Ултразвуково разтваряне на протеинови гранули
В протеомиката подготовката на пробите никога не е маловажен детайл. То е основата, върху която се изграждат точността на идентификацията, надеждността на количественото определяне и възпроизводимостта. Едно от най-постоянните предизвикателства при подготовката на протеинови проби е ефективното повторно разтваряне на протеинови пелети след утаяване или концентриране. Тук все по-голямо значение придобива ултразвуковото разтваряне на протеинови пелети. Чрез прилагане на контролирана соникация лабораториите могат да подобрят възстановяването на протеините, да ускорят разтварянето на пелетите и да подготвят по-ефективно пробите за последващ масспектрометричен и биохимичен анализ.
Разтваряне на протеини: Защо соникацията е от значение за съвременната протеомика
При утаяване с ацетон, етанол, метанол-хлороформ, амониев сулфат или TCA често се образуват протеинови топчета. Тези работни процеси се използват широко за отстраняване на замърсители, концентриране на протеини и пречистване на екстракти преди анализ. Въпреки това, след като утаяването приключи, получената пелета може да се окаже трудна за повторно разтваряне. Плътните агрегати, хидрофобните домени, мембранно асоциираните протеини и силно взаимодействащите протеинови комплекси често се противопоставят на конвенционалното смесване или вихровото разбъркване. Непълното разтваряне може да доведе до загуба на пробата, неточно представяне на протеините и лоша възпроизводимост при различните експерименти.
Соникацията се справя точно с това препятствие. Чрез генериране на механична енергия в течна среда соникацията разрушава компактните структури на пелетите, подпомага проникването на буфера и разпръсква агрегирания материал в разтвора. Резултатът е по-бързо и често по-пълно възстановяване на протеините, което е особено ценно при работа с ограничени проби, сложни лизати или предизвикателни протеомни цели.
Микроплачен ултразвуков UIP400MTP за екстракция на протеини и разтваряне на пелети
Защо протеиновите гранули са трудни за разтваряне
Утаяването на белтъците е ефективно, защото изтласква белтъците от разтвора. Същият процес обаче, който прави утаяването полезно, създава и проблем с възстановяването на гранулите. Веднъж утаени, протеините могат да станат плътно опаковани и частично денатурирани. Хидрофобните взаимодействия могат да се засилят, междумолекулното свързване може да се увеличи, а някои протеини могат да задържат соли, липиди, нуклеинови киселини или други компоненти на матрицата. Дори когато се използва силен буфер за разтваряне, пасивната ресуспензия често е бавна и непълна.
В протеомиката това е от значение, тъй като непълното разтваряне на пелетите не само намалява общия добив. То може селективно да изключи определени класове протеини, особено мембранни протеини, структурни протеини или видове, склонни към агрегация. Това означава, че крайният аналитичен резултат може вече да не отразява истинския състав на оригиналната проба. В протеомиката с висока разделителна способност, където фините разлики в количеството или посттранслационната модификация могат да бъдат биологично решаващи, подобно отклонение при подготовката е сериозно ограничение.
Как соникацията подобрява разтварянето на протеинови гранули
Ултразвуковата обработка подобрява разтварянето чрез въвеждане на високочестотна механична енергия в пробата. Тази енергия спомага за разкъсването на компактния материал на гранули и увеличава контакта между буфера за разтваряне и вградените протеини. Вместо да се разчита само на дифузия и ръчно смесване, процесът активно разпръсква пелетите на по-малки фракции, които са по-лесни за разтваряне.
Практическият ефект е значителен. Соникацията може да:
- ускоряване на разтварянето на плътни или упорити протеинови гранули
- подобряване на възстановяването на слаборазтворими и агрегирани протеини
- съкращаване на времето за подготовка в работните процеси на протеомиката
- поддържат по-хомогенни проби за разграждане и анализ.
Тази подобрена дисперсия е особено полезна, когато пелетите се ресуспендират в буфери, съдържащи карбамид, тиокарбамид, детергенти, хаотропи или други реагенти, които обикновено се използват в протеомиката. Соникацията помага на тези компоненти да достигнат до пелетите и да ги разтворят по-ефективно, което води до по-равномерен разтвор на пробата.
Предимства на ултразвуковото разтваряне в протеомиката
Основното предимство на ултразвуковото разтваряне е, че то превръща често подценяваната стъпка на подготовка в контролируем и ефективен процес. В протеомиката това има преки аналитични последици.
- Първо, подобреното разтваряне увеличава вероятността пробата, която влиза в ензимно разграждане, да е представителна за цялата популация от протеини. Трипсиновото разграждане, например, зависи от това дали протеините са адекватно разгънати и достъпни в разтвора. Ако части от пелетата останат неразтворени, тези протеини са ефективно изключени от генерирането на пептиди и следователно от откриването.
