Ултразвуков Lysis за Западна Блотингът

  • В вестерн блот е аналитична процедура за откриване на специфични протеини в проба от тъкан или клетъчен екстракт хомогенат.
  • За да тече Western блот или за измерване на ензимната активност, много анализи изискват достъп до материали (например протеини, ДНК, субклетъчни фрагменти), захванати в клетката.
  • Соникацията е надежден и лесен за дръжка метод за контролирано разрушаване на клетката и лизис.

Ултразвукова Cell Прекъсване

екстракция на протеин от тъкани и култивирани клетки е първата стъпка за много биологични, биохимични и аналитични техники (PAGE, Western блотинг, ELISA, мас спектрометрия, и т.н.) или пречистване на протеин. За да се получи висок добив протеин, клетъчния материал и тъканта трябва да бъде ефективно разстрои / лизирани. Дали растителна клетка или животински тъкани, звукообработка е методът да се подготви вашия клетъчен лизат лесно и бързо.

Предимства на обработка с ултразвук

  • Бърз & ефикасен
  • лесна работа
  • висок добив протеин
  • възпроизводим / повторяеми
  • прецизно контролиран
  • мащабируема

Имунопресичане протокол за Западна Имунологично

А. Реагенти

За получаването на разтвори, се използва пречистена вода като Milli-Q.

  • 1х фосфатен буфериран физиологичен разтвор (PBS)
  • 1Х Cell Lysis буфер: 20 тМ Tris (рН 7.5), 150 тМ NaCl, 1 тМ EDTA, 1 тМ EGTA, 1% Triton Х-100, 2.5 тМ натриев пирофосфат, 1 тМ β-глицерофосфат, 1 тМ Na3VO4, 1 ug / мл левпептин
    Важно: Добавете 1 мМ PMSF непосредствено преди употреба.
  • 15 мкл Протеин А + 15 микролитра протеин G е достатъчно за IP, но може да зависи от обема на първично антитяло и проба. Може да се използва предварително смесен протеин А / G агароза (например протеин А за заешко IgG падащото и Протеин G за миши IgG падащото)
  • Буфер 3X SDS проба: 187.5 тМ Tris-HCl (рН 6.8 при 25 ° С), 6% т / о SDS, 30% глицерол, 150 тМ DTT, 0.03% т / о бромофенол синьо

В. Получаване на клетъчни лизати

  • Събиране на клетките. За събиране клетки при неденатуриращи условия, премахване носители и изплакнете клетки веднъж с леденостуден PBS.
  • Премахване PBS и се добавя 0,5 мл ледено студен 1Х клетъчен лизисен буфер към всяко блюдо (10 cm) и се инкубира на плочите върху лед в продължение на 5 минути.
  • Клетките се остъргват от плаките и се прехвърля в микроцентрофужни епруветки. Съхранявайте върху лед.
  • Ултразвук два пъти за 10 секунди в ледено студен буфер имунопреципитация (IP буфер: 50 тМ Tris-HCl [рН 7.4], 150 тМ NaCl, 5 тМ EDTA, 0.1% NP-40 и инхибитор смес протеаза). За озвучаването VialTweeter или сонда ултрасоннкаторът като UP100H или Uf200 ः т са най-подходящи.
  • Центрофугира лизатите на 15000грама за 10 минути при 4 ° С.
  • Прехвърлете супернатанта в нова епруветка. (Ако е необходимо, лизат може да се съхранява при -80 ° С).
  • Добавяне на първичното антитяло към супернатантата. Супернатантата с първичното антитяло се инкубират в продължение на 1 час при 4 ° С под лека възбуда. Първично антитяло обикновено се прибавят в количество 10 пъти по-концентриран, отколкото се използва за уестърн блотинг. (Може да се започне с 1 цд на 100 мкл.)
  • След това супернатантата се инкубира допълнително със смес от равни количества от протеин А-агароза (Invitrogen) и Протеин G агароза за още 1 час.
  • Измийте агарозни топчета три пъти с IP буфер. След това се екстрахира свързаните протеини с натоварване буфер SDS-PAGE чрез нагряване при 95 ° С в продължение на 5 минути.

