Sonikering i mikroplader til shotgun-proteomik – applikationsnote

Shotgun-proteomik afhænger af effektiv, reproducerbar prøveforberedelse for at omdanne komplekst biologisk materiale til peptider, der er klar til LC-MS/MS. Mikropladesonikatoren UIP400MTP understøtter denne proces ved at muliggøre standardiseret, parallel sonikering af prøver med små volumener og hjælper dermed laboratorier med at forbedre sønderdeling, ekstraktion og genopløsning i mikropladebaserede arbejdsgange. Denne applikationsnote beskriver, hvordan UIP400MTP kan integreres i proteomisk prøveforberedelse, med en publiceret arbejdsgang for ekstracellulære vesikler fra PLA2G12A/Th17-studier som et laboratorieafprøvet eksempel.

Sonikering i mikroplader til mere reproducerbar shotgun-proteomik

For forskere inden for proteomik er reproducerbar prøveforberedelse afgørende for data af høj kvalitet fra LC-MS/MS. Mikropladesonikatoren UIP400MTP understøtter standardiseret, parallel sonikering i pladebaserede arbejdsgange og arbejdsgange med små volumener og høj prøvekapacitet.

Den er især nyttig for laboratorier, der arbejder med:

• Store prøvesæt, der kræver ensartet behandling på tværs af mange brønde
• Materiale i begrænsede mængder, hvor prøvetab og variabilitet skal minimeres
• Lipidrige prøver, såsom ekstracellulære vesikler
• Komplekse biologiske præparationer, der kræver effektiv sønderdeling, ekstraktion eller genopløsning
• Komparativ shotgun-proteomik, hvor reproducerbarhed på tværs af betingelser og replikater er afgørende

Ved at integrere sonikering i mikroplader før spaltning kan forskere gøre prøverne bedre klar til:

• Proteinekstraktion og genopløsning
• Spaltning med trypsin/Lys-C
• Dataopsamling med Nano-LC/MS/MS
• Efterfølgende kvantitativ proteomikanalyse

Sonikering i mikroplader kan gavne:

• Proteomiske kernefaciliteter
• EV-forskningslaboratorier
• Immunologiske og cellebiologiske laboratorier
• Translationelle forskningsgrupper
• Biovidenskabelige teams, der opskalerer fra forberedelse af enkeltprøver til arbejdsgange med højere prøvekapacitet

Prøveforberedelse med høj prøvekapacitet til proteomanalyse af ekstracellulære vesikler

Hvad er shotgun-proteomik?

Shotgun-proteomik er blevet en central analytisk strategi til karakterisering af komplekse biologiske prøver, fra helcellelysater og vævsekstrakter til oprensede organeller, ekstracellulære vesikler og kliniske prøver i små mængder. Dens primære styrke ligger i kombinationen af proteinspaltning, højopløselig væskekromatografi-tandem-massespektrometri og computerbaseret udledning af proteiner ud fra peptider. Kvaliteten af det endelige proteomdatasæt bestemmes imidlertid længe før prøven når massespektrometeret. Effektiv sønderdeling af prøver, solubilisering af proteiner, fjernelse af interfererende stoffer, reproducerbar enzymatisk spaltning og robust genvinding af peptider er alle afgørende for dækningsdybden og den kvantitative pålidelighed.
For forskere inden for proteomik og biovidenskabelige laboratorier, der arbejder med begrænsede eller værdifulde prøver, er prøveforberedelsen ofte flaskehalsen.

