Ултразвукова солюбилизация на протеинови пелети

В протеомиката подготовката на пробите никога не е маловажен детайл. Тя е основата, върху която се изграждат точността на идентификацията, надеждността на количественото определяне и възпроизводимостта. Едно от най-устойчивите предизвикателства при подготовката на протеинови проби е ефективното повторно разтваряне на протеиновите пелети след етапи на преципитация или концентриране. Именно тук ултразвуковата солюбилизация на протеинови пелети придобива все по-голямо значение. Чрез прилагане на контролирана ултразвукова обработка лабораториите могат да подобрят извличането на протеините, да ускорят разтварянето на пелетите и да подготвят пробите по-ефективно за последваща масспектрометрия и биохимичен анализ.

Солюбилизация на протеини: защо ултразвуковата обработка е важна в съвременната протеомика

Протеиновите пелети често се образуват при преципитация с ацетон, етанол, метанол–хлороформ, амониев сулфат или TCA. Тези работни процеси се използват широко за отстраняване на замърсители, концентриране на протеини и пречистване на екстракти преди анализ. След приключване на преципитацията обаче получената пелета може да се солюбилизира повторно трудно. Плътните агрегати, хидрофобните домени, протеините, свързани с мембрани, и протеиновите комплекси със силни взаимодействия често не се повлияват от обичайното смесване или разбъркването с вортекс. Непълната солюбилизация може впоследствие да доведе до загуба на проба, изкривено представяне на протеините и ниска възпроизводимост между експериментите.
Ултразвуковата обработка преодолява именно това затруднение. Чрез генериране на механична енергия в течна среда тя разрушава компактните структури на пелетите, подпомага проникването на буфера и диспергира агрегирания материал в разтвора. Резултатът е по-бързо и често по-пълно възстановяване на протеините в разтвор, което е особено ценно при работа с ограничени количества проби, сложни лизати или трудни за анализ протеомни мишени.

Защо протеиновите пелети се солюбилизират трудно

Преципитацията на протеини е ефективна, защото ги принуждава да излязат от разтвора. Същият процес, който прави преципитацията полезна, обаче създава и проблема с възстановяването на протеините от пелетата. След образуването на пелета протеините могат да станат плътно опаковани и частично денатурирани. Хидрофобните взаимодействия могат да се засилят, междумолекулното свързване може да се увеличи, а някои протеини могат да задържат соли, липиди, нуклеинови киселини или други компоненти на матрицата. Дори когато се използва буфер със силно солюбилизиращо действие, пасивното ресуспендиране често е бавно и непълно.
В протеомиката това е важно, защото непълното разтваряне на пелетата не само намалява общия добив. То може избирателно да изключи определени класове протеини, особено мембранни протеини, структурни протеини или видове, склонни към агрегация. Това означава, че крайният аналитичен резултат може вече да не отразява истинския състав на първоначалната проба. В протеомиката с висока разделителна способност, където малки разлики в количеството или посттранслационната модификация могат да бъдат биологично решаващи, подобно изкривяване вследствие на подготовката е сериозно ограничение.

Как ултразвуковата обработка подобрява солюбилизацията на протеинови пелети

Ултразвуковата обработка подобрява солюбилизацията чрез въвеждане на високочестотна механична енергия в пробата. Тази енергия помага за раздробяването на компактния материал на пелетата и увеличава контакта между солюбилизиращия буфер и включените в нея протеини. Вместо да разчита само на дифузия и ръчно смесване, процесът активно диспергира пелетата на по-малки фракции, които се разтварят по-лесно.

