapacitet til mikrobiologi, molekylærbiologi og proteinanalyse

Hielschers mikroplade-sonikatorer, såsom UIP400MTP (400 W) og UIP550MTP (550 W), udgør en løsning med høj kapacitet til mekanisk lysering af gærceller direkte i mikroplader. I stedet for at behandle prøverne én efter én med en sonde kan hele mikropladerne sonikeres under ensartede betingelser. Dette gør ultralydslyse af gær hurtigere, mere reproducerbar og lettere at integrere i moderne mikrobiologi, proteinekspression, enzymscreening og omics-arbejdsgange.
Uanset om du skal udvinde rekombinante proteiner fra P. pastoris, fremstille gærlysater til enzymassays, nedbryde S. cerevisiae til proteinanalyse eller screene snesevis af gærkloner parallelt, leverer Hielschers mikropladesonikatorer kraftfuld, kavitationsbaseret cellenedbrydning med præcis proceskontrol.

Hvorfor gærceller har brug for effektiv mekanisk lysering

Gærceller er sværere at lysere end mange bakterie- eller pattedyrceller, fordi de er beskyttet af en stiv cellevæg, der hovedsageligt består af polysaccharider, glukaner, mannoproteiner og kitin. Denne cellevæg giver mekanisk stabilitet, men begrænser også frigivelsen af intracellulære proteiner, nukleinsyrer, metabolitter og enzymer.
Traditionelle metoder til gærlysering omfatter perlebehandling, enzymatisk nedbrydning, fryse-tø-cyklusser, kemisk lysering og ultralydsbehandling med sonde. Disse metoder kan være effektive, men de har også visse begrænsninger. Bead beating kan medføre partikler og opvarmning, enzymatisk nedbrydning kan øge omkostningerne og variabiliteten, og sonikering med probe på enkeltprøver er tidskrævende, når der skal behandles et stort antal prøver.
Højintensiv, fokuseret ultralydskavitation overvinder disse begrænsninger ved at påføre gærsuspensionen intense mekaniske forskydningskræfter, trykudsving og mikrostrømning. Resultatet er en hurtig nedbrydning af cellevægge og membraner, forbedret frigivelse af indholdet i cellerne samt en meget reproducerbar prøveforberedelse i pladeformat.

Ultralydsbehandling af mikroplader til parallel forberedelse af gærprøver

Hielscher UIP400MTP og UIP550MTP er udviklet til ensartet ultralydsbehandling af mikroplader, multiwell-plader, PCR-plader og egnede prøvestativer. I modsætning til ultralydsbehandling med sonde behøver prøverne ikke at blive behandlet enkeltvis. Hele pladen udsættes for kontrolleret ultralydsenergi, hvilket gør arbejdsgangen særdeles velegnet til parallel prøvebehandling.

Dette er især nyttigt til:

• Screening Bagegær mutanter eller ekspressionsstammer
• Lyse af Fader, hyrde / K. phaffii kloner efter ekspression af rekombinant protein
• Fremstilling af gærlysater til enzymanalyser
• Proteinekstraktion til SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS eller aktivitetstest
• Frigivelse af intracellulære metabolitter til metabolomik
• Forberedelse af DNA- og RNA-prøver efter passende efterfølgende oprensning
• Optimering med høj kapacitet af lyseringsbuffere, tilsætningsstoffer og ekstraktionsbetingelser

Hvordan ultralydskavitation ødelægger gærceller

Under sonikering frembringer fokuseret højfrekvent ultralyd skiftevis kompressions- og fortætningscyklusser i den flydende prøve. Ved tilstrækkelig intensitet skaber disse trykudsving akustisk kavitation. Kavitationsbobler dannes, svinger og kollapser, hvilket frembringer lokaliserede forskydningskræfter, mikrostråler, turbulens og stærke trykgradienter.
I gærsuspensioner svækker og bryder disse mekaniske påvirkninger cellevæggen og cellemembranen. Intracellulære proteiner, enzymer, nukleinsyrer og metabolitter frigives i lyseringsbufferen. Da processen er mekanisk, kan den anvendes med mange forskellige buffersystemer og kombineres med proteasehæmmere, reduktionsmidler, detergenter, salte eller mild enzymatisk forbehandling.

Generel protokol: Lysering af gærceller i mikroplader

Følgende protokol udgør et praktisk udgangspunkt for lysering af gær ved hjælp af Hielscher UIP400MTP- eller UIP550MTP-mikropladesonikatoren. Parametrene bør optimeres i henhold til gærstammen, celletætheden, målmolekylet, buffersammensætningen, pladetypen og den efterfølgende analyse.

