Ултразвукова екстракция на протеини от тъкани и клетъчни култури
- Екстракцията на протеини е съществен етап от подготовката на проби в протеомиката.
- Протеини могат да се извличат от растителни и животински тъкани, дрожди и микроорганизми.
- Ултразвуковата обработка е надежден и ефективен метод за екстракция на протеини, който осигурява високи добиви на протеини за кратко време на екстракция.
Екстракция на протеини от тъкани и клетки
Екстракцията на протеини от тъкани и култивирани клетки е съществен етап от подготовката на проби, който се извършва при много биохимични и аналитични техники, като ELISA, PAGE, уестърн блотинг, масспектрометрия или пречистване на протеини. Ултразвуковото разрушаване на клетките, лизисът и екстракцията представляват прецизно контролируема, нетермична техника за осигуряване на високи добиви на протеини.
Екстракция на протеини от клетки с ултразвуковата сонда UP200St
- Бързина
- Високи добиви
- Висока ефективност
- Прецизен контрол на параметрите
- Възпроизводими резултати
- Линейна мащабируемост
Общи указания за ултразвуков лизис и екстракция на протеини
- Контрол на температурата: За да се осигури висок добив на протеини без термична денатурация, температурата по време на екстракцията трябва да се контролира. Съвременните ултразвукови хомогенизатори на Hielscher – наричани също ултразвукови дезинтегратори или ултразвукови апарати – позволяват прецизен контрол. Те се доставят с включваем температурен сензор. В настройките на ултразвуковия хомогенизатор може да се зададе максимална температура. Когато тази максимална температура бъде достигната, ултразвуковият апарат спира автоматично, докато пробата се охлади.
- Буфер: Изборът на подходящ буфер и правилния обем буфер зависи от вида на тъканта и трябва да се определи чрез изпитвания по метода на пробите и грешките.
- Изолиране / пречистване: Протеиновите лизати могат да съдържат излишък от биомолекули, като ДНК или въглехидрати, които могат да бъдат отстранени чрез преципитация на протеините (деоксихолат–трихлороцетна киселина) или смяна на буфера.
Chittapalo и Noomhorm (2009) съобщават в своето изследване, че добивът на протеини се увеличава при използване на ултразвукова обработка и че процесът на ултразвукова хомогенизация и лизис на тъкани може значително да подобри съществуващите процеси на екстракция – като създава нови възможности за екстракция в промишлен мащаб.
Ултразвуков CupHorn за едновременна, високоефективна подготовка на множество проби при еднакви условия за изолиране на протеини и фрагментация на ДНК.
Екстракция на протеини от животински тъкани
За подготовката на тъкани в цялостен вид (напр. бъбрек, сърце, бял дроб, мускул и др.) тъканта трябва да се нареже на много малки парчета с чисти инструменти, за предпочитане върху лед и възможно най-бързо, за да се предотврати разграждането от протеази (напр. лизисен буфер като RIPA или хипотоничен лизисен буфер, съдържащ смес от инхибитори на протеази и фосфатази). След нарязването пробата се потапя в течен азот за бързо замразяване. Пробата може да се съхранява при -80°C за по-късна употреба или да се държи върху лед за незабавна хомогенизация. Непосредствено преди ултразвуковата екстракция в епруветката с пробата бързо се добавя ледено студен лизисен буфер (с протеазните инхибитори DTT, леупептин и апротинин) (за ~10 mg тъкан се препоръчват приблизително ~600 μL буфер). Препоръчват се приблизително 20–60mg тъкан на епруветка с проба.
Ултразвуковата хомогенизация, лизисът и екстракцията се извършват с ултразвуков хомогенизатор, като UP100H или UP200Ht, оборудван със сонотрод с микровръх. Продължителността на ултразвуковата обработка е 60–90 сек. при цикличен ултразвуков режим с 15 сек. ултразвукова обработка и 10 сек. пауза. Пробата трябва да се държи в лед през цялото време.
След ултразвуковата хомогенизация / екстракция лизатът се центрофугира при 27 000g за приблизително 20 мин. След това се събира супернатантът, за да може концентрацията на протеини да се определи чрез анализ за протеини, като BCA анализа за протеини на Pierce.