- Второ, сонирането може да подобри възпроизводимостта. Ръчното ресуспендиране на пелети е изначално променливо, особено когато се използват различни оператори, размери на пелетите или матрици на пробите. Контролираното ултразвуково третиране стандартизира физическата енергия, прилагана към пробата, което може да намали променливостта между препаратите и да подобри съгласуваността на работните процеси надолу по веригата, базирани на LC-MS или гел.
- Трето, ултразвуковото обработване е изключително ценно за скъпоценни проби с нисък разход. Клиничната протеомика, откриването на биомаркери, експериментите с клетъчни култури и тъканните изследвания често разчитат на ограничен материал. Всяка загуба на протеини по време на разтварянето намалява информационната стойност на пробата. Ефективното повторно разтваряне с ултразвук помага да се запази възможно най-много аналит.
- И накрая, сонирането подпомага скоростта на работния процес. Лабораториите по протеомика, които обработват множество проби, се нуждаят от надеждни и ефективни във времето методи за подготовка. Пелети, които се разтварят бързо и напълно, са не просто удобни; те намаляват забавянията, понижават риска от грешки при работа и подобряват производителността.
Соникация срещу конвенционални методи за ресуспендиране
Традиционните методи за ресуспендиране на пелети обикновено включват пипетиране, разбъркване, разбъркване с вихри, продължителна инкубация или повтарящи се стъпки на загряване. Въпреки че тези техники могат да работят за свободно опаковани пелети, те често се затрудняват при силно уплътнени или хидрофобни протеинови материали. Само механичното смесване може да не успее да разпадне напълно структурата на пелетите, оставяйки видими частици или невидими неразтворими фракции.
Соникацията осигурява по-активен и целенасочен подход. Вместо да разчита на бавната дифузия на буфера, тя физически разрушава пелетите и насърчава бързата хомогенизация. Това не елиминира необходимостта от подходящ буфер за ресуспендиране, но значително подобрява ефективността на този буфер.
В сравнение с чисто ръчните методи, ултразвуковото разтваряне често предлага по-добър контрол на процеса, по-голяма ефективност и по-добра пригодност за взискателни приложения в областта на протеомиката. За лабораториите, които се стремят към аналитично качество и оперативна надеждност, това прави сондирането убедителен избор.
Най-добри случаи на употреба за ултразвуково разтваряне на протеинови гранули
Ултразвуковото разтваряне е особено полезно при работни процеси, включващи:
- утаяване на протеини преди масспектрометрия,
- възстановяване на пелети от клетъчни лизати или тъканни екстракти,
- възстановяване на богати на мембрани или склонни към агрегация протеини,
- и подготовка на пробите за количествена протеомика, където възпроизводимостта е от съществено значение.
Той е от голямо значение и когато пелетите са били съхранявани, изсушавани твърде силно или са произведени от сложни биологични матрици. В такива случаи пасивното ресуспендиране може да стане особено неефективно, докато сонирането помага да се възстанови използваемостта на пробите с по-малко ръчна намеса.
Ултразвуков уред VialTweeter за едновременна соникация на 10 проби, например за екстракция и разтваряне на протеини
Намерете най-добрия соникатор за вашия работен процес на разтваряне на протеини!
За лабораториите, работещи с ценни проби, материали с ниска производителност или високопроизводителна протеомика, портфолиото на Hielscher предлага няколко формата за сониране, които могат да бъдат съчетани точно с работния процес.
Независимо дали ще изберете сонатор тип сонда на Hielscher, сонатор за много тръби VialTweeter или сонатор за микроплатки UIP400MTP – Всеки модел ултразвуков апарат е предназначен за различен сценарий за подготовка на проби, като споделя едно и също основно предимство: възпроизводима ултразвукова енергия за ефективна и контролирана обработка на проби.
Сондови соникатори
Ултразвуковите сонди, като UP200Ht, са особено подходящи за директно сониране на отделни проби. За лабораториите по протеомика UP200Ht е добър избор, когато протеиновите пелети се нуждаят от интензивно ресуспендиране в малки до средни обеми, особено когато контролът и повторяемостта на метода са важни. Директната сонизация на сондата може бързо да разруши компактния материал на пелетите и да помогне на буферите за разтваряне да получат достъп до протеини, които иначе биха останали частично неразтворени.
Преглед на всички сондажни сонатори!
Многотръбен соникатор за високи честоти VialTweeter
Когато множество затворени флакони трябва да се обработват при еднакви условия, многотръбният соникатор VialTweeter предлага явно предимство. VialTweeter позволява интензивно сониране на малки обеми, като сонира няколко затворени флакона при стерилни условия. Едновременното приготвяне на пробата в няколко епруветки при едни и същи условия, както и намаленият риск от кръстосано замърсяване, загуба на проба и образуване на аерозол по време на обработката на затворени флакони правят сонатора VialTweeter надежден инструмент за приготвяне на проби. За протеомиката това е от голямо значение, когато се обработват ценни гранули от множество повторения или клинични проби, където последователността между епруветките е от решаващо значение.