Практическият ефект е значителен. Ултразвуковата обработка може да:

• ускори разтварянето на плътни или трудноразтворими протеинови пелети
• подобри извличането на слаборазтворими и агрегирани протеини
• намали времето за подготовка в протеомните работни процеси
• подпомогне получаването на по-хомогенни проби за разграждане и анализ

Това подобрено диспергиране е особено полезно, когато пелетите се ресуспендират в буфери, съдържащи урея, тиоурея, детергенти, хаотропни агенти или други реагенти, често използвани в протеомиката. Ултразвуковата обработка помага на тези компоненти да достигнат до пелетата и да я солюбилизират по-ефективно, което води до по-еднороден разтвор на пробата.

Предимства на ултразвуковата солюбилизация в протеомиката

Основното предимство на ултразвуковата солюбилизация е, че превръща един често подценяван етап от подготовката в контролируем и ефективен процес. В протеомиката това има преки последици за анализа.

1. Първо, подобрената солюбилизация увеличава вероятността пробата, постъпваща за ензимно разграждане, да е представителна за цялата протеинова популация. Разграждането с трипсин например зависи от това протеините да са достатъчно разгънати и достъпни в разтвора. Ако части от пелетата останат неразтворени, тези протеини на практика се изключват от образуването на пептиди и следователно от откриването.
2. Второ, ултразвуковата обработка може да подобри възпроизводимостта. Ръчното ресуспендиране на пелети по своята същност е променливо, особено когато участват различни оператори, различни размери на пелетите или различни матрици на пробите. Контролираната ултразвукова обработка стандартизира физическата енергия, приложена към пробата, което може да намали вариабилността между отделните подготовки и да подобри постоянството на резултатите в последващите работни процеси с LC-MS или гелови методи.
3. Трето, ултразвуковата обработка е изключително ценна за проби с малко начално количество материал и за ценни проби. Клиничната протеомика, откриването на биомаркери, експериментите с клетъчни култури и изследванията на тъкани често разчитат на ограничено количество материал. Всяка загуба на протеини по време на солюбилизацията намалява информационната стойност на пробата. Ефективното ултразвуково повторно разтваряне помага да се запази възможно най-голямо количество аналит.
4. Накрая, ултразвуковата обработка подпомага бързината на работния процес. Протеомните лаборатории, които обработват множество проби, се нуждаят от надеждни методи за подготовка, които спестяват време. Пелета, която се разтваря бързо и напълно, не е просто удобство; тя намалява забавянията, понижава риска от грешки при боравене и увеличава капацитета за обработка на проби.

Ултразвукова обработка спрямо конвенционалните методи за ресуспендиране

Традиционните методи за ресуспендиране на пелети обикновено включват пипетиране, разбъркване, разбъркване с вортекс, продължителна инкубация или многократни етапи на нагряване. Въпреки че тези техники могат да работят при слабо уплътнени пелети, те често срещат затруднения при силно компактен или хидрофобен протеинов материал. Само механичното смесване може да не успее да разруши напълно структурата на пелетата, оставяйки видими частици или невидими неразтворими фракции.
Ултразвуковата обработка осигурява по-активен и целенасочен подход. Вместо да зависи от бавната дифузия на буфера, тя физически разрушава пелетата и подпомага бързото хомогенизиране. Това не премахва необходимостта от подходящ буфер за ресуспендиране, но значително подобрява действието му.
В сравнение с изцяло ръчните методи ултразвуковата солюбилизация често предлага по-добър контрол на процеса, по-голяма ефективност и по-добра пригодност за взискателни протеомни приложения. За лабораториите, които търсят едновременно качество на анализа и оперативна надеждност, това прави ултразвуковата обработка убедителен избор.

Най-подходящи приложения на ултразвуковата солюбилизация на протеинови пелети

Ултразвуковата солюбилизация е особено полезна в работни процеси, включващи:

• преципитация на протеини преди масспектрометрия,
• повторно разтваряне на пелети от клетъчни лизати или тъканни екстракти,
• извличане на богати на мембрани или склонни към агрегация протеини,
• и подготовка на проби за количествена протеомика, при която възпроизводимостта е от съществено значение.