1. Indsamling og vask af gærceller

Dyrk Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces eller en anden gærstamme under de ønskede dyrkningsbetingelser. Høst cellerne ved centrifugering, og fjern dyrkningsmediet. Vask bundfaldet med koldt destilleret vand, PBS eller den valgte lyseringsbuffer for at fjerne resterende mediekomponenter, der kan forstyrre den efterfølgende analyse.
Ved proteinekstraktion skal prøverne holdes kolde, og arbejdet skal udføres hurtigt. Hvis der er risiko for proteaser, skal alle buffere og forbrugsartikler forkøles.

2. Resuspender cellebundfaldet

Resuspender gærpelleten i en egnet kold lyseringsbuffer. For at opnå en effektiv frigivelse af proteiner er en høj celletæthed ofte en fordel. Brug som udgangspunkt ca. 10–20 % w/v våd cellepellet eller en tæt suspension svarende til OD₆₀₀ > 10, afhængigt af analysen.

En typisk lyseringsbuffer til gærproteiner kan indeholde:

• buffersystemer såsom Tris-HCl, fosfatbuffer eller HEPES
• salt, f.eks. NaCl eller KCl
• proteasehæmmer cocktail
• et valgfrit reduktionsmiddel, såsom DTT eller β-mercaptoethanol
• valgfrit vaskemiddel, f.eks. Triton X-100, NP-40, SDS eller CHAPS, afhængigt af kompatibiliteten med efterfølgende processer
• valgfrie fosfatasehæmmere til fosforyleringsundersøgelser

Ved vanskelige gærstammer eller meget skånsom proteinekstraktion kan der anvendes en kort forbehandling med Zymolyase, Lyticase eller et andet cellevæg-nedbrydende enzym inden ultralydsbehandlingen. Denne enzymatiske forbehandling er valgfri, men kan forbedre lyseeffektiviteten eller reducere den nødvendige ultralydsintensitet.

3. Overfør prøverne til en egnet mikroplade

Hæld gærsuspensionen over i en mikroplade, der er egnet til ultralydsbehandling. Plader med rund bund foretrækkes ofte, da de forbedrer prøveopsamlingen og mindsker antallet af døde zoner. Brug ensartede prøvevolumener i alle brøndene for at forbedre reproducerbarheden.
Tæt pladen med en egnet tætningsmåtte eller -film for at forhindre fordampning, dannelse af aerosoler og krydskontaminering. Sørg for, at tætningen er kompatibel med de valgte temperatur- og ultralydsbetingelser.
De typiske arbejdsvolumener afhænger af pladeformatet og anvendelsen. Almindelige formater omfatter 96-brønds-plader, dybbrøndsplader, PCR-plader eller egnede rørholdere.

4. Indstilling af køling

Nedbrydning af gær kræver høj ultralydsintensitet, og den mekaniske nedbrydning genererer varme. Temperaturregulering er derfor af afgørende betydning, især i forbindelse med analyse af proteiner, enzymer, RNA eller fosforylering.

Anvend en passende kølemetode, f.eks.:

• forkølet lysisbuffer
• forkølede mikroplader
• kølepauser mellem ultralydsbehandlingsintervallerne
• ekstern køling af sonikeringsplatformen, hvor det er relevant

Målet er at holde prøven kold nok til at forhindre proteindenaturering, enzymdeaktivering, RNA-nedbrydning og varmeinduceret variabilitet i prøven.

5. Behandl gærsuspensionen med ultralyd

Sæt den forseglede plade ind i Hielscher UIP400MTP- eller UIP550MTP-mikropladesonikatoren, og vælg et pulserende sonikeringsprogram. Pulserende sonikering anbefales, da det muliggør mekanisk nedbrydning i ON-faserne og varmeafledning i OFF-faserne.
Som udgangspunkt for lysering af gærceller:

Ved meget resistente gærsuspensioner, tæt P. pastoris-biomasse eller vanskelig ekstraktion af rekombinante proteiner bør den samlede ON-tid øges trinvis. Ved varmefølsomme proteiner eller enzymassays bør der anvendes kortere impulser, længere afkølingspauser og en lavere startamplitude.

Højkapacitets-gærlysering i multiwell-plader med UIP400MTP

6. Oprensning af lysatet

Efter ultralydsbehandlingen skal mikropladen centrifugeres, eller prøverne skal overføres til rør med henblik på centrifugering. Fjern cellerester ved centrifugering ved en passende hastighed og temperatur. Opfang supernatanten til efterfølgende analyse.

