Ултразвукова екстракция на протеини от тъканни и клетъчни култури
- Извличането на протеини е съществена стъпка от подготовката на пробата в протеомиката.
- Протеините могат да бъдат извлечени от растителна и животинска тъкан, дрожди и микроорганизми.
- Соникацията е надежден и ефективен метод за извличане на протеини, осигуряващ високи добиви на протеин за кратко време на екстракция.
Извличане на протеини от тъкани и клетки
Извличането на протеини от тъкани и култивирани клетки е съществена стъпка от подготовката на пробата, която се извършва по време на много биохимични и аналитични техники като ELISA, PAGE, Western blotting, масспектрометрия или пречистване на протеини. Ултразвуковото разрушаване на клетките, лизисът и екстракцията са прецизно контролирана, нетермична техника за осигуряване на висок добив на протеини.
Извличане на протеини от клетки с ултразвукова сонда UP200St
- Бърз
- високи добиви
- Високоефективен
- Прецизен контрол върху параметрите
- възпроизводими резултати
- Линейна мащабируемост
Общи инструкции за ултразвуков лизис и екстракция на протеини
- Контрол на температурата: За да се осигури висок добив на протеин без термична денатурация, температурата по време на екстракцията трябва да се контролира. Най-съвременните ултразвукови хомогенизатори на Hielscher – наричан още ултразвуков дезинтегратор или ултрасонификатор – са прецизно контролируеми. Те се предлагат с щепселен температурен сензор. В опциите за настройка на ултразвуковия хомогенизатор може да се зададе максимална температура. Когато се достигне тази максимална температура, ултразвуковикторът автоматично спира, докато пробата се охлади.
- Буфер: Изборът на подходящ буфер и правилния обем буфер варира от тъкан до тъкан и трябва да се определи чрез изпитване чрез проба и грешка.
- Изолация / пречистване: Протеиновите лизати могат да съдържат излишък от биомолекули като ДНК или въглехидрати, които могат да бъдат отстранени чрез утаяване на протеини (дезоксихолат-трихлороцетна киселина) или буферен обмен.
Chittapalo и Noomhorm (2009) съобщават в своето проучване, че добивът на протеин се увеличава чрез ултразвукова хомогенизация на тъканите и процесът на лизис може значително да подобри съществуващите процеси на екстракция – създаване на нови възможности за търговски добив.
Ултразвуков CupHorn за едновременна, високоефективна подготовка на проба от множество проби при едни и същи условия за изолиране на протеини и фрагментация на ДНК.
Извличане на протеини от животинска тъкан
За приготвянето на тъкан с цял размер (напр. бъбрек, сърце, бял дроб, мускул и др.) тъканта трябва да се разчлени на много малки парчета с чисти инструменти, за предпочитане върху лед и възможно най-бързо, за да се предотврати разграждането от протеази (напр. буфер за лизис като RIPA или хипотоничен буфер за лизис, съдържащ коктейл от протеаза и инхибитор на фосфатазата). След дисекция пробата се потапя в течен азот за бързо замразяване. Пробата може да се съхранява при -80°C за по-късна употреба или да се държи върху лед за незабавна хомогенизация. Непосредствено преди ултразвукова екстракция в епруветката за проби бързо се добавя леденостуден буфер за лизис (с протеазни инхибитори DTT, леупептид и апротинин) (на ~10 mg тъкан се препоръчват приблизително ~600 μL буфер). Препоръчва се приблизително 20-60 mg тъкан на епруветка за проба.
Ултразвуковата хомогенизация, лизис и екстракция се извършват с ултразвуков хомогенизатор като UP100H или UP200Ht, оборудван с сонотрод с микронакрайник. Продължителността на звука е 60-90 сек. в режим на ултразвуков цикъл от 15 сек. ултразвук и 10 сек. време за почивка. Пробата трябва да се държи в лед през цялото време.
След ултразвукова хомогенизация / екстракция, лизатът се центрофугира при 27 000 g за около 20 min. След това супернатентът се събира, така че концентрацията на протеина да може да се определи чрез протеинов анализ като протеинов анализ на Пиърс BCA.
Извличане на протеини от кръвен серум
За хомогенна смес от серума и фосфатния буфер, пробата се завихрява първо преди ултразвуков клетъчен лизис. За ултразвуков лизис пробата се ултразвуков хомогенизатор като UP100H за 8 цикъла при 20% амплитуда, за цикли на всеки 5 секунди включено и 15 секунди изключение. Екстракцията на протеин се извършва чрез ултразвук в цикли (режим на пулсация) и чрез поставяне на пробата върху лед, така че да се избегне прегряване и термично разграждане на пробата. Тъй като серумът съдържа голямо количество протеини с високо молекулно тегло (като албумин, α1-антитрипсин, трансферин, хаптоглобулин, имуноглобулин G и имуноглобулин А), които пречат на отделянето на протеини с ниско молекулно тегло по време на IEF, се препоръчва те да бъдат изчерпани от серума с помощта на изчерпваща колона.
