Ултразвукова подготовка на проби от C. Elegans

C. elegans, нематоден червей, е широко използван моделен организъм в биологията. Подготовката на пробите преди анализ изисква лизис, екстракция на протеини и липиди, както и фрагментация на РНК, които могат надеждно да се извършат чрез ултразвукова обработка. Ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките са надеждни, усъвършенствани и лесни за използване устройства за бърза подготовка на проби от C. elegans.

Ултразвукова подготовка на проби от C. elegans

Caenorhabditis elegans са кръгли червеи, които се използват широко в изследователските лаборатории за изучаване на геномиката, биологията на развитието и заболяванията. Много гени в генома на C. elegans имат функционални аналози при хората. Това прави нематодния червей изключително полезен модел за човешки заболявания. Други предимства, обуславящи широкото използване на C. elegans, са лесното и евтино култивиране върху плаки, съдържащи бактерии (напр. E. coli), прозрачността, удобната работа с тях, както и възможността червеите да се замразяват и съхраняват за по-дълъг период.
Анализът на протеини и липиди е рутинна процедура в лабораториите, а ултразвуковата подготовка на проби е утвърденият метод за лизис на нематодите C. elegans във всеки стадий на развитие (т.е. ембриони, ларви L1–L4, възрастни индивиди). Тъй като C. elegans се използва и като система за експресия на протеини за свръхекспресия на целеви протеини, е необходим надежден, възпроизводим метод за лизис и екстракция на протеини, който осигурява висок добив на протеини. Ултразвуковите системи за разрушаване на клетките и екстракция се предлагат като хомогенизатори със сонда и като ултразвукови апарати за множество проби. За удобна подготовка на проби с всякакви обеми и във всякакъв брой Hielscher Ultrasonics предлага идеалното ултразвуково устройство за разрушаване на клетките за вашата лабораторна процедура.

Ултразвукови протоколи за разрушаване и лизис на C. Elegans

Ултразвуковата хомогенизация и лизис на C. elegans и последващата екстракция на протеини и липиди могат да се извършват по различни процедури с различни буфери за хомогенизация и лизис и др. Общото за всички протоколи за лизис е, че пробите трябва непрекъснато да се държат върху лед, за да се предотврати разграждането на протеините. По-долу представяме няколко надеждни и бързи протокола за ултразвуков лизис и екстракция за подготовка на висококачествени проби от C. elegans, съдържащи протеини или липиди.

Предимства на ултразвуковия лизис на C. elegans

• надежден
• възпроизводим
• с прецизен контрол на температурата
• надежден контрол на процеса
• щадящ метод
• лесен за прилагане
• безопасен

Ултразвукова екстракция на протеини от проби от C. elegans

Ултразвуковият лизис и екстракцията на протеини от червеи C. elegans могат да се извършват по различни протоколи. По-долу представяме няколко надеждни и бързи протокола за лизис, които осигуряват възпроизводими резултати при екстракцията на протеини.

Бързо приготвяне на цитозолен екстракт от червеи C. elegans чрез ултразвукова обработка

Със следния протокол можете да приготвите лизати от C. elegans за по-малко от 30 минути.
Събиране на C. elegans
Прехвърлете желаните червеи C. elegans в епруветка от 1,5ml, съдържаща фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS), или ги отмийте от плака с 1,5ml PBS. Центрофугирайте за 1min при 2000rpm, за да се образува утайка. Дръжте пробите през цялото време върху лед