Ultralydsbehandling af mikroplader i shotgun-proteomik – Anvendelsesvejledning

Shotgun-proteomik er afhængig af en effektiv og reproducerbar prøveforberedelse for at omdanne komplekst biologisk materiale til peptider, der er klar til LC-MS/MS-analyse. UIP400MTP-mikropladesonikatoren understøtter denne proces ved at muliggøre standardiseret, parallel sonikering af prøver med lille volumen, hvilket hjælper laboratorier med at forbedre nedbrydning, ekstraktion og genopløsning i mikropladebaserede arbejdsgange. Denne anvendelsesvejledning beskriver, hvordan UIP400MTP kan integreres i proteomisk prøveforberedelse, ved hjælp af en offentliggjort arbejdsgang for ekstracellulære vesikler fra PLA2G12A/Th17-undersøgelser som et laboratorietestet eksempel.

Ultralydsbehandling af mikroplader for mere reproducerbar shotgun-proteomik

For proteomikforskere er reproducerbar prøveforberedelse afgørende for at opnå LC-MS/MS-data af høj kvalitet. UIP400MTP-mikropladesonikatoren understøtter standardiseret, parallel sonikering i pladebaserede arbejdsgange og arbejdsgange med små volumener og høj gennemstrømning.

Det er især nyttigt for laboratorier, der arbejder med:

• Store prøvesæt, der kræver ensartet behandling på tværs af mange brønde
• Materiale med begrænset tilførsel, hvor prøvetab og variabilitet skal minimeres
• Lipidrige prøver, såsom ekstracellulære vesikler
• Komplekse biologiske præparater, der kræver effektiv nedbrydning, ekstraktion eller genopløsning
• Sammenlignende shotgun-proteomik, hvor reproducerbarhed på tværs af forsøgsbetingelser og gentagelser er afgørende

Ved at indføre ultralydsbehandling af mikroplader før nedbrydningen kan forskerne forbedre prøvernes egnethed til:

• Proteinekstraktion og resolubilisering
• Trypsin/Lys-C-fordøjelse
• Nano-LC/MS/MS-dataindsamling
• Kvantitativ proteomikanalyse i efterfølgende trin

 

Skalér din proteomik-prøveforberedelse med tillid!
Lær, hvordan ultralydsbehandling af mikroplader bidrager til at mindske manuelle afvigelser, forbedre nedbrydningen af prøverne og forberede komplekse biologiske prøver til pålidelig LC-MS/MS-analyse.

Anmodning om oplysninger


E-mailadresse (påkrævet)


Produkt eller interesseområde



Jeg accepterer privatlivspolitikken









Anmod om oplysninger

Ultralydsbehandling af mikroplader kan være en fordel ved:

• Kernefaciliteter inden for proteomik
• Forskningslaboratorier inden for elbilteknologi
• Laboratorier for immunologi og cellebiologi
• Grupper inden for translationel forskning
• Teams inden for biovidenskab, der udvider deres arbejdsgange fra forberedelse af enkeltprøver til arbejdsgange med højere gennemstrømning

Prøveforberedelse med høj kapacitet til analyse af proteomet i ekstracellulære vesikler

Hvad er Shotgun-proteomik?

Shotgun-proteomik er blevet en central analysestrategi til karakterisering af komplekse biologiske prøver, lige fra helcellelysater og vævsekstrakter til rensede organeller, ekstracellulære vesikler og kliniske prøver med lavt indhold. Dens største styrke ligger i kombinationen af proteinnedbrydning, højopløsningsvæskekromatografi-tandem-massespektrometri og computermæssig inferens fra peptid til protein. Kvaliteten af det endelige proteomdatasæt bestemmes imidlertid længe før prøven når frem til massespektrometeret. Effektiv prøveopbrydning, opløsning af proteiner, fjernelse af forstyrrende stoffer, reproducerbar enzymatisk fordøjelse og robust peptidudvinding er alle afgørende for dækningsdybden og den kvantitative pålidelighed.
For proteomikforskere og laboratorier inden for biovidenskab, der arbejder med begrænsede eller værdifulde prøver, udgør prøveforberedelsen ofte en flaskehals.