Извличане на протеини от растителна тъкан
Прясна, мека растителна тъкан, например мъх и др., може лесно да бъде разрушена чрез просто поставяне на нарязания пробен материал в лизисен буфер за ултразвук. Жилавите, лигенозни растителни тъкани, като семена, елхови иглички и др., трябва да се смилат сухи. Някои твърди, дървесни растителни материали трябва да бъдат замразени и смлени в течен азот, преди да бъдат извлечени чрез ултразвук. За суспензии за растителни клетъчни култури е достатъчна ултразвукова обработка между 30 и 150 секунди в буфер за лизис. По-твърдият материал като тиквените семки изискват по-интензивна ултразвук, както е описано по-долу.
Протокол за ултразвукова екстракция на албумин от тиквени семки
За ултразвукова протеинова екстракция на албумин от фино смляно тиквено семе на прах, 10 g обезмаслено тиквено семе на прах и 100 ml дейонизирана вода като разтворител се добавят в 250 ml стъклена чаша. Екстракцията на протеин се състои в два етапа: Първо, пробата се овлажнява с ултразвуков сонд тип UP400St (400W, 24kHz), оборудван със сонотрод S24d7. Стъклената чаша се поставя на студена водна баня по време на ултразвуковата хомогенизация. Щепселният температурен сензор и настройките за контрол на температурата на ултразвуковия ултразвук UP400St гарантират, че температурата на пробата винаги се поддържа под 30°C. Чрез прецизен контрол на температурата по време на ултразвук се избягва денатурацията на албумина. Второ, екстракцията се извършва със смесител при скорост 200 об / мин и при 30°C. След това чашата се прехвърля в термостатичен шейкър. Глобулинът се отстранява чрез диализа с дестилирана вода. След отстраняването на глобулина, протеиновият екстракт може да бъде взет за определяне на албуминовия профил и впоследствие се коригира до pI=3.0, като се използва 0.1 M HCl за албуминова коагулация. Твърдата фаза се отделя чрез центрофугиране при 5000 g, 20°C и се разтваря отново в дейонизирана вода. Коагулацията на албумин се извършва два пъти, за да се увеличи съотношението на протеина в албуминовия концентрат.
Ултразвуковата алкална протеинова екстракция за приготвяне на протеинов концентрат от оризови трици показва, че ултразвуковата обработка води до по-висок добив на протеин при значително по-кратко време за екстракция – в сравнение с конвенционалните методи за екстракция.
Протокол за подготовка на проби за функционален ензим iNOS
За да се получи напълно функционален ензим iNOS (напр. за скрининг на лекарства), се препоръчва следният протокол: Клетъчната суспензия трябва да се постави върху лед и да се ултразвука с UP100H при амплитуда 10 μm при режим на цикъл от 5 сек. ултразвук и 25 сек. почивка върху лед. Процедурата трябва да се повтори около 3 пъти. Времето за почивка между циклите на ултразвук намалява повишаването на температурата и следователно ще намали риска от денатурация.
ултразвукова разтворимост на протеини
Соникацията може да ускори процеса на разтваряне на протеини, който обикновено изисква няколко часа. За да не се прегрее пробата и да се предотврати разграждането и модификациите на протеини в разтвори, съдържащи урея, ултразвуковите изблици не трябва да продължават повече от няколко секунди.
Ултразвуков апарат UP200Ht с 2 мм микронакрайник S26d2 за ултразвук на малки проби.
Ултразвуково оборудване за екстракция на протеини
Hielscher Ultrasonics предлага широка гама от ултразвукови хомогенизатори за разграждане на клетки, тъкани, бактерии, микроорганизми, дрожди и спори.
Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher са мощни и лесни за работа. Създадени за работа 24/7, те са проектирани като здрави и ефективни лабораторни и настолни устройства. За всички устройства изходната енергия и амплитудата могат да бъдат прецизно контролирани. Широката гама от аксесоари отваря допълнителни възможности за настройка. Цифровите ултразвукови уреди като VialTweeter, UP200Ht, UP200St и UP400St имат вграден контрол на температурата и вградена SD карта за автоматичен запис на данни.
За индиректно, без кръстосано замърсяване и едновременно ултразвуково озвучаване на множество проби предлагаме VialTweeter или ултразвуковия CupHorn.