Екстракция на протеини от кръвен серум
За получаване на хомогенна смес от серума и фосфатния буфер пробата първо се смесва на вортекс преди ултразвуковия клетъчен лизис. За ултразвуковия лизис пробата се обработва с ултразвуков лабораторен хомогенизатор, като UP100H, в продължение на 8 цикъла при 20% амплитуда, като всеки цикъл включва 5 секунди работа и 15 секунди пауза. Екстракцията на протеини се извършва чрез ултразвукова обработка на цикли (пулсационен режим) и поставяне на пробата върху лед, за да се избегнат прегряване и термично разграждане на пробата. Тъй като серумът съдържа голямо количество протеини с висока молекулна маса (като албумин, α1-antitrypsin, трансферин, хаптоглобулин, имуноглобулин G и имуноглобулин A), които пречат на разделянето на протеините с ниска молекулна маса по време на IEF, се препоръчва те да бъдат отстранени от серума с помощта на колона за отстраняване на тези протеини.
Екстракция на протеини от растителни тъкани
Пресни, меки растителни тъкани, напр. мъх и др., могат лесно да бъдат разрушени чрез просто поставяне на нарязания материал на пробата в лизисен буфер за ултразвукова обработка. Жилави, вдървесинени растителни тъкани, като семена, елхови иглички и др., трябва да се смилат в сухо състояние. Някои твърди, вдървесинени растителни материали трябва да се замразят и смелят в течен азот преди екстракцията чрез ултразвукова обработка. За суспензии на растителни клетъчни култури обикновено е достатъчна ултразвукова обработка между 30 и 150 секунди в лизисен буфер. По-устойчиви материали, като тиквени семки, изискват по-интензивна ултразвукова обработка, както е описано по-долу.
Протокол за ултразвукова екстракция на албумин от тиквени семки
За ултразвуковата екстракция на протеина албумин от фино смлени тиквени семки на прах в стъклена лабораторна чаша с обем 250mL се добавят 10 g обезмаслени тиквени семки на прах и 100 mL дейонизирана вода като разтворител. Екстракцията на протеини се състои от два етапа: първо пробата се подлага на ултразвукова обработка с ултразвуков апарат със сонда UP400St (400W, 24kHz), оборудван със сонотрод S24d7. Стъклената лабораторна чаша се поставя в студена водна баня по време на ултразвуковата хомогенизация. Включваемият температурен сензор и настройките за контрол на температурата на ултразвуковия апарат UP400St гарантират, че температурата на пробата винаги се поддържа под 30°C. Прецизният контрол на температурата по време на ултразвуковата обработка предотвратява денатурацията на албумина. На втория етап екстракцията се извършва със смесител при скорост 200 rpm и при 30°C. След това лабораторната чаша се прехвърля в термостатичен шейкър. Глобулинът се отстранява чрез диализа с дестилирана вода. След отстраняването на глобулина от протеиновия екстракт може да се вземе проба за определяне на албуминовия профил, след което екстрактът се довежда до pI=3,0 с помощта на 0,1 M HCl за коагулация на албумина. Твърдата фаза се отделя чрез центрофугиране при 5000g, 20°C и се разтваря отново в дейонизирана вода. Коагулацията на албумина се извършва два пъти, за да се увеличи делът на протеините в албуминовия концентрат.
Ултразвуковата алкална екстракция на протеини за получаване на протеинов концентрат от оризови трици показва, че ултразвуковата обработка води до по-висок добив на протеини за значително по-кратко време на екстракция – в сравнение с конвенционалните методи за екстракция.
Протокол за подготовка на проби за функционален ензим iNOS
За получаване на напълно функционален ензим iNOS (напр. за скрининг на лекарствени вещества) се препоръчва следният протокол: клетъчната суспензия трябва да се постави върху лед и да се обработи с ултразвук с UP100H при амплитуда 10µm в цикличен режим с 5 сек. ултразвукова обработка и 25 сек. пауза върху лед. Процедурата трябва да се повтори приблизително 3 пъти. Паузата между циклите на ултразвукова обработка намалява повишаването на температурата и следователно ще намали риска от денатурация.
Ултразвукова солюбилизация на протеини
Ултразвуковата обработка може да ускори процеса на солюбилизация на протеините, който обикновено изисква няколко часа. За да не се прегрява пробата и да се предотвратят разграждането и модификациите на протеините в разтвори, съдържащи урея, ултразвуковите импулси не трябва да продължават повече от няколко секунди.
Ултразвуков апарат UP200Ht с микровръх S26d2 с размер 2mm за ултразвукова обработка на малки проби.
Ултразвуково оборудване за екстракция на протеини
Hielscher Ultrasonics предлага широка гама ултразвукови хомогенизатори за разрушаване на клетки, тъкани, бактерии, микроорганизми, дрожди и спори.
Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher са мощни и лесни за работа. Създадени за работа 24/7, те са проектирани като здрави и ефективни лабораторни и настолни устройства. При всички устройства подаваната енергия и амплитудата могат да се контролират прецизно. Широката гама аксесоари предоставя допълнителни възможности за конфигуриране. Цифровите ултразвукови апарати, като VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St, имат вграден контрол на температурата и вградена SD карта за автоматично записване на данни.
