Hielscher ултразвукова технология

Ултразвуково Protein Extraction от тъкани и клетъчни култури

  • екстракция на протеин е важна стъпка проба получаване на протеомиката.
  • Протеините могат да бъдат извлечени от растителен и животински тъкани, дрожди и микроорганизми.
  • Sonication е надежден и ефективен метод за екстракция протеин дава високи добиви на протеин в рамките на кратко време екстракция.

 

Екстракция на протеин от тъкани и клетки

екстракция на протеин от тъкани и култивирани клетки е важна стъпка приготвяне на пробата, която се извършва в продължение на много биохимични и аналитични техники, такива като ELISA, PAGE, Western блот, Мас спектрометрия, или протеин пречистване. свръхзвуков разрушаване на клетка, лизиране и извличане е точно контролирана техника, за да осигури високи добиви на протеини.

екстракция на протеин от животински тъкани

За приготвянето на тъкани с пълна големина (напр. Бъбрек, сърце, бял дроб, мускул и т.н.) тъканта трябва да се разрязва на много малки парченца с чисти инструменти, за предпочитане върху лед и възможно най-бързо, за да се предотврати разграждането с протеази лизисен буфер, като RIPA или хипотоничен лизисен буфер, съдържащ протеазен и фосфатазен инхибиторен коктейл). След дисекция, пробата се потапя в течен азот за бързо замразяване. Пробата може да се съхранява при -80 ° С за по-нататъшна употреба или да се съхранява на лед за незабавна хомогенизация. Непосредствено преди екстракцията с ултразвук се добавя бързо ледено студен лизисен буфер (с протеазни инхибитори DTT, леупептин и апротинин) в тръбата за проби (за ~ 10 mg тъкан приблизително ~ 600 μL буфер се препоръчват). Прибл. Препоръчва се 20-60 mg тъкан на тръба за проби.
Ултразвукова хомогенизиране, лизис и екстракцията се извършва с ултразвуков хомогенизатор като Uf200 ः т или UP200St, Снабден с издатина на микро-връх. продължителност Sonication е 60-90 сек. в режим ултразвукова цикъл от 15 секунди. ултразвук и 10 сек. почивка време. Пробата трябва да се съхранява в лед през цялото време.
След ултразвукова хомогенизиране / екстракция, лизатът се центрофугира при 27,000g за прибл. 20 мин. След това супернатантата се събира, така че концентрацията на протеина се определя чрез изследване на протеин, като например Pierce ВСА протеин анализ.

Протеин ултразвук е важен метод за подготовка на пробата

Ултразвукова екстракция протеин от клетки с UP200St

Искане на информация




Забележете нашите Правила за поверителност,


екстракция на протеин от кръвен серум

За хомогенна смес от серума и фосфатен буфер, пробата се завихря, преди ултразвуков клетъчен лизис. За ултразвукова лизис, пробата се обработва с ултразвук с ултразвуков хомогенизатор лаборатория като UP100H в продължение на 8 цикъла при 20% амплитуда, за цикъла на всеки 5 секунди и 15 секунди на разстояние. Sonocation се извършва от sonicationg в цикъла и чрез поставяне на пробата върху лед, така че да се избегне прегряване и термично разлагане на пробата. Тъй серум съдържа голямо количество протеини с високо молекулно тегло (например албумин, α1-антитрипсин, трансферин, haptoglobulin, имуноглобулин G и имуноглобулин А), които пречат на отделянето на протеини с ниско молекулно тегло през IEF, се препоръчва да ги разрушават от серума се използва колона изчерпване.

екстракция на протеин от растителна тъкан

Прясна, мека растителна тъкан, например мъх и т.н., може лесно да се разрушават чрез просто поставяне на проба нарязан материал в лизисен буфер в продължение на ултразвук. Трудни, ligenous растителни тъкани, като например семена, ела игли и т.н., трябва да бъдат смлени сухи. Някои твърди, дървесни растителни материали трябва да бъдат замразени и смила в течен азот преди да се екстрахира с ултразвук. За суспензии растителна клетъчна култура, ултразвукова обработка между 30 и 150 секунди в лизисен буфер обикновено е достатъчна. По-строги материал като тиквени семки изискват по-интензивна обработка с ултразвук, както е описано по-долу.

