Ултразвуков лизис за Western Blotting

• Западният блот е аналитична процедура за откриване на специфични протеини в проба от тъканен хомогенат или клетъчен екстракт.
• За да се направи западен блот или да се измери ензимната активност, много анализи изискват достъп до материалите (напр. протеини, ДНК, субклетъчни фрагменти), уловени в клетката.
• Соникацията е надежден и лесен за работа метод за контролирано разрушаване на клетките и лизис.

Ултразвуково разрушаване на клетките

Извличането на протеини от тъкани и култивирани клетки е първата стъпка за много биологични, биохимични и аналитични техники (PAGE, Western blotting, ELISA, масспектрометрия и др.) или пречистване на протеини. За да се получи висок добив на протеин, клетъчният материал и тъканта трябва да бъдат ефективно разрушени/лизирани. Независимо дали става въпрос за растителна или животинска тъкан, ултразвукът е методът за лесно и бързо приготвяне на клетъчен лизат.

Предимства на Sonication

• Бърз & Ефикасен
• Лесна работа
• висок добив на протеини
• възпроизводим/повторяем
• прецизно контролиран
• Мащабируеми

Протокол за имунопреципитация за Western Immunoblotting

А. Реактиви

За приготвянето на разтворите използвайте пречистена вода като Milli-Q.

• 1X фосфатен буфериран физиологичен разтвор (PBS)
• 1X буфер за клетъчен лизис: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM натриев пирофосфат, 1 mM β-глицерофосфат, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Леупептид
  Важно: Добавете 1 mM PMSF непосредствено преди употреба.
• 15 μl протеин A+15 μl протеин G е достатъчен за IP, но може да зависи от вашето първично антитяло и обема на пробата. Можете също така да използвате предварително смесен протеин A/G агароза (напр. протеин A за заешки IgG pull down и протеин G за мишка IgG pull down)
• 3X SDS буфер за проба: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% w/v SDS, 30% глицерол, 150 mM DTT, 0,03% w/v бромофенолно синьо

Б. Приготвяне на клетъчни лизати

• Съберете клетките. За да събирате клетки при условия без денатурация, отстранете флуидите и изплакнете клетките веднъж с ледено студен PBS.
• Отстранете PBS и добавете 0,5 ml ледено студен буфер за лизис на клетки 1X към всяка чиния (10 см) и инкубирайте плочите върху лед за 5 минути.
• Изстържете клетките от плочите и ги прехвърлете в епруветки за микроцентрофуга. Дръжте на лед.
• Соникирайте два пъти в продължение на 10 секунди в леденостуден имунопреципитационен буфер (IP буфер: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 и сместа от протеазни инхибитори). За ултразвук ФлаконВисокоговорител за високи честоти или ултразвуков сонда като UP100H или UP200Ht са най-подходящи.
• Центрофугирайте лизатите при 15 000 g за 10 минути при 4°C.
• Прехвърлете супернатанта в нова епруветка. (Ако е необходимо, лизатът може да се съхранява при –80°C.)
• Добавете първичното антитяло към супернатанта. Супернатантът с първичното антитяло се инкубира в продължение на 1 час при 4°C при леко разбъркване. Първичното антитяло обикновено се добавя в количество, 10 пъти по-концентрирано, отколкото се използва за уестърн блотинг. (Можете да започнете с 1 μg на 100 μL.)
• След това супернатантата се инкубира допълнително със сместа от равни количества протеин А-агароза (Invitrogen) и протеин G агароза за още 1 час.
• Измийте агарозните пелети три пъти с IP буфер. След това се извличат свързаните протеини с буфера за зареждане SDS-PAGE чрез нагряване при 95°C в продължение на 5 минути.

В. Имунопреципитация

• Вземете 200 μl клетъчен лизат и добавете първично антитяло. Инкубира се с леко люлеене през нощта при 4°C.
• Добавете протеин А или G агарозни мъниста (20 μl 50% каша от мъниста). Инкубира се с леко люлеене в продължение на 1–3 часа при 4°C.
• Микроцентрофугата за 30 секунди при 4°C. Измийте пелетите пет пъти с 500 μl 1X клетъчен лизисен буфер. Дръжте на лед по време на измиване.
• Ресуспендирайте пелетите с 20 μl 3X SDS буфер за проби. Вихър, след това микроцентрофуга за 30 секунди.
• Загрейте пробата до 95–100°C за 2–5 минути и микроцентрофугата за 1 минута при 14 000 X g.
• Заредете пробата (15–30 μl) върху SDS-PAGE гел (12–15%).
• Анализирайте пробата чрез западно попиване.

Анализ на Western Blot с Sonicator UP50H

Следващият протокол с помощта на сондовия ултразвук UP50H е използван при изследване на Kriebisch et al. (2011):
Общият протеин е изолиран от MC3T3-E1 клетки, третирани с 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) или превозно средство. Клетките са лизирани с буфер, съдържащ 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% натриев додецил сулфат (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% натриев дезоксихолат (Merck). Клетъчният лизат е ултразвук за 2 × 10 s при цикъл 1 и амплитуда 80 с Ултразвуков процесор UP50H (Hielscher, Ултразвукова технология, Телтов, Германия). След това материалът се центрофугира за 10 минути при 14 000 оборота в минута и супернатантата се използва за уестърн попиване. Двадесет и пет μg протеин се сваряват в пробен буфер и редуциращ агент (Invitrogen) и впоследствие се отделят от SDS-PAGE с помощта на 4-12% полиакриламидни гелове (Invitrogen) и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана (GE health care). Мембраната е блокирана за 1 час с TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl), съдържащ 1% казеин (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). След блокиране мембраната се инкубира с леко разбъркване през нощта при 4°C с първичното антитяло (заешки античовешки CBS 1/500, разработен в лабораторията на проф. Инкубация с конюгирано вторично антитяло (Dako) с хрян пероксидаза (HPR) е извършена в продължение на 1 час при стайна температура. Всички петна са разработени чрез повишена хемилуминесценция (Perkin Elmer).
 

Кликнете тук, за да прочетете повече за най-добрите практики за ултразвуков клетъчен лизис и екстракция, подготовка на лизат и препоръки за подобряване на процеса!
 
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови апарати с лабораторен размер:

Литература / Препратки