Тя е изключително подходяща и когато пелетите са били съхранявани, прекомерно изсушени или получени от сложни биологични матрици. В такива случаи пасивното ресуспендиране може да стане особено неефективно, докато ултразвуковата обработка помага да се възстанови пригодността на пробата за употреба с по-малко ръчна намеса.

Намерете най-добрия ултразвуков апарат за вашия работен процес за солюбилизация на протеини!

За лабораториите, работещи с ценни проби, малко начално количество материал или протеомика с висок капацитет за обработка на проби, продуктовото портфолио на Hielscher предлага няколко формата на ултразвукова обработка, които могат да бъдат съобразени точно с работния процес.
Независимо дали ще изберете ултразвуков апарат със сонда на Hielscher, ултразвуковия апарат за множество епруветки VialTweeter или ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP – всеки модел ултразвуков апарат е предназначен за различен сценарий на подготовка на проби, като споделя едно и също основно предимство: възпроизводима ултразвукова енергия за ефективна и контролирана обработка на проби.

Ултразвукови апарати със сонда

Ултразвуковите сонди като UP200Ht са особено подходящи за директна ултразвукова обработка на отделни проби. За протеомните лаборатории UP200Ht е отличен избор, когато протеиновите пелети се нуждаят от интензивно ресуспендиране в малки до средни обеми, особено когато контролът на метода и повторяемостта са важни. Директната ултразвукова обработка със сонда може бързо да разруши компактния материал на пелетата и да помогне на солюбилизиращите буфери да достигнат до протеини, които иначе биха останали частично неразтворени.
Преглед на всички ултразвукови апарати със сонда!
 
 
 

Ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter

Когато множество затворени флакони трябва да се обработват при идентични условия, ултразвуковият апарат за множество епруветки VialTweeter предлага ясно изразено предимство. VialTweeter позволява интензивна ултразвукова обработка на малки обеми, като обработва няколко затворени флакона при стерилни условия. Едновременната подготовка на проби в множество епруветки при едни и същи условия, както и намаленият риск от кръстосано замърсяване, загуба на проба и образуване на аерозоли при обработка в затворени флакони, правят VialTweeter надежден инструмент за подготовка на проби. В протеомиката това е изключително важно при работа с ценни пелети от множество повторения или клинични проби, при които еднаквите условия между епруветките са от критично значение.
Научете повече за VialTweeter!

Ултразвуков апарат за микроплаки UIP400MTP

За лабораториите с висок капацитет за обработка на проби ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP разширява ползите от ултразвуковата обработка към работни процеси с плаки. UIP400MTP е ултразвуков апарат за микроплаки и многоямкови плаки за равномерна ултразвукова обработка на стандартни плаки, включително формати с 96 ямки, като се подчертава пригодността му за автоматизирана подготовка на проби в области като протеомиката, диагностиката и откриването на лекарства. Платформата е проектирана за едновременна обработка на множество проби, с предимства като намален риск от кръстосано замърсяване, по-ниска трудоемкост, подобрено извличане на пробите и интегриране в автоматизирани работни процеси.
В практическата протеомика това означава, че солюбилизацията на пелети, клетъчният лизис, екстракцията и свързаните с тях етапи на подготовка могат да бъдат мащабирани много по-ефективно. Вместо да обработват пробите една по една, лабораториите могат да обработват с ултразвук цели плаки с еднакво количество внесена енергия. Това е ценно винаги когато работните процеси трябва да съчетават капацитета за обработка на проби със строгостта на анализа, например при скринингови изследвания, количествена протеомика или стандартизирани последователности за подготовка на проби. Следователно UIP400MTP не е просто инструмент за удобство; той е платформа, която подкрепя по-широката тенденция към автоматизация, възпроизводимост и надеждна протеомика с висок капацитет за обработка на проби.
Научете повече за ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP!

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре познати с най-високите си стандарти за качество и проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати, които се отличават с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Литература / Източници

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.