За непряка, едновременна ултразвукова обработка на множество проби без кръстосано замърсяване предлагаме VialTweeter или ултразвуковия CupHorn.
Таблицата по-долу предоставя общ преглед на нашите ултразвукови апарати за подготовка на проби, разрушаване на клетките и екстракция. Щракнете върху типа устройство, за да получите повече информация за всеки ултразвуков хомогенизатор. Нашият добре обучен технически персонал с дългогодишен опит с удоволствие ще ви помогне да изберете най-подходящия ултразвуков апарат за подготовката на вашите проби!
| Обем на партидата | Дебит | Препоръчителни устройства |
|---|---|---|
| до 10 флакона или епруветки | n.a. | VialTweeter |
| многоямкови / микротитърни плаки | n.a. | UIP400MTP |
| множество епруветки / съдове | n.a. | CupHorn |
| от 1 до 500mL | от 10 до 200mL/min | UP100H |
| от 10 до 1000mL | от 20 до 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| от 10 до 2000mL | от 20 до 400mL/min | UP400St |
В зависимост от вашето приложение, материала и обема на пробата ще ви препоръчаме най-подходящата конфигурация за подготовката на вашите проби. Свържете се с нас още днес!
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher разполагат с дистанционно управление чрез браузър и автоматично регистриране на данни върху вградена SD карта.
VialTweeter за непряка ултразвукова обработка.
Полезни факти
Протеомика
Протеомиката е научната област, която изследва протеините и протеома. Протеините изпълняват широк спектър от жизненоважни функции в организмите. Протеомът е пълният набор от протеини, експресирани от геном, клетка, тъкан или организъм в определен момент. Протеомът се променя с времето и според конкретните потребности или стресовите въздействия, на които е подложена клетката или организмът. По-конкретно, това е наборът от експресирани протеини в даден тип клетка или организъм в даден момент при определени условия. Терминът е съчетание от думите „протеини“ и „геном“. Протеомиката е изучаването на протеома.
Протеин
Протеините са големи биомолекули, така наречените макромолекули – които са съставени от една или повече дълги вериги от аминокиселинни остатъци. Протеините присъстват във всички организми както от растителен, така и от животински произход и са от решаващо значение за повечето биологични функции. Тъй като протеините съдържат много биологична информация, те се извличат за аналитични цели, напр. за протеомни изследвания. Най-важните функции, изпълнявани от протеините, включват катализа на метаболитни реакции, репликация на ДНК, отговор на стимули и транспорт на молекули от едно място на друго. Протеините се различават един от друг предимно по последователността на аминокиселините си, която се определя от нуклеотидната последователност на техните гени и която обикновено води до нагъване на протеина в специфична триизмерна структура, определяща неговата активност. Протеините – наред с пептидите – са един от основните компоненти на храната. Следователно протеомиката е мощен инструмент в науката за храните за оптимизиране на процесите, безопасността на храните и оценката на хранителната стойност.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction е преданалитична процедура за разделяне и предварително концентриране на аналити. В комбинация с ултразвукова обработка екстракцията при точката на помътняване може да бъде интензифицирана, което прави процеса по-ефективен, по-бърз и по-щадящ за околната среда. С ултразвукова обработка екстракцията при точката на помътняване е значително по-ефективен метод за подготовка на аналити. Прочетете повече за екстракцията при точката на помътняване, подпомагана с ултразвук!
Гел електрофореза
Гел електрофорезата е основният метод за разделяне и анализ на макромолекули, като ДНК, РНК и протеини, както и на техните фрагменти, въз основа на размера и заряда им. Тя се използва в клиничната химия за разделяне на протеини по заряд и/или размер (IEF в агароза, по същество независимо от размера), а в биохимията, молекулярната биология и протеомиката – за разделяне на смесена популация от ДНК и РНК фрагменти по дължина, за оценка на размера на ДНК и РНК фрагменти или за разделяне на протеини по заряд.
Клетъчни култури
Клетъчното култивиране е контролиран процес на растеж, при който клетките се отглеждат при контролирани условия. Условията за клетъчно култивиране се различават за всеки тип клетки. Като цяло средата на клетъчната култура се състои от подходящ съд (напр. петриева паничка) със субстрат или хранителна среда, която осигурява основните хранителни вещества (аминокиселини, въглехидрати, витамини, минерали), растежни фактори, хормони и газове (CO2, O2) и регулира физикохимичните условия (pH буфер, осмотично налягане, температура). Повечето клетки се нуждаят от повърхност или изкуствен субстрат, докато други клетъчни култури могат да се отглеждат свободно плаващи в хранителна среда (суспензионна култура, клетъчна суспензия).
