Ултразвукова подготовка на проби от C. elegans

C. elegans, червей нематода, е широко използван моделен организъм в биологията. Подготовката на пробата преди анализ изисква лизис, екстракция на протеини и липиди, както и фрагментация на РНК, която може да бъде надеждно извършена чрез ултразвук. Ултразвуковите клетъчни разрушители са надеждни, сложни и лесни за използване устройства за бързо приготвяне на проби от C. elegans.

Ултразвукова подготовка на проби от C. elegans

C. elegans са кръгли червеи, които се използват широко в изследователски лаборатории за изследване на геномиката, биологията на развитието и болестите. Много гени в генома на C. elegans имат функционални аналози при хората. По този начин червеят нематода е изключително полезен модел за човешки заболявания. Други предимства за широкото използване на C. elegans са лесното и евтино отглеждане върху плаки, съдържащи бактерии (напр. E. coli), прозрачността, удобното боравене, както и възможността за замразяване и съхранение на червеите за по-дълъг период.
Протеиновият и липидният анализ са редовни процедури в лабораториите, а ултразвуковата подготовка на проби е установеният метод за лизиране на нематоди на C. elegans във всеки етап от развитието (т.е. ембриони, ларви L1-L4, възрастни). Тъй като C. elegans се използва и като система за експресия на протеини за свръхекспресия на целеви протеини, е необходим надежден, възпроизводим метод за лизис и екстракция на протеини, който дава високи добиви на протеини. Ултразвуковите системи за разрушаване и екстракция на клетки се предлагат като хомогенизатори тип сонда и като ултразвукораздвижници с няколко проби. Обслужвайки удобната подготовка на пробите и всички видове размери на пробите, Hielscher Ultrasonics разполага с идеалния ултразвуков разрушител на клетки за вашата лабораторна процедура.

Ултразвукови протоколи за разрушаване и лизис на C. elegans

Ултразвуковата хомогенизация и лизис на C. elegans и последващата екстракция на протеини и липиди могат да се извършват с помощта на различни процедури, като се използват различни хомогенизиращи и лизисни буфери и др. Всички протоколи за лизис имат общото е, че пробите трябва да се държат непрекъснато върху лед, за да се предотврати разграждането на протеините. По-долу ви представяме някои надеждни и бързи протоколи за ултразвуков лизис и екстракция за приготвяне на висококачествени проби, съдържащи протеини или липиди.

Предимства на ултразвуковия C. elegans Lysis

• Надежден
• Възпроизводими
• прецизно контролирана температура
• надежден контрол на процеса
• Нежен метод
• лесен за нанасяне
• Безопасен

Ултразвукова екстракция на протеин от проби от C. elegans

Ултразвуков лизис и екстракция на протеини от червеи C. elegans могат да се извършват по различни протоколи. По-долу ви представяме няколко надеждни и бързи протокола за лизис за възпроизводими резултати от екстракция на протеини.

Бърза подготовка на цитозолен екстракт от червеи C. elegans чрез соникация

Със следния протокол можете да приготвите лизати на C. elegans за по-малко от 30 минути.
Колекция от C. elegans
Изберете желаните червеи C. elegans в 1,5 ml туба с фосфатен буфериран физиологичен разтвор (PBS) или ги измийте от чиния с 1,5 ml PBS. Центрофугата за 1 минута при 2000 оборота в минута до пелети. Дръжте пробите през цялото време върху лед.
След това измийте червеите два пъти с PBS.
След това измийте червеите два пъти с ddH₂O.
Ресуспендирайте червеите в поне 500 ul хомогенизационен буфер (HB). Пробите от червеи вече са готови за ултразвуков лизис.
За по-високо качество на протеиновия екстракт може да искате да намалите бактериалното замърсяване, като измиете червеите за 5 минути всеки в PBS и стерилна, ултра чиста вода (ddH₂O) или извършване на плаване със захароза. Дръжте пробите от червеи непрекъснато върху лед.

Ултразвуков протокол за лизис на C. elegans

• Уверете се, че сте подготвили ултразвуковия хомогенизатор предварително, така че ултразвуковият хомогенизатор да е готов за употреба (монтирана сонда, предварително зададена програма за ултразвук).

Ако вашият ултразвуков уред е монтиран в стойка, поставете ледената баня с вашите епруветки за проби под ултразвуковата сонда и поставете ултразвуковата сонда в епруветка от 1,5 ml.