Таблицата по-долу ви дава общ преглед на нашите ултразвукови апарати за подготовка на проби, разрушаване на клетките и екстракция. Щракнете върху типа устройство, за да получите повече информация за всеки ултразвуков хомогенизатор. Нашият добре обучен и дългогодишен опит технически персонал ще се радва да ви помогне да изберете най-подходящия ултразвуков уред за вашата проба!
| Обем на партидата | Дебит | Препоръчителни устройства |
|---|---|---|
| до 10 флакона или епруветки | Н.А. | ФлаконВисокоговорител за високи честоти |
| многоямкови / микротитърни плочи | Н.А. | UIP400MTP |
| множество тръби / съдове | Н.А. | Cuphorn |
| 1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | UP100H |
| 10 до 1000 мл | 20 до 200 мл/мин | UP200Ht, UP200St |
| 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | UP400St |
В зависимост от вашето приложение, материал и обем на пробата, ние ще ви препоръчаме най-подходящата настройка за вашата подготовка на пробата. Свържете се с нас днес!
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Цифровите ултразвукови апарати Hielscher разполагат с дистанционно управление на браузъра и автоматично протоколиране на данни на вградена SD карта.
ФлаконВисокоговорител за високи честоти за индиректна ултразвук.
Факти, които си струва да знаете
протеомика
Протеомиката е изследователската област, която изследва протеините и протеома. Протеините изпълняват широк спектър от жизненоважни функции в организмите. Протеомът е целият набор от протеини, експресирани от геном, клетка, тъкан или организъм в определено време. Протеомът варира с времето и различните изисквания или стресове, на които се подлага клетката или организмът. По-конкретно, това е набор от експресирани протеини в даден тип клетка или организъм, в даден момент, при определени условия. Терминът е смес от протеини и геном. Протеомиката е изследване на протеома.
протеин
Протеините са големи биомолекули, така наречените макромолекули – които са съставени от една или повече дълги вериги от аминокиселинни остатъци. Протеините присъстват във всички организми от растителен и животински произход и са от решаващо значение за повечето биологични функции. Тъй като протеините съдържат много биологична информация, те се извличат за аналитични цели, например за протеомни изследвания. Най-важната функция, изпълнявана от протеините, включва катализата на метаболитните реакции, репликацията на ДНК, реакцията на стимули и транспортирането на молекули от едно място на друго. Протеините се различават един от друг преди всичко по своята последователност от аминокиселини, която се диктува от нуклеотидната последователност на техните гени и която обикновено води до сгъване на протеина в специфична триизмерна структура, която определя неговата активност. Протеините са – Освен пептиди – един от ключовите компоненти на храната. Следователно протеомиката е мощен инструмент в науката за храните за оптимизиране на процесите, безопасността на храните и оценката на храненето.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction е преданалитична процедура за разделяне и предварително съгласуване на аналити. В комбинация с ултразвук извличането на облачни точки може да бъде засилено, което прави процеса по-ефективен, по-бърз и по-екологичен. При ултразвука екстракцията на точката на облаци е значително по-ефективен метод за подготовка на аналити. Прочетете повече за ултразвуковото извличане на облачни точки!Гел електрофореза
Гел електрофорезата е основният метод за разделяне и анализ на макромолекули като ДНК, РНК и протеини, както и на техните фрагменти, въз основа на техния размер и заряд. Използва се в клиничната химия за разделяне на протеини по заряд и/или размер (IEF агароза, по същество независима от размера) и в биохимията, молекулярната биология и протеомиката за разделяне на смесена популация от ДНК и РНК фрагменти по дължина, за оценка на размера на ДНК и РНК фрагменти или за разделяне на протеини по заряд.
клетъчни култури
Клетъчната култура е контролиран процес на отглеждане, чрез който клетките се култивират при контролирани условия. Условията на клетъчна култура варират за всеки тип клетки. Като цяло средата на клетъчната култура се състои от подходящ съд (напр. съд на Петри) със субстрат или среда, която доставя основните хранителни вещества (аминокиселини, въглехидрати, витамини, минерали), растежни фактори, хормони и газове (CO2, O2), и регулира физико-химичната среда (рН буфер, осмотично налягане, температура). Повечето клетки се нуждаят от повърхностен или изкуствен субстрат, докато други клетъчни култури могат да бъдат култивирани свободно плаващи в култивационна среда (суспензионна култура, клетъчна суспензия).
Масовите култури от животински клетъчни линии се използват в промишленото производство на вирусни ваксини и други биотехнологично получени продукти. Човешките стволови клетки се култивират, за да се увеличи броят на клетките и да се диференцират клетките в различни видове соматични клетки за целите на трансплантацията.