Udfordringen ved ekstracellulære vesikler inden for proteomik

Ekstracellulære vesikler (EV’er) udgør for eksempel en særligt krævende prøveklasse. De er membranbundne, lipidrige partikler i nanoskala med et relativt lavt proteinudbytte og en høj risiko for overførsel af lipider, salte, detergenter, serumproteiner og andre matrixkomponenter. Disse egenskaber kan forringe fordøjelseseffektiviteten, den kromatografiske ydeevne, elektrospray-stabiliteten og peptididentifikationen. En forberedelsesproces til EV-proteomik skal derfor være kraftig nok til at nedbryde vesikelstrukturerne og opløse proteinerne, samtidig med at den forbliver kompatibel med den efterfølgende enzymatiske fordøjelse og LC-MS/MS-analysen.
I denne sammenhæng udgør ultralydsbehandling, der er kompatibel med mikroplader, en praktisk metode til reproducerbar, paralleliseret prøvebehandling. Hielschers mikroplade-sonikatorer, modellerne UIP400MTP (400 W) og UIP550MTP (550 W), er designet til sonikering af prøver i multiwell-plader og beholdere med lille volumen og understøtter arbejdsgange med højere gennemstrømning end konventionelle sonikatorer med en enkelt sonde. For proteomiklaboratorier er dette format attraktivt, fordi det kan reducere variationen i den manuelle håndtering, forbedre den parallelle behandling af flere prøver og integreres mere naturligt i pladebaserede prøveforberedelsesprocesser.

Eksempel på en arbejdsgang

En nylig proteomik-arbejdsgang med ekstracellulære vesikler inden for PLA2G12A-styret Th17-cellebiologi udgør et nyttigt, laboratorietestet eksempel på, hvordan mikroplade-sonikatoren UIP400MTP kan integreres i prøveforberedelsen til shotgun-proteomik. I denne undersøgelsesserie blev EV-prøver forberedt til proteomanalyse ved hjælp af metanolbehandling, UIP400MTP-sonikering, centrifugering, tørring, trypsin/Lys-C-fordøjelse samt nano-flow LC-tandem-MS med høj opløsning. Det samme biologiske arbejde blev først rapporteret som et bioRxiv-preprint og efterfølgende offentliggjort i *Cell Reports*, hvor proteomikanalysen bidrog til at karakterisere, hvordan PLA2G12A ændrer EV-lastproteiner i forbindelse med patogene T-celle-responser.

Multi-brønds plade soniker UIP400MTP

Hvorfor ultralydsbehandling af mikroplader?
UIP400MTP muliggør standardiseret, parallel ultralydsbehandling af prøver med lille volumen. Dette er nyttigt, når reproducerbarhed, små prøvemængder og høj gennemstrømning af flere prøver er vigtige faktorer.

Tjekliste for kvalitetskontrol

• Bekræft, at der er indført samme mængde EV-proteinekvivalenter i alle prøver.
• Anvend tilfældige eller afbalancerede layouts til stikprøvebehandling.
• Sørg for, at metanolvolumenet, ultralydsbehandlingstiden, tørretiden og nedbrydningsvolumenet holdes ens.
• Overvåg peptidudbyttet og identifikationen af det samlede proteinindhold.
• Kontroller andelen af ufuldstændige spaltninger og peptidlængdefordelingen.
• Undersøg kromatografiske toppers form og reproducerbarheden af retentionstiden.
• Indsæt tomme felter for at holde øje med overførsler.
• Brug samlede kvalitetskontrolprøver til større undersøgelser.
• Vurder variationskoefficienten for replikaterne.
• Brug PCA eller lignende metoder til at identificere batch-effekter eller afvigende prøver.

Anbefalinger vedrørende protokollering

Når denne arbejdsgang offentliggøres eller dokumenteres, skal følgende oplysninger angives: mængden af EV, pladeformat, metanolvolumen, amplitude og sonikeringstid for UIP400MTP, centrifugeringsbetingelser, tørringsmetode, fordøjelsesbuffer, enzymkoncentration, fordøjelsestid, forsuringbetingelser, LC-MS/MS-platformen, dataindsamlingsmodus, softwareversion, database, FDR-tærskel, normaliseringsmetode samt den statistiske arbejdsgang.
Alle Hielscher-mikropladesonikatorer registrerer automatisk vigtige procesparametre såsom amplitude, sonikeringsvarighed og temperatur med dato- og tidsstempel som en CSV-fil på det indbyggede SD-kort. Dataregistrering med henblik på reproducerbarhed og kvalitetskontrol har aldrig været nemmere!