Протокол за ултразвукова екстракция на албумин от тиквени семки

Ултразвуково тъкан хомогенизатор UP400St с S24d40 - за извличане на протеин от растителен и животински тъкани (Увеличи!)За протеин екстракция ултразвуковата на албумин от фино смлян прах тиквено семе, се прибавят 10 г обезмаслена прах тиквено семе и 100 мл дейонизирана вода като разтворител в 250 mL стъклена чаша. добива на протеин се състои от два етапа: Първо, пробата се обработва с ултразвук с сонда тип ултрасоннкаторът на UP400St (400W, 24kHz) с монтиран издатина S24d7. чашата на стъкло се поставя в баня със студена вода по време на ултразвукова хомогенизиране. В определянето на ултрасоннкаторът UP400St с включен температурен сензор гарантира, че температурата на пробата винаги се поддържа под 30 ° C. Чрез точния контрол на температурата при ултразвук се избягва денатурирането на албумина. На второ място, екстрахирането се извършва със смесител при скорост 200 rpm и при 30 ° С. След това чашата се прехвърля в термостатичен шейкър. Глобулинът се отстранява чрез диализа с дестилирана вода. След отстраняването на глобулина протеинният екстракт може да се вземе проба за определяне на профила на албумина и впоследствие да се коригира до pI = 3.0 като се използва 0.1 М НС1 за коагулация на албумин. Твърдата фаза се отделя чрез центрофугиране при 5000 g, 20 ° С и се разтваря отново в дейонизирана вода. Коагулацията на албумина се извършва два пъти, за да се увеличи съотношението протеини в албуминовия концентрат.

Ултразвуково алкална екстракция протеин за получаване на концентрат на протеини от оризови трици показва, че резултатите от обработката с ултразвук в по-висок добив протеин в значително по-кратко време за екстракция – в сравнение с конвенционалните методи за екстракция.

Ултразвуково VialTweeter устройство за екстракция протеин от тъканни проби (Увеличи!)

VialTweeter за непряко ултразвук.

Предимства

  • бърз
  • високи добиви
  • висока ефективност
  • Прецизен контрол върху параметрите
  • възпроизводими резултати
  • линейна скалируемост

Примерен препарат протокол за функционален ензим ИНОС

За да се получи напълно функционален ИНОС ензим (например за скрининг лекарство), се препоръчва следния протокол: Клетъчната суспензия трябва да се постави върху лед и ултразвук с UP100H при 10 цт амплитуда в режим на цикъл от 5 сек. ултразвук и 25 сек. почива върху лед. Процедурата трябва да се повтаря прибл. 3 пъти. Времето за почивка между циклите за обработка с ултразвук намалява повишаването на температурата и следователно ще намали риска от денатуриране.

Ултразвуков Protein Солубилизиращ

Sonication може да ускори процеса на разтваряне протеин, който обикновено изисква няколко часа. За да не се прегрява пробата и да се предотврати разграждане на протеина и модификации в разтвори, съдържащи карбамид, ултразвукови пакетите не трябва да продължават повече от няколко секунди.

Общи указания

Контрол на температурата: За да се осигури висок добив протеин без термична денатурация, температурата по време на екстракцията трябва да бъде контролирана. състоянието на най-арт ултразвукови хомогенизатори Hielscher е – наричан също ултразвуков трошачка или sonificator – са точно контролирани. Те разполагат с plugable температурен сензор. В опциите за настройка на ултразвуков хомогенизатор, максимална температура може да се настрои. Когато се достигне тази температура макс, ултрасоннкаторът автоматично спира, докато пробата се охлади.
буфер: На избор на подходящ буфер и дясната обема на буфер варира от тъкан на тъкан и трябва да измисли-от тестване проба-грешка.
Изолиране / пречистване: Протеиновите лизати могат да съдържат излишък на биомолекули като ДНК или въглехидрати, които могат да бъдат отстранени чрез утаяване на протеин (деоксихолат-трихлороцетна киселина) или буферен обмен.

Chittapalo и Noomhorm (2009) съобщава, че добив протеин повишено използване на ултразвук и тази тъкан хомогенизиране и лизис на процеса на ултразвук може да подобри значително съществуващите процеси на екстракция – дава възможност за нови възможности за бизнес за добив.

Звук защита със звук корпус Hielscher на SPB-L и ултразвуково устройство UP200St. (Кликнете за увеличение!)

Ултразвуков хомогенизатор на тъкани UP200St за ефективно извличане протеин

Прецизен контрол на ултразвукова обработка (Кликнете за увеличение!)