• За лизис на C. elegans с UP200St или UP200Ht, ултразвукът трябва да се извърши с помощта на микронакрайник (напр. 2 мм сонда S26d2; вижте снимката вляво) при 40% амплитуда за 1 секунда с 30 секунди паузи между тях. 5 цикъла на ултразвук за всяка 1 секунда с 30-секундни паузи са идеални за лизис на C. elegans. Ако извършвате лизиса за първи път, можете да проверите прогресията на лизиса в малки аликвотни части на пробата след всеки импулс с помощта на микроскоп.
• Лизисът завършва успешно, когато червеите са нарушени. Прекомерната ултразвук води до счупване на ядрата и става видима, когато пробата стане вискозна или се разпени. За да предотвратите разграждането на пробата, използвайте повече импулси, ако е необходимо. Не увеличавайте времето на всеки ултразвуков импулсен цикъл, за да получите висококачествени протеинови екстракти.
• Изчистете клетъчния лизат чрез центрофугиране на ултразвуково лизираните червеи при 14 000 оборота в минута за 10 минути при 4ºC.
• След това прехвърлете супернатантата в прясна епруветка и се подгответе за имунопреципитация или други анализи.

Забележка за хомогенизиращия буфер: Подгответе хомогенизиращия буфер за протокола за ултразвуков лизис по-горе, както следва:

Високопроизводителен лизис на C. elegans в 96-ямкови плочи с помощта на UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (възрастни нематоди)
UIP400MTP 80% амплитуда, 20 цикъла (всеки цикъл на ултразвук: 30 секунди ВКЛ., 30 сек ИЗКЛ.)
Лизис буфер:

• Вариант 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Вариант 2) за коимунопреципитация (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (коктейл от инхибитор на пълната протеиназа)

Високопроизводителна фрагментация на ДНК
ДНК на C. elegans (възрастни нематоди) 200-300bp: UIP400MTP плачен ултразвук – задайте 80% амплитуда, 30 импулса – всеки 30 секунди включен, 30 секунди изключен

UIP400MTP Plate Sonicator за високопроизводителна подготовка на проби равномерно ултразвука в многоямкови, микротитърни плочи и 96-ямкови пластини

Ултразвуков лизис на C. elegans за количествени анализи за пречистване на афинитет

Ембрионите на C. elegans (∼2 милиона на реплика) са прясно събрани в биологичен триекземпляр чрез избелване на млади гравидни хермафродити и ултразвук върху лед (цикъл: 0,5 s, амплитуда: 40–45%, 5 удара/сесия, 5 сесии, интервал между сесиите: 30 s; Ултразвуков процесор UP200S с микронакрайник S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в лизисен буфер (общ обем: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% глицерол, смес от инхибитори на протеазата, 0,1% заместител на Nonidet P-40). След ултразвука Noidet P-40 Substitute се добавя до 1% и лизатите се инкубират с въртене на главата над опашката при 4°C в продължение на 30 минути, последвано от центрофугиране при 20 000 × g за 20 минути при 4°C. След това изчистеният лизат се аспирира, без да се нарушава горният липиден слой, и се разделя наполовина на анти-GFP агарозни перли или блокирани контролни перли (40–50 μl). След завъртане на главата над опашката при 4°C в продължение на 60—90 min, перлитата се измиват веднъж с лизисен буфер, съдържащ 0,1% Nonidet P-40 заместител, последвано от двукратно промиване в буфер I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) или буфер II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) или и двете. За изтегляния GFP:MBK-2 са извършени два отделни експеримента, използващи различни условия на пране. Протеините са елуирани чрез орбитално разклащане в 50 μl 6 m урея/2 M тиукарбамид при стайна температура. За експериментите с изтегляне на MBK-1::GFP протеините са елуирани два пъти чрез разклащане в 50 μl 8 m гуанидиниев хлорид при 90°C, последвано от утаяване на етанол. След това елутираните протеинови проби се усвояват в разтвор.
(срв. Chen et al., 2016)

Ултразвукова хомогенизация и лизис на червеи

За процедурата за лизис на C.elegans и екстракция на протеин 30 000 немотоди от съответния стадий се събират на проба и се измиват в ледено студен S-базал, концентрират се чрез центрофугиране при 1500 оборота в минута за 2 минути, промиват се шест пъти с ледено студен S-базал, за да се отстранят остатъчните бактерии, и след това се съхраняват върху лед до готовност за употреба. За извличане на протеини, възрастните червеи са оставени да образуват компактни пелети след последното S-базално измиване. След това гранулите от червеи са ресуспендирани в 1 ml леденостуден екстракционен буфер [20 mM калиев фосфат, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, протеазни инхибитори (Sigma P2714)] и се обработват незабавно.
∼30 000 възрастни червея (съответстващи на ∼100 mg мокро тегло) са ултразвукови звук върху лед с помощта на ултразвуков звук тип сонда (напр. UP50H с микронакрайник MS2) при 40% амплитуда за 10 цикъла по 3 секунди включено, 30 секунди изключено, в 1 ml леденостуден буфер за екстракция. (срв. Baskharan et al. 2012)

Ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans

В липидомията, клон на метаболомиката, се характеризира и анализира липидният комплемент на биологичните системи. C. elegans се използват широко в липидомията за изследване на взаимодействието на метаболитните липиди и техните ефекти върху здравето и продължителността на живота.
Ултразвуковият лизис и екстракция се използват за освобождаване на липиди като сфинголипиди от ембриони, ларви и възрастни червеи на C. elegans. Ултразвукът се използва за приготвяне на хомогенати на червеи и впоследствие за извличане на липидите от пробата.
Протокол за ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans
Размразете пелетите C. elegans върху лед и ресуспендирайте с 0,5 ml ултравода. 
Соникирайте пробите от C. elegans в епруветки от 1,5 ml, като същевременно държите пробите непрекъснато върху лед.
Сондирането може да се извърши с помощта на сонда-ултразвуков тор като UP200Ht, ултразвуковото устройство за подготовка на проби ФлаконВисокоговорител за високи честоти (едновременно ултразвук на 10 проби) или UIP400MTP (за ултразвукова обработка на многоямкови плаки, като например 96-ямкови плаки). За ултразвуков анализ с UP200Ht използвайте микронакрайника S26d2. Предварително задайте режима на ултразвуков цикъл в цифровото меню. Задайте амплитуда на 10% и режим на ултразвуков цикъл от 2 секунди импулси от 20 цикъла с пауза от 30 секунди между всеки ултразвуков пулсационен взрив.
Прехвърлете супернатантите в стъклени тръби с винтова капачка. 
Извършете екстракция на Folch, като добавите 1 ml ултравода към всяка стъклена епруветка, последвано от добавяне на 6 ml смес хлороформ/метанол (съотношение = 2:1) към всяка стъклена епруветка.
Завъртете всяка стъклена тръба за 30 секунди за 4 пъти. 
Центрофугирайте епруветките при 1,258 x g за 15 минути (Eppendorf, 5810 R), за да подобрите допълнително разделянето на фазите. 
Прехвърлете долната хидрофобна фракция в чиста стъклена тръба чрез стъклена пипета на Пастьор. 
Изсушете долната хидрофобна фракция под азотен поток в азотен изпарител. 
Съхранявайте изсушените пелети във фризер -80 °C до употреба.

Ултразвуково приготвяне на листи

Червеен лизат: Червеите от стадий L4 са събрани и измити три пъти с буфер M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂ОП₄, 85,56 mM NaCl и 0,87 mM MgSO₄), за да се премахнат всички бактерии. След отстраняване на възможно най-голяма част от буфера M9, червеите са ресуспендирани в лизисния буфер: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM фосфат β-глицерол, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM натриев флуорид, 1 mM натриев ортованадат, 5 mM натриев пирофосфат, 0,2 mM фенилметансулфонилфлуорид и протеазен инхибитор. Червеите се замразяват в течен азот и се размразяват при 37°C за три пъти, след което червеите се озвукват върху сух лед с ултразвуков VialTweeter за едновременно приготвяне на 10 епруветки за проби. Уникирането се извършва при 50% амплитуда в 10 цикъла по 2 сек с 30 сек пауза между изблиците на ултразвук. След това пробите се центрофугират при 12000 об/мин при 4°C за 15 минути. Супернатантът се събира и съхранява при -70°C. За количествено определяне на протеина е използвана аликвотна част от анализа на Брадфорд.
Определяне на общия глутатион, GSH и GSSG: За количествено определяне на глутатиона, лизатите и определянето са направени в същия ден. Ларвите на L4, хранени с глюкоза и контролни L4, бяха събрани и измити с буфер M9 три пъти. След отстраняване на възможно най-много от буфера на M9, червеите се ресуспендират в ледено студена метафосфорна киселина (5% w/v), след което червеите се овлажняват в лед с ултразвуков флакон с високоговорител с 50% амплитуда в десет цикъла на ултразвук от 2 секунди с 30 сек. пауза между всеки цикъл. След това се центрофугира при 12000 об/мин при 4 ̊C за 15 минути.
(срв. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Подготовка на проба преди имунопреципитация и Western Blotting

