Ултразвуков лизис за уестърн блотинг

• Уестърн блотът е аналитична процедура за откриване на специфични протеини в проба от тъканен хомогенат или клетъчен екстракт.
• За извършване на уестърн блот или измерване на ензимна активност много анализи изискват достъп до материалите (напр. протеини, ДНК, субклетъчни фрагменти), затворени в клетката.
• Ултразвуковата обработка е надежден и лесен за прилагане метод за контролирано разрушаване на клетките и лизис.

Ултразвуково разрушаване на клетките

Извличането на протеини от тъкани и култивирани клетки е първата стъпка при много биологични, биохимични и аналитични техники (PAGE, уестърн блотинг, ELISA, масспектрометрия и др.) или при пречистване на протеини. За да се получи висок добив на протеини, клетъчният материал и тъканта трябва да бъдат ефективно разрушени/ лизирани. Независимо дали става въпрос за растителна клетка или животинска тъкан, ултразвуковата обработка е методът за лесно и бързо приготвяне на клетъчен лизат.

Предимства на ултразвуковата обработка

• бърза и ефективна
• лесна работа
• висок добив на протеини
• възпроизводима/ повторяема
• прецизно контролирана
• мащабируема

Протокол за имунопреципитация за уестърн имуноблотинг

A. Реагенти

За приготвяне на разтворите използвайте пречистена вода, например Milli-Q.

• 1X фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS)
• 1X буфер за клетъчен лизис: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM натриев пирофосфат, 1 mM β-глицерофосфат, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml леупептин
  Важно: Добавете 1 mM PMSF непосредствено преди употреба.
• 15 μl протеин A+15 μl протеин G са достатъчни за IP, но това може да зависи от първичното антитяло и обема на пробата. Можете също да използвате предварително смесена агароза с протеини A/ G (напр. протеин A за афинитетно улавяне на заешки IgG и протеин G за афинитетно улавяне на миши IgG)
• 3X SDS буфер за проби: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% w/v SDS, 30% глицерол, 150 mM DTT, 0,03% w/v бромфенолово синьо

B. Приготвяне на клетъчни лизати

• Съберете клетките. За да съберете клетките при неденатуриращи условия, отстранете хранителната среда и промийте клетките веднъж с ледено студен PBS.
• Отстранете PBS и добавете 0,5 ml ледено студен 1X буфер за клетъчен лизис към всяка плака (10 cm), след което инкубирайте плаките върху лед за 5 минути.
• Остържете клетките от плаките и ги прехвърлете в микроцентрофужни епруветки. Дръжте ги върху лед.
• Обработете с ултразвук два пъти по 10 секунди в ледено студен буфер за имунопреципитация (IP буфер: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 и сместа от протеазни инхибитори). За ултразвукова обработка VialTweeter или ултразвуков апарат със сонда, като UP100H или UP200Ht, са най-подходящи.
• Центрофугирайте лизатите при 15 000 g за 10 минути при 4°C.
• Прехвърлете супернатанта в нова епруветка. (Ако е необходимо, лизатът може да се съхранява при –80°C.)
• Добавете първичното антитяло към супернатанта. Супернатантът с първичното антитяло се инкубира за 1 h при 4°C с леко разклащане. Първичното антитяло обикновено се добавя в концентрация 10x по-висока от използваната за уестърн блотинг. (Можете да започнете с 1μg на 100μL.)
• След това супернатантът се инкубира допълнително със смес от равни количества агароза с протеин A (Invitrogen) и агароза с протеин G за още 1 h.
• Промийте агарозните утайки три пъти с IP буфер. След това извлечете свързаните протеини с буфера за зареждане при SDS-PAGE чрез нагряване при 95°C за 5 минути.

C. Имунопреципитация

• Вземете 200 μl клетъчен лизат и добавете първично антитяло. Инкубирайте с леко люлеене през нощта при 4°C.
• Добавете агарозни микросфери с протеин A или G (20 μl от 50% суспензия на микросфери). Инкубирайте с леко люлеене за 1–3 часа при 4°C.
• Микроцентрофугирайте за 30 секунди при 4°C. Промийте утайката пет пъти с 500 µl 1X буфер за клетъчен лизис. Дръжте върху лед по време на промиванията.
• Ресуспендирайте утайката с 20 μl 3X SDS буфер за проби. Разбъркайте на вортекс, след което микроцентрофугирайте за 30 секунди.
• Нагрейте пробата до 95–100°C за 2–5 минути и микроцентрофугирайте за 1 минута при 14 000 X g.
• Заредете пробата (15–30 μl) върху SDS-PAGE гел (12–15%).
• Анализирайте пробата чрез уестърн блотинг.

Уестърн блот анализ с ултразвуковия апарат UP50H

Следният протокол с ултразвуковия апарат със сонда UP50H е използван в изследването на Kriebisch и съавт. (2011):
Общият протеин е изолиран от клетки MC3T3-E1, третирани с 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) или разтворителя носител. Клетките са лизирани с буфер, съдържащ 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% натриев додецилсулфат (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) и 0,5% натриев дезоксихолат (Merck). Клетъчният лизат е обработен с ултразвук за 2 × 10 s при цикъл 1 и амплитуда 80 с ултразвуковия процесор UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Телтов, Германия). След това материалът е центрофугиран за 10 min при 14 000 rpm и супернатантът е използван за уестърн блотинг. Двадесет и пет μg протеин са кипнати в буфер за проби с редуциращ агент (Invitrogen), след което са разделени чрез SDS-PAGE с използване на 4–12% полиакриламидни гелове (Invitrogen) и прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана (GE health care). Мембраната е блокирана за 1 h с TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), съдържащ 1% казеин (Sigma-Aldrich) и 1% Tris (1 M). След блокирането мембраната е инкубирана с леко разклащане през нощта при 4°C с първичното антитяло (заешко антитяло срещу човешка CBS 1/500, разработено в лабораторията на проф. R. Banerjee, Ан Арбър, MI, САЩ). Инкубацията със вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (HPR) (Dako), е извършена за 1 h при стайна температура. Всички блотове са проявени чрез усилена хемилуминесценция (Perkin Elmer).
 

Щракнете тук, за да прочетете повече за най-добрите практики за ултразвуков клетъчен лизис и екстракция, приготвяне на лизати и препоръки за подобряване на процесите!
 
Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати:

Литература / Източници

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.