En detaljeret gennemgang af undersøgelsen: Proteomik ved hjælp af EV-shotgun-metoden i PLA2G12A-undersøgelsen

PLA2G12A-undersøgelsen er et konkret eksempel på anvendelsen af UIP400MTP i en »shotgun«-proteomik-arbejdsgang. Det biologiske spørgsmål var, hvordan det udskilte fosfolipase PLA2G12A modificerer ekstracellulære vesikler fra Th17-celler og derved påvirker differentieringen af patogene T-celler. Forfatterne viste, at PLA2G12A virker på EV-membraner og danner lysophospholipider, herunder 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamin, og at den efterfølgende signalering af lysophosphatidsyre via LPA2 bidrager til Th17-differentieringen. Ud over lipidsignalering undersøgte studierne også EV-indholdet, herunder RNA- og proteinindhold, hvilket gjorde shotgun-proteomik til en vigtig del af karakteriseringsstrategien.
I arbejdsgangen til fremstilling af EV’er blev Th17-celler dyrket i et medium indeholdende føtal bovint serum, hvorfra eksosomer var fjernet. Kultur-supernatanterne blev først centrifugeret for at fjerne celler, filtreret gennem et 0,22 µm-filter, koncentreret ved ultrafiltrering/ultracentrifugering, vasket, resuspenderet i PBS og kvantificeret ved hjælp af en BCA-proteinanalyse. Denne indledende EV-forberedelse sikrede, at en defineret proteinækvivalent mængde EV-materiale kunne overføres til proteomik-arbejdsgangen.
Til shotgun-proteomanalysen anvendte forfatterne EV-prøver svarende til 5 µg proteinekvivalenter. Disse prøver blev tørret i PCR-rør, hvorefter der blev tilsat 25 µL methanol. Prøverne blev derefter sonikeret i 3 minutter ved hjælp af UIP400MTP-mikropladesonikatoren. Efter sonikeringen blev prøverne centrifugeret ved 4 °C i 20 minutter ved 19.000 × g. Efter fjernelse af 20 µL supernatant blev prøverne centrifugeret til tørhed. Proteinerne blev derefter opløst ved sonikering i 4 µL trypsin/Lys-C-opløsning ved 100 ng/µL i 50 mM ammoniumbicarbonat. Fordøjelsen blev udført i 2 timer ved 37 °C under omrystning ved 300 omdrejninger pr. minut. Fordøjelsesproduktet blev forsuret med 1 µL 1,25 % trifluoreddikesyre og underkastet nano-flow LC-højopløsnings-tandem-massespektrometri.
Denne arbejdsgang fremhæver flere nyttige principper for EV-proteomik med lavt input. For det første blev inputtet normaliseret efter proteinekvivalent, hvilket er vigtigt, når man sammenligner EV’er fra forskellige genotyper eller behandlinger. For det andet blev der anvendt methanol før sonikering, hvilket understøtter nedbrydning og ekstraktion, samtidig med at man undgår detergenter, der kan komplicere LC-MS/MS-analysen. For det tredje var sonikeringstrinnet kort og standardiseret, hvilket er foreneligt med parallel prøvebehandling. For det fjerde blev trypsin/Lys-C-fordøjelsen udført i et meget lille volumen, hvilket reducerede fortyndingen og understøttede peptidudvindingen ved lavt input. Endelig minimerede den direkte overgang fra fordøjelse til forsuring og LC-MS/MS unødvendige håndteringstrin.
Den efterfølgende LC-MS/MS-metode anvendte nano-flow-separation med omvendt fase koblet til et Q-Exactive HF Orbitrap-massespektrometer. Prøverne blev opfanget på en C18-forkolonne og derefter separeret på en analytisk kolonne med en indvendig diameter på 50 µm ved 200 nL/min og 40 °C. Gradienten løb fra lavt indhold af organisk opløsningsmiddel til 35 % opløsningsmiddel B over 60 minutter, efterfulgt af skylning med højt indhold af organisk opløsningsmiddel og re-ækvilibrering. MS-registrering blev udført i positiv-ion-tilstand ved hjælp af data-uafhængig registrering med højenergi-kollisionsdissociation. DIA-råfilerne blev analyseret ved hjælp af DIA-NN 1.8 med et in silico-forudsagt spektralbibliotek.