Udfordringen med ekstracellulære vesikler i proteomik

Ekstracellulære vesikler (EVs) udgør eksempelvis en særlig krævende prøveklasse. De er membranbundne, lipidrige partikler i nanoskala med relativt lavt proteinudbytte og stort potentiale for medslæbning af lipider, salte, detergenter, serumproteiner og andre matrixkomponenter. Disse egenskaber kan forstyrre spaltningseffektiviteten, den kromatografiske ydeevne, elektrosprayens stabilitet og peptididentifikationen. En prøveforberedelsesarbejdsgang til proteomik af EV skal derfor være kraftig nok til at sønderdele vesikelstrukturer og solubilisere proteinindholdet, samtidig med at den forbliver kompatibel med efterfølgende enzymatisk spaltning og analyse med LC-MS/MS.
I denne sammenhæng tilbyder ultralydsbehandling, der er kompatibel med mikroplader, en praktisk tilgang til reproducerbar, paralleliseret prøvebehandling. Mikropladesonikatormodellerne UIP400MTP (400 W) og UIP550MTP (550 W) fra Hielscher er udviklet til sonikering af prøver i flerbrøndsplader og beholdere med små volumener og understøtter arbejdsgange med højere prøvekapacitet end konventionelle sonikatorer med en enkelt probe. For proteomiklaboratorier er dette format attraktivt, fordi det kan reducere variabilitet ved manuelt arbejde, forbedre parallel behandling af flere prøver og integreres mere naturligt i pladebaserede prøveforberedelsesforløb.

Eksempel på en arbejdsgang

En nyere proteomisk arbejdsgang for ekstracellulære vesikler inden for cellebiologi med Th17 drevet af PLA2G12A giver et nyttigt, laboratorieafprøvet eksempel på, hvordan mikropladesonikatoren UIP400MTP kan indgå i prøveforberedelse til shotgun-proteomik. I denne studieserie blev prøver af EV behandlet til proteomanalyse ved hjælp af methanolbehandling, sonikering med UIP400MTP, centrifugering, tørring, spaltning med trypsin/Lys-C og LC med nanoflow koblet til højopløselig tandem MS. Det biologiske arbejde blev publiceret i 2026 af Mochizuki-Ono og kolleger, hvor proteomikanalysen bidrog til at karakterisere, hvordan PLA2G12A ændrer proteinerne i indholdet af EV i forbindelse med patogene T-celleresponser.

Sonikator UIP400MTP til flerbrøndsplader

Hvorfor sonikering i mikroplader?
UIP400MTP muliggør standardiseret, parallel sonikering af prøver med små volumener. Dette er nyttigt, når reproducerbarhed, en lille prøveudgangsmængde og kapacitet til behandling af flere prøver er vigtige.


Tjekliste til kvalitetskontrol

• Bekræft samme proteinækvivalente EV-udgangsmængde for alle prøver.
• Brug randomiserede eller balancerede prøveplaceringer ved prøvebehandling.
• Hold methanolvolumen, sonikeringstid, tørretid og spaltningsvolumen ensartede.
• Overvåg peptidudbyttet og det samlede antal proteinidentifikationer.
• Kontrollér andelen af manglende spaltninger og peptidlængdefordelingen.
• Undersøg kromatografisk topform og retentionstidens reproducerbarhed.
• Medtag blankprøver for at overvåge medslæbning.
• Brug poolede QC-prøver til større studier.
• Vurdér variationskoefficienten for replikater.
• Brug PCA eller beslægtede metoder til at identificere batcheffekter eller afvigende prøver.

Anbefalinger til dokumentation

Ved publicering eller dokumentation af denne arbejdsgang skal du angive udgangsmængden af EV, pladeformatet, methanolvolumen, amplitude og sonikeringstid for UIP400MTP, centrifugeringsbetingelserne, tørremetoden, spaltningsbufferen, enzymkoncentrationen, spaltningstiden, forsuringsbetingelserne, platformen til LC-MS/MS, dataopsamlingsmetoden, softwareversionen, databasen, grænseværdien for FDR, normaliseringsmetoden og den statistiske arbejdsgang.
Alle mikropladesonikatorer fra Hielscher registrerer automatisk vigtige procesparametre såsom amplitude, sonikeringsvarighed og temperatur med dato- og tidsstempel som en fil i CVS på det integrerede SD-kort. Dataregistrering til reproducerbarhed og kvalitetskontrol har aldrig været nemmere!