Browser контрол за прецизна работа и мониторинг на процеса на обработка с ултразвук

Ултразвуково оборудване за Екстракция на протеин

Hielscher Ultrasonics предлага широк обхват от ултразвукови хомогенизатори за разпадането на клетки, тъкани, бактерии, микроорганизми, дрожди и спори.
Hielscher лабораторни ultrasonicators са мощни и лесни за работа. Създаден за 24/7 работа, те са проектирани като стабилни и ефективни лабораторни и пейка-добрите устройства. За всички устройства, на изхода на енергия и амплитудата може точно да се контролира. Широката гама от аксесоари отваря допълнителни опции за настройка. Цифровите устройства, като например VialTweeter, Uf200 ः т, UP200St, и UP400St има интегриран контрол на температурата и вградена SD карта за автоматично записване на данни.
За косвени, кръстосано замърсяване и без едновременно Звукообработката множество проби, ние предлагаме най- VialTweeter или Ултразвуков cuphorn,
В зависимост от приложението, материал, и обема на пробния си, ние ще ви препоръча най-подходящата настройка за пробоподготовка. Свържете се с нас още днес!

Свържете се с нас! / Попитай ни!

Моля, използвайте формата по-долу, ако желаете да изиска допълнителна информация за ултразвукова хомогенизиране. Ние ще се радваме да Ви предложим ултразвукова система, отговарящи на вашите изисквания.









Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,


Позоваването литература /

  • Chittapalo Т, Noomhorm A (2009): Ултразвуково подпомага алкален екстракция на протеин от обезмаслени оризови трици и свойства на протеинови концентрати. Int J хранителни Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, Андре E.S:; Pereira, Даян М. Амарал, Джоан. Nunes, Ана М. Гомес, София E. Roberts, Peter М. Ето, Adrian С. D'Hooge, Rudi; Steer, Клифърд J. Thibodeau, Стивън С. Borralho, Peter М. Rodrigues, Cecilia М. P. (2013): Ефективно възстановяване на протеини от множество проби източник след Trizol или Trizol LS екстракция на РНК и дългосрочно съхранение. BMC геномика, 2013 г., 14: 181.


Факти заслужава да се знае

протеомика

Протеомика е областта на научноизследователската дейност, която разследва протеини и протеома. Протеини fullfil широк спектър от жизнените функции в рамките на организми. Протеома е целия набор от протеини, експресирани от генома, клетка, тъкан или организъм в определено време. Протеома варира с времето и различни изисквания, или подчертава, че една клетка или организъм претърпява. По-специално, това е набор от протеини, изразени в даден вид на клетка или организъм, в даден момент, при определени условия. Терминът е смес от протеини и геном. Протеомика е изучаването на протеома.

протеин

Протеините са големи биомолекули, така наречените макромолекули – които са съставени от една или повече дълги вериги от аминокиселинни остатъци. Протеините присъстват във всички организми от растителен и животински произход и са от решаващо значение за повечето биологични функции. Тъй като протеините съдържат много биологична информация, те се извличат за аналитична цел, например за протеомични изследвания. Най-важната функция, изпълнявана от протеини, включва катализа на метаболитни реакции, ДНК репликация, реакция на стимули и транспорт на молекули от едно място на друго. Протеините се различават един от друг основно в тяхната последователност от аминокиселини, която се диктува от нуклеотидната последователност на техните гени и която обикновено води до нагъване на протеина в специфична триизмерна структура, която определя нейната активност. Протеините са – освен пептиди – един от ключовите компоненти на храната. Ето защо, протеомиката е мощен инструмент, в областта на науката храна за оптимизиране на процесите, безопасност на храните и хранителните оценка.

гел електрофореза

Гел електрофореза е основният метод за разделяне и анализ на макромолекули като ДНК, РНК и протеини, както и техните фрагменти, въз основа на техния размер и заплащане. Той се използва в клиничната химия за разделяне протеини чрез зареждане и / или размер (IEF агароза, по същество размер независим) и в биохимията, молекулярната биология и протеомиката за разделяне на смесена популация на ДНК и РНК фрагменти с дължина, за да се оцени размера на ДНК и РНК фрагменти или да отделят протеини чрез заплащане.

клетъчни култури

Клетъчна култура е контролира процеса на отглеждане от кои клетки се отглеждат при контролирани условия. Клетъчна култура условия варират за всеки клетъчен тип. Като цяло, среда на клетъчна култура се състои от подходящ съд (например петриева паничка) с подложка или носител, който доставя основни хранителни вещества (аминокиселини, въглехидрати, витамини, минерали), растежни фактори, хормони и газове (СО2, The2), И регулира физико-химична среда (рН буфер, осмотичното налягане, температура). Повечето клетки трябва повърхност или изкуствен субстрат, докато други клетъчни култури могат да бъдат култивирани свободно плаващ в културална среда (суспензионна култура, клетъчната суспензия).
Масови култури от животински клетъчни линии са използвани в промишленото производство на вирусни ваксини и други биотехнологичен производни продукти. Човешки стволови клетки се култивират за разширяване на броя на клетките и диференциране на клетките в различни соматични клетъчни типове за целите на трансплантации.