Тъканни проби
Терминът тъкан описва клетъчен междинен продукт, при който клетъчният материал е на организационно ниво между клетките и цялостния орган. В тъканта се сглобяват подобни клетки от един и същ произход, които заедно изпълняват специфична функция. Чрез функционалното групиране на множество тъкани се формират сложните структури на органите.
Тъканите се вземат за изследвания в областта на биологията, хистологията/хистопатологията, паразитологията, биохимията, имунохистохимията, както и за култивиране и извличане на ДНК. Може да се направи разлика между животинска (подразделение: бозайна тъкан) и растителна тъкан. Животинските тъкани са групирани в четирите основни типа съединителна, мускулна, нервна и епителна тъкан. Растителната тъкан се подразделя на следните три тъканни системи: епидермис, земна тъкан и съдова тъкан.
Тъканни проби могат да бъдат получени от животински или растителни части, например кости, мускули, листа и др.
Телесни течности
Кръвта, серумът, плазмата, цереброспиналната течност, слюнката и синовиалната течност са телесни течности, които предлагат чудесен източник на диагностично значима информация. Ето защо е важна сложната подготовка на проби от телесна течност за анализ. Първата трудност е свързана с широкия динамичен диапазон на компонентите, присъстващи в телесните течности.
Определяне на концентрацията на протеин
Анализът на Брадфорд, анализът на Лоури и анализът на бицинхонинова киселина (BCA) са често срещани тестове за определяне на концентрацията на протеини. Говеждият серумен албумин (BSA) е един от най-често използваните протеинови стандарти.
лизисен буфер
Лизисният буфер трябва да бъде избран в съответствие с клетъчния материал или тъкан (тъканна култура, растение, бактерии, гъбички и др.) и дали клетките са в структура и вида на структурата. Широка гама от лизисни буфери за екстракция на протеини, мембрани и органели са формулирани с един или повече детергенти. Препаратът обикновено се избира чрез тестове за проба и грешка или – ако е налично – според съществуващ протокол за екстракция на протеини. Детергентът трябва да е съвместим с тъканния източник и протеините. Като цяло най-мекият детергент, който работи за конкретна тъкан / протеин, се избира, за да се поддържа максималната функционалност на екстракта. Освен това, в случай на екстракция на мембрани и органели, мек почистващ препарат запазва мембраната непокътната. Често използваните детергенти в буферите за лизис са предимно нейонни или цвитерионни, например CHAPS, дезоксихолат, Triton™ X-100, NP40 и Tween 20.
Например, тъкани като мозък, черен дроб, черва, бъбреци, далак и т.н. могат просто да бъдат буферирани с RIPA – въпреки това трябва да се включат протеазни инхибитори и DTT (напр. за гел електрофореза).
Лизис буфер за скелетна мускулна тъкан (ледено студен): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) глицерол, 1 mM EDTA, 1 mM дитиотрейтол, допълнен с протеаза и коктейл от инхибитори на фосфатазата
Таблица на общите буфери и техния диапазон на pH. По принцип тези буфери обикновено се използват при концентрации от 20-50 mM.
| буфер | Диапазон на pH |
|---|---|
| Лимонена киселина – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Натриев цитрат – Лимонена киселина | 3.0 – 6.2 |
| Натриев ацетат – оцетна киселина | 3.6 – 5.6 |
| Натриева сол на какодилова киселина – HCl | 5.0 – 7.4 |
| СПИ – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Натриев дихидроген фосфат – динатриев хидроген фосфат | 5.8 – 8.0 |
| имидазол – HCl | 6.2 – 7.8 |
| ПОДОЧИСТАЧКИ – КОХ | 6.6 – 7.8 |
| Триетаноламин хидрохлорид – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Трис – HCl | 7.0 – 9.0 |
| ХЕПЕС – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Трицин – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Натриев тетраборат – Борна киселина | 7.6 – 9.2 |
| Бицин – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Глицин – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Повечето буфери показват рН-зависимост от температурата. Това важи особено за Tris буферите. pKa се променя от 8,06 при 25°C до 8,85 при 0°C.
(pH и pKa на буфер: pH измерва концентрацията на водородни йони във воден разтвор. pKa (= константа на киселинна дисоциация) е свързана, но по-специфична мярка, тъй като помага да се предскаже как молекулата ще действа при определена стойност на pH.)
ТРИзол
TRIzol е химичен разтвор, използван за извличане на РНК/ДНК/протеин по време на екстракцията на гуанидиниев тиоцианат-фенол-хлороформ. Използването на ултразвукова екстракция на TRIzol води до високи добиви на ДНК, РНК и протеини от една и съща проба и по този начин превъзхожда другите методи за екстракция.
Литература/Препратки
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.