Studiet i detaljer: EV-shotgun-proteomik i PLA2G12A-studiet

Studiet af PLA2G12A giver et konkret eksempel på brugen af UIP400MTP i en shotgun-proteomisk arbejdsgang. Det biologiske spørgsmål var, hvordan den secernerede fosfolipase PLA2G12A modificerer ekstracellulære vesikler fra Th17 og dermed påvirker patogen T-celledifferentiering. Forfatterne viste, at PLA2G12A virker på membranerne i EV og danner lysophospholipider, herunder 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, og at efterfølgende signalering med lysophosphatidinsyre via LPA2 bidrager til differentiering af Th17. Ud over lipidsignalering undersøgte studierne også indholdet af EV, herunder RNA og proteiner, hvilket gjorde shotgun-proteomik til en vigtig del af karakteriseringsstrategien.
I arbejdsgangen til forberedelse af EV blev Th17 dyrket i medium med føtalt bovint serum, hvorfra exosomer var fjernet. Kultursupernatanter blev først centrifugeret for at fjerne celler, filtreret gennem et filter på 0,22 µm, koncentreret ved ultrafiltrering/ultracentrifugering, vasket, resuspenderet i PBS og kvantificeret ved et proteinassay med BCA. Denne forudgående forberedelse af EV sikrede, at en defineret proteinækvivalent mængde materiale fra EV kunne indgå i den proteomiske arbejdsgang.
Til shotgun-proteomisk analyse brugte forfatterne prøver af EV svarende til 5 µg protein. Disse prøver blev tørret i rør til PCR, og 25 µL methanol blev tilsat. Prøverne blev derefter sonikeret i 3 minutter ved hjælp af mikropladesonikatoren UIP400MTP. Efter sonikering blev prøverne centrifugeret ved 4°C i 20 minutter ved 19.000 × g. Efter fjernelse af 20 µL supernatant blev prøverne centrifugeret til tørhed. Proteinerne blev derefter opløst ved sonikering i 4 µL opløsning af trypsin/Lys-C med en koncentration på 100 ng/µL i 50 mM ammoniumbicarbonat. Spaltningen blev udført i 2 timer ved 37°C med omrystning ved 300 rpm. Spaltningsproduktet blev forsuret med 1 µL 1,25% trifluoreddikesyre og analyseret ved LC med nanoflow koblet til højopløselig tandem-massespektrometri.
Denne arbejdsgang fremhæver flere nyttige principper for proteomik af EV med små udgangsmængder. For det første blev udgangsmængden normaliseret efter proteinækvivalent, hvilket er vigtigt ved sammenligning af EV fra forskellige genotyper eller behandlinger. For det andet blev methanol brugt før sonikering, hvilket understøttede sønderdeling og ekstraktion, samtidig med at detergentsystemer, som kan komplicere LC-MS/MS, blev undgået. For det tredje var sonikeringstrinnet kort og standardiseret, hvilket er kompatibelt med parallel prøvebehandling. For det fjerde blev spaltningen med trypsin/Lys-C udført i et meget lille volumen, hvilket reducerede fortyndingen og understøttede genvinding af peptider fra små udgangsmængder. Endelig minimerede den direkte overgang fra spaltning til forsuring og LC-MS/MS unødvendige håndteringstrin.
Den efterfølgende metode med LC-MS/MS anvendte omvendt fase-adskillelse med nanoflow koblet til et massespektrometer af typen Q-Exactive HF Orbitrap. Prøverne blev tilbageholdt på en forkolonne af typen C18 og derefter adskilt på en analytisk kolonne med en indvendig diameter på 50 µm ved 200 nL/min og 40°C. Gradienten gik fra et lavt indhold af organisk opløsningsmiddel til 35% opløsningsmiddel B over 60 minutter, efterfulgt af vask med et højt indhold af organisk opløsningsmiddel og reækvilibrering. Dataopsamling med MS blev udført i positiv iontilstand ved hjælp af datauafhængig dataopsamling med kollisionsinduceret dissociation ved højere energi. Råfiler fra DIA blev analyseret med DIA-NN 1.8 med et spektralbibliotek forudsagt in silico.