С Имунопреципитация

  • Вземете 200 ul клетъчен лизат и се добавя първично антитяло. Инкубира се при леко разклащане за една нощ при 4 ° С.
  • Добави или протеин А или G агарозни перли (20 ul от 50% суспензия топчета). Инкубира се при леко разклащане в продължение на 1-3 часа при 4 ° С.
  • Микроцентрофуга за 30 секунди при 4 ° С. Промива се утаят пет пъти с 500 ul на 1Х клетъчен лизисен буфер. Съхранявайте на лед по време на промивки.
  • Ресуспендирайте утайката с 20 ul 3X SDS пробен буфер. Vortex, тогава микроцентрофугиращи за 30 секунди.
  • Загрява пробата с 95-100 ° С в продължение на 2-5 минути и микроцентрофуга в продължение на 1 минута, при 14 000 х г.
  • Заредете пробата (15-30 ul) на SDS-PAGE гел (12-15%).
  • Анализ на проба чрез Western блотинг.

Свържете се с нас / Попитай за повече информация

Свържете се с нас за вашите изисквания за обработка. Ние ще ви препоръча най-подходящите настройки и обработка на параметрите за вашия проект.





Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,


Още Соникацията протоколи

Western блот анализ с ултрасоникатор UP50H

След протокол се използва в изследване на Kriebisch и сътр. (2011):
Общо протеин се изолира от MC3T3-Е1 клетки, третирани с 1,25 (ОН)2д3 (10-8 М) или преносител. Клетките се лизират с буфер, съдържащ 50 тМ Tris-HCl, рН 8 (Sigma-Aldrich); 150 тМ NaCl (Fisher Scientific); 0.1% натриев додецил сулфат (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0.5% натриев деоксихолат (Merck). Клетъчният лизат се обработва с ултразвук в продължение на 2 х 10 е в цикъл 1 и амплитуда 80 с UP50H Ултразвуков Процесор (Hielscher, ултразвукова технология, Teltow, Германия). След това материалът се центрофугира за 10 минути при 14,000 rpm и супернатантата се използва за Western blotting. Двадесет и пет μg белтък се кипват в буфер за проби и редуциращо средство (Invitrogen) и след това се разделят чрез SDS-PAGE, използвайки 4-12% полиакриламидни гелове (Invitrogen) и се пренасят в нитроцелулозна мембрана (GE health care). Мембраната се блокира 1 h с TBS (10 mM Tris-HCl, рН 7.6, 150 тМ NaCl), съдържащ 1% казеин (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 М). След блокиране, мембраната се инкубира с леко разбъркване в продължение на една нощ при 4 ° С с първичното антитяло (заешки анти-човешки CBS 1/500, развит в лабораторията на проф. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, САЩ). Инкубирането с вторично антитяло, конюгирано с хрян пероксидаза (HPR) (Dako), се провежда в продължение на 1 час при стайна температура. Всички проби се развиват чрез засилена хемилуминесценция (Perkin Elmer).

Позоваването литература /



За Western Blotting

Блотовете са аналитични процедури, където ДНК, РНК и протеини се прехвърлят върху носител, така че те могат да се разделят.
Южно петно ​​се използва за откриване на ДНК, на Northern Blot за РНК и Western Blot за протеини.
Western блотинг също се нарича протеин имуноблотинг защото антитяло се използва за специфично откриване на неговия антиген. В Western Blotting е един от най-важните методи за анализ за откриване на специфични протеини в пробата. В Western Blot, протеините са имобилизирани върху мембрани да бъдат открити с помощта на моноклонални или поликлонални антитела.
Чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE) естествените протеини се разделят чрез 3-D структура или денатурирани протеини по дължината на полипептида. След това протеините се прехвърлят в мембрана (обикновено нитроцелулоза или PVDF), където се оцветяват с антитела, специфични за целевия протеин. Етапът на гел електрофореза е включен в Western blot анализ, за ​​да се разреши въпросът за кръстосаната реактивност на антителата.
След това отделените протеини се поставят върху матрица (най-вече върху нитроцелулозна или PVDF мембрана), където се оцветяват с антитела. Антителата функционират като проба и се избират специфично за целевия протеин. Анализът на местоположението и интензитета на специфичната реакция разкрива подробности за експресията на целевите протеини в дадена проба. Western blotting може да открие целеви протеин, който е толкова нисък, колкото 1 ng, поради високата резолюция на геловата електрофореза и силната специфичност и висока чувствителност на имуноанализ. Методът Western blot се използва в областта на молекулярната биология, биохимията, имуногенетиката и други области на молекулярното изследване.
Други свързани техники включват точка блот анализ, имунохистохимия и имунохистохимия, когато антитела се използват за откриване на протеини в тъканите и клетките чрез имунооцветяване, и ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter за ултразвукова препаративна проба

Свържете се с нас! / Попитай ни!





Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,


Sonication е важна стъпка по време на подготовката на пробите

UP200St с микро-накрайник за проба ултразвук