Масови култури на животински клетъчни линии се използват в промишленото производство на вирусни ваксини и други продукти, получени чрез биотехнологии. Човешки стволови клетки се култивират, за да се увеличи броят на клетките и да се диференцират в различни типове соматични клетки за трансплантационни цели.
Тъканни проби
Терминът „тъкан“ описва междинно клетъчно образувание, при което клетъчният материал е на организационно ниво между клетките и цялостния орган. В тъканта са обединени сходни клетки с общ произход, които заедно изпълняват определена функция. Чрез функционалното обединяване на множество тъкани се образуват сложните структури на органите.
Тъканни проби се вземат за изследвания в биологията, хистологията/хистопатологията, паразитологията, биохимията и имунохистохимията, както и за култивиране на тъкани и извличане на ДНК. Различават се животински тъкани (подразделение: тъкани на бозайници) и растителни тъкани. Животинските тъкани се групират в четири основни типа: съединителна, мускулна, нервна и епителна тъкан. Растителните тъкани се подразделят на следните три тъканни системи: епидермис, основна тъкан и проводяща тъкан.
Тъканни проби могат да се приготвят от части на животни или растения, напр. кост, мускул, листа и др.
Телесни течности
Кръвта, серумът, плазмата, цереброспиналната течност, слюнката и синовиалната течност са телесни течности, които представляват богат източник на диагностично значима информация. Следователно прецизната подготовка на проби от телесни течности за анализ е важна. Първата трудност е свързана с широкия динамичен диапазон на компонентите, присъстващи в телесните течности.
Определяне на концентрацията на протеини
Методът на Bradford, методът на Lowry и методът с бицинхонинова киселина (BCA) са широко използвани методи за определяне на концентрацията на протеини. Говеждият серумен албумин (BSA) е един от най-често използваните протеинови стандарти.
Лизисен буфер
Лизисният буфер трябва да се избира според клетъчния материал или тъканта (тъканна култура, растение, бактерии, гъби и др.), както и според това дали клетките са част от структура и какъв е типът на тази структура. Широка гама лизисни буфери за екстракция на протеини, мембрани и органели се формулират с един или повече детергенти. Детергентът обикновено се избира чрез изпитвания по метода на пробите и грешките или – ако е наличен – според съществуващ протокол за екстракция на протеини. Детергентът трябва да е съвместим с тъканния източник и протеините. Като цяло се избира най-мекият детергент, който действа за конкретната тъкан / протеин, за да се запази максималната функционалност на екстракта. Освен това при екстракция на мембрани и органели мекият детергент запазва мембраната непокътната. Често използваните детергенти в лизисните буфери са предимно нейонни или цвитерйонни, напр. CHAPS, деоксихолат, Triton™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например тъкани като мозък, черен дроб, черва, бъбрек, далак и др. могат просто да бъдат буферирани с RIPA – но трябва да се включат протеазни инхибитори и DTT (напр. за гел електрофореза).
Лизисен буфер за скелетна мускулна тъкан (ледено студен): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) глицерол, 1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитол, с добавена смес от инхибитори на протеази и фосфатази
Таблица на често използвани буфери и техния pH диапазон. Като цяло тези буфери обикновено се използват при концентрации 20–50 mM.
| Буфер | pH диапазон |
|---|---|
| Лимонена киселина – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Натриев цитрат – лимонена киселина | 3,0 – 6,2 |
| Натриев ацетат – оцетна киселина | 3,6 – 5,6 |
| Натриева сол на какодиловата киселина – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Натриев дихидрогенфосфат – динатриев хидрогенфосфат | 5,8 – 8,0 |
| Имидазол – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Триетаноламин хидрохлорид – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Трицин – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Натриев тетраборат – борна киселина | 7,6 – 9,2 |
| Бицин – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Глицин – NaOH | 8,6 – 10,6 |
При повечето буфери pH зависи от температурата. Това е особено характерно за буферите с Tris. pKa се променя от 8,06 при 25°C до 8,85 при 0°C.
(pH и pKa на буфер: pH измерва концентрацията на водородни йони във воден разтвор. pKa (= константа на киселинна дисоциация) е свързана, но по-специфична мярка, тъй като помага да се предвиди как ще се държи една молекула при определена стойност на pH.)
TRIzol
TRIzol е химичен разтвор, използван за извличане на РНК/ДНК/протеини при екстракция с гуанидиниев тиоцианат–фенол–хлороформ. Използването на подпомагана с ултразвук екстракция с TRIzol води до високи добиви на ДНК, РНК и протеини от една и съща проба и по този начин превъзхожда други методи за екстракция.
Литература/Източници
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.