Научете повече за VialTweeter!
Микроплачен ултразвуков UIP400MTP
За лабораториите с висока производителност сонаторът за микроплаки UIP400MTP разширява предимствата на сонирането в работните процеси, базирани на плаки. UIP400MTP като сонатор за микроплаки и многоямкови плаки за равномерна ултразвукова обработка на стандартни плаки, включително 96-ямкови формати, и подчертава пригодността му за автоматизирано приготвяне на проби в области като протеомика, диагностика и откриване на лекарства. Платформата е проектирана за едновременна обработка на много проби, с предимства като намален риск от кръстосано замърсяване, по-ниска трудоемкост, подобрено възстановяване на пробите и интегриране в автоматизирани работни процеси.
В практическата протеомика това означава, че разтварянето на пелетите, клетъчният лизис, екстракцията и свързаните с тях етапи на подготовка могат да се мащабират много по-ефективно. Вместо да обработват пробите една по една, лабораториите могат да сонират цели плаки с постоянна входяща енергия. Това е ценно винаги, когато работните потоци трябва да съчетават производителност с аналитична строгост, например при скринингови изследвания, количествена протеомика или стандартизирани конвейери за подготовка на проби. Следователно UIP400MTP не е просто удобен инструмент; той е платформа, която подкрепя по-широката тенденция към автоматизация, възпроизводимост и надеждна високопроизводителна протеомика.
Научете повече за соникатора за микроплаки UIP400MTP!
VialTweeter в хладилна камера – контролирани параметри на процеса по време на сонирането.
Високопроизводително извличане и разтваряне на протеини със соникатора за микроплаки UIP400MTP
Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Литература / Препратки
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Често задавани въпроси
Защо ултразвуковите вани не са подходящи за разтваряне на протеини?
В ултразвуковите вани кавитацията, която е принципът на работа на соникацията, се проявява много неравномерно, като пробите се подлагат на различни сонажни обработки. В зависимост от позицията на епруветките с пробите в ултразвуковата вана всяка проба е подложена на въздействие с различна интензивност. Протеомиката зависи от сравнимостта. Ако една пелета е непълно разтворена, докато друга е напълно ресуспендирана, получените данни могат да отразяват по-скоро предубеденост при подготовката, отколкото истинска биология. За разлика от ултразвуковите вани, безконтактните соникатори, като например VialTweeter или соникаторът за микроплатки UIP400MTP, подпомагат по-стандартизираната обработка, като позволяват няколко проби да се обработват паралелно при съответстващи ултразвукови условия, което може да помогне за подобряване на възпроизводимостта при експериментите. Това е особено полезно при изследвания на биомаркери, сравнителна протеомика и работни процеси с множество биологични или технически повторения.
Кои са най-често използваните анализи в протеомиката?
Най-често срещаните анализи в протеомиката са анализите за количествено определяне на протеини и методите за характеризиране на протеини, използвани по време на подготовката и анализа на пробите. Често използваните анализи включват анализ на Брадфорд, BCA анализ, анализ на Лоури и UV абсорбция при 280 nm за измерване на концентрацията на протеините. В по-широките работни потоци на протеомиката широко се използват и SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, ин-гел разграждане и анализи, базирани на масспектрометрия, за оценка на количеството, чистотата, молекулното тегло и идентичността на протеините.
Какво представлява Coomassie Brilliant Blue?
Coomassie Brilliant Blue е трифенилметаново багрило, широко използвано в протеинознанието за оцветяване на протеини в гелове и за колориметрично количествено определяне на протеини. То се свързва предимно с основни и ароматни аминокиселинни остатъци, особено с аргинин, и претърпява спектрална промяна при свързване с протеини. Това свойство го прави полезен както за визуализиране на протеини след електрофореза, така и за протеиновия анализ на Брадфорд.
Как работи анализът на Брадфорд?
Тестът на Брадфорд работи чрез смесване на протеинова проба с багрилото Coomassie Brilliant Blue при киселинни условия. Когато багрилото се свърже с протеините, максимумът на абсорбцията му се измества от около 465 nm на 595 nm, което води до измерима промяна на цвета от червеникаво-кафяв в син. Увеличението на абсорбцията при 595 nm е пропорционално на концентрацията на протеина в определен диапазон, което позволява количествено определяне чрез сравняване със стандартна крива, обикновено изготвена с говежди серумен албумин.
Фокусирано сониране на проби в многокамерни плаки
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.