Afhængigt af anvendelsen kan lysatet bruges til:

• Kvantificering af protein
• analyser af enzymaktivitet
• SDS-PAGE og Western blotting
• ELISA og immunanalyser
• LC-MS/MS-proteomik
• metabolitanalyse
• Oprensning af DNA eller RNA

7. Optimering og dokumentation af metoden

For at sikre reproducerbar gærlysering skal alle relevante parametre dokumenteres, herunder stamme, dyrkningsbetingelser og OD₆₀₀, vådcellemasse, buffersammensætning, pladetype, prøvevolumen, amplitude, pulscyklus, kumulativ tændtid, kølemetode og den endelige prøvetemperatur.
Hvis Hielscher-ultralydsapparatet er udstyret med automatisk dataregistrering, kan procesdataene anvendes til dokumentation, metodeudvikling, opskalering og kvalitetskontrol.

Tips til optimering af gærlysering

For at opnå maksimal proteinfrigivelse skal der anvendes tætte gærsuspensioner, høj ultralydsintensitet og tilstrækkelig samlet driftstid. Ved følsomme proteiner skal amplituden reduceres, afkølingspauserne forlænges, og pladen holdes kold under hele forløbet.
Hvis lyseringen er ufuldstændig, skal du øge sonikeringstiden trinvist, afprøve en enzymatisk forbehandling, reducere prøvens viskositet eller optimere bufferen. Hvis proteinerne nedbrydes eller mister deres aktivitet, skal du forbedre kølingen, forkorte ON-intervallerne, tilsætte hæmmere og kontrollere, at detergentblandingen er kompatibel med målproteinet.
Da gærstammer adskiller sig væsentligt med hensyn til cellevægsstruktur, vækstfase, ekspressionssystem og biomassetæthed, anbefales det at anvende en kort optimeringsmatrix. Man kan f.eks. afprøve tre amplituder, to pulscyklusser og to samlede ON-tider og derefter vurdere lyseeffektiviteten og proteinintegriteten.

Fordele ved Hielschers mikroplade-sonikatorer til lysering af gær

Hielschers ultralydsapparater til mikroplader er ideelle til laboratorier, der har brug for reproducerbar lysering af mange prøver. De eliminerer den langsomme håndtering, hvor der kun kan behandles én prøve ad gangen, som er kendetegnende for ultralydsbehandling med sonde, og reducerer variationen, der skyldes manuel placering af sonden, nedsænkningsdybden og forskelle i håndteringen fra prøve til prøve.

De vigtigste fordele er:

• Behandling med høj kapacitet: Udfør sonikering af mange gærprøver samtidigt i mikroplader eller kompatible prøvestativer.
• Betingelser, der kan gentages: Ensartede ultralydsbehandlingsbetingelser i alle brønde for at opnå ensartede og sammenlignelige lyseringsresultater.
• Ingen krydskontaminering mellem prober: Prøverne forbliver forseglede under ultralydsbehandlingen, hvilket mindsker overførsel af urenheder og antallet af rengøringstrin.
• Egnet til robuste celler: Ultralyd med høj intensitet bidrager til at nedbryde gærcellernes cellevægge.
• Effektiv arbejdsgang: Ideel til screening af stammer, kloner, ekspressionsbetingelser og lyseringsbuffere.
• Effektiv arbejdsgang: Programmerbare indstillinger, automatisk datalogning og velegnet til laboratorieautomatisering.

Anvendelser inden for gærbioteknologi og forskning i biovidenskab

Ultralydsbaseret gærlysering i mikroplader understøtter mange forsknings- og screeningsarbejdsgange. Ved ekspression af rekombinante proteiner kan P. pastoris- og S. cerevisiae-kloner lyseres parallelt for at sammenligne ekspressionsniveauer eller enzymaktivitet. Inden for systembiologi og omics forbedrer standardiseret lysering sammenligneligheden på tværs af forskellige betingelser. Inden for mikrobiologi muliggør ultralydsbehandling hurtig fremstilling af lysater fra flere stammer, under forskellige medieforhold eller efter stressbehandlinger.
Typiske anvendelsesområder omfatter:

• udvinding af gærprotein
• screening af rekombinante proteiner
• screening af enzymaktivitet
• udvælgelse af kloner efter transformation
• optimering af gæringsprocessen
• forberedelse af proteomikprøver
• præparering af prøver til metabolomik
• undersøgelser af nedbrydning af cellevægge
• mikrobiologiske analyser med høj gennemstrømning

Pålidelig gærlysis begynder med kontrolleret ultralydsbehandling

Gærlysering kan være vanskelig, når antallet af prøver stiger, men Hielschers ultralydsapparater til mikroplader gør processen hurtigere, renere og mere reproducerbar. Med UIP400MTP og UIP550MTP kan forskere behandle hele plader under definerede ultralydsbetingelser, hvilket øger gennemløbshastigheden og samtidig reducerer den manuelle håndtering.
For mikrobiologer, molekylærbiologer, proteinforskere og bioteknologiske laboratorier er ultralydsbehandling af mikroplader et effektivt redskab til at frigøre intracellulære gærkomponenter på en effektiv og reproducerbar måde.

Litteratur / Referencer