тъканни проби

Терминът тъкан описва клетъчна междинно съединение, където клетъчния материал е организационна ниво между клетки и пълен орган. В тъкан, и други клетки от един и същ произход, които заедно извършват специфична функция, са сглобени. От функционалните групиране на множество тъкани, се формират сложни структури на органи.
Тъканта се вземат проби за изследване в биологията, хистология / хистопатология, паразитология, биохимия, имунохистохимия, както и да се култивира и се екстрахира ДНК. Това могат да бъдат разграничени между животно (подразделение: бозайник тъкан) и растителна тъкан. тъкани животни са групирани в четири основни типа на съединителната, мускул, нервна, и епителна тъкан. Растителна тъкан се разделя на следните три системи тъкан: епидермиса, приземния тъкан и съдовата тъкан.
Тъканни проби могат да бъдат получени от животински или растителни части, например кости, мускули, листа и т.н.

Телесни течности

Кръв, серум, плазма, гръбначномозъчна течност, слюнка и синовиална течност са телесни течности, които предлагат голям източник на диагностично релевантна информация. Ето защо, изискан подготовка на пробите за анализ телесна течност е важно. Първата трудност е свързана с широк динамичен обхват на компоненти, присъстващи в телесните течности.

Определяне на концентрацията на протеин

Bradford анализ, анализ на Lowry и бицинхонинова киселина (ВСА) анализ са общи анализи за определяне на концентрацията на протеини. Говежди серумен албумин (BSA) е един от най-често използваният протеин стандарт.

буфер за лизиране

Лизисен буфер трябва да бъде избран в съответствие с клетъчния материал или тъкан (тъкан култура, растения, бактерии, гъбички и т.н.), и дали клетките са в структурата и вида на структурата. Широка гама от лизис буфери за добив на протеини, мембрани и органели са формулирани с един или повече детергенти. Детергентът обикновено се избира чрез тестове опити и грешки или – ако е налична – съгласно съществуващ протокол екстракция протеин. Препаратът трябва да е съвместима с източника на тъкани и протеините. Като цяло, най-леката детергент, който работи за специфична тъкан / протеин, се избира, за да се поддържа максимална функционалност на екстракта. Освен това, в случай на извличане на мембрани и органели, мек детергент държи мембраната непокътнати. Често използвани детергенти в лизисен буфер предимно нейонни или амфотерни, например CHAPS, деоксихолат, Triton ™ X-100, NP40, и Tween 20.
Например, тъкани като мозъка, черния дроб, червата, бъбреците, далака и т.н. могат да бъдат просто буферирана с RIPA – обаче трябва да бъдат включени протеазни инхибитори и DTT (например за гел електрофореза).
Лизисен буфер в продължение на скелетна мускулна тъкан (леденостуден): 20 тМ Tris (рН 7.8), 137 тМ NaCl, 2.7 тМ KCI, 1 тМ MgCl2, 1% Triton Х-100, 10% (т / об) глицерол, 1 тМ EDTA , 1 милимола дитиотреитол, допълнена с протеаза и фосфатаза инхибитор коктейл
Таблица на общи буфери и тяхното рН обхват. Като цяло, тези буфери обикновено се използват в концентрации от 20-50 тМ.

буфер рН обхват
Лимонена киселина – Naoh 2,2 – 6,5
Натриев цитрат – Лимонена киселина 3,0 – 6,2
Натриев ацетат – оцетна киселина 3,6 – 5,6
Какодилова киселина натриева сол – Hcl 5,0 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
Натриев дихидроген фосфат – динатриев хидрогенфосфат 5,8 – 8,0
Имидазолното – Hcl 6,2 – 7,8
Подочистачки – КОН 6,6 – 7,8
триетаноламин хидрохлорид – Naoh 6,8 – 8,8
трис – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Трицин – Naoh 7,6 – 8,6
Натриев тетраборат – борна киселина 7,6 – 9,2
бицинов – Naoh 7,7 – 8,9
Глицин – Naoh 8,6 – 10,6

Повечето буфери показват рН-зависимост от температурата. Това е особено вярно за Tris буфери. РКа променя от 8.06 при 25 ° С до 8,85 при 0 ° С.
(РН и рКа на буфер: рН измерва концентрацията на водородните йони във воден разтвор рКа (= киселина дисоциационна константа) е свързано, но по-специфична мярка, с това, че помага да се предскаже как молекула ще действа в определен. рН стойност).

TRIzol

TRIzol е химически разтвор, използван за извличане на РНК / ДНК / протеин по време на извличането на гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ. Използването на ултразвук подпомагани резултати Trizol екстракция при високо ДНК, РНК и протеин добиви от една и съща проба и превъзхожда този начин други методи за екстракция.