Накратко, за ембрионални екстракти, ларвите на C. elegans L1 се отглеждат в мащабни течни S-средни култури до зряла възраст. Ембрионите са събрани по стандартния метод на избелване и суспендирани в буфер за лизис (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% глицерол, 0,05% NP-40, 1 коктейл от инхибитор на протеазата и 1 коктейл от инхибитор на фосфатазата I и II), бързо замразени в течен азот и лизирани чрез ултразвуково разрушаване на клетките с помощта на ултразвуков инхибитор с микронакрайник като UP200Ht с S26d2 за 10 импулса за 10 сек при 30% амплитуда. Ако трябва да се подготвят по-голям брой проби, ултразвукът ФлаконВисокоговорител за високи честоти или се препоръчват UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator за кладенци. След ултразвука екстрактите са предварително изчистени чрез центрофугиране при 30 000 g за 20 минути при 4°C. Предварително изчистеният екстракт (300 μg от общия протеин) е инкубиран с 40 μ изискано антитяло (това проучване), омрежено с протеин А-агароза, или като контрола, подобно количество заешки имуноглобулин (Ig)G, омрежен с протеин А-агароза, е използвано в общ обем от 200 μl лизисен буфер, съдържащ 1% NP-40, чието включване намалява неспецифичното свързване на протеините с матрицата. Пробите се завъртат в продължение на 1 час при 4°C, зърната се измиват три пъти с лизисен буфер и се елуират с 30 μl глицин/HCl и 200 mM NaCl, pH 2.2. След имунопреципитация, елуатите се разреждат в 30 μ и се нагряват до 95 ° C в продължение на 4 минути и обикновено 3% от общото количество за вход и 30% за елуатите се прилагат върху SDS-PAGE, последвано от Western blotting с анти-CDC-25.1 (1:400), анти-LIN-23 (1:750), анти-убиквитин (1:1000), анти-GSK3 или анти-YES β-актин (1:2000) антитела. Когато екстрактите не са били подложени на имунопреципитация, същото количество общ протеин, получен от тези екстракти, се ресуспендира в SDS буфер за проби, нагрява се до 95°C и след това директно се прилага върху SDS-PAGE и се анализира чрез Western blotting. (срв. Segref et al. 2020)

Ултразвуков лизис под контрол на температурата

Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури инициират термично индуцирано разграждане на протеини в пробите.
Както всички механични техники за подготовка на проби, ултразвукът създава топлина. Температурата на пробите обаче може да се контролира добре, когато използвате VialTweeter. Представяме ви различни опции за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте с VialTweeter и VialPress за анализ.

1. Следене на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и сензор за температура, който може да се включи. Включете температурния сензор в UP200St и поставете върха на температурния сензор в една от епруветките за проби. Чрез цифров цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St специфичен температурен диапазон за ултразвука на вашата проба. Ултразвуковият уред автоматично ще спре при достигане на максималната температура и ще направи пауза, докато температурата на пробата спадне до по-ниската стойност на зададената температурна ∆. След това ултразвукът започва автоматично отново. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, предизвикано от топлина.
2. Блокът VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блока VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилника или фризера, за да охладите предварително титаниевия блок помага за отлагане на повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да бъде предварително охладена.
3. Използвайте сух лед за охлаждане по време на ултразвук. Използвайте плитка тава, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter върху сухия лед, така че топлината да може бързо да се разсее.

Намерете оптималния ултразвуков клетъчен разрушител за вашето приложение за лизис

Hielscher Ultrasonics е дългогодишен производител на високоефективни ултразвукови клетъчни разрушители и хомогенизатори за лаборатории, настолни и индустриални системи. Размерът на вашата бактериална клетъчна култура, вашата изследователска или производствена цел и обемът на клетката за обработка на час или ден са основни фактори за намиране на правилния ултразвуков клетъчен разрушител за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременно ултразвуково озвучаване на множество проби (до 10 флакона), както и масови проби (т.е. микротитърни плаки / 96-ямкови плаки), класически лабораторен ултразвуков ултразвук тип сонда с различни нива на мощност от 50 до 400 вата до напълно индустриални ултразвукови процесори с до 16 000 вата на единица за търговско разрушаване на клетки и екстракция на протеини в големи производства. Всички ултразвукови апарати Hielscher са създадени за работа 24/7/365 при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично протоколиране на данни, които превръщат ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лабораторни и производствени помещения.
Кажете ни какви клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате биологичните си проби. Ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков разрушител на клетки за вашите изисквания на процеса.

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови системи от компактни ръчни хомогенизатори и ултразвукови ултразвукови процесори MultiSample до индустриални ултразвукови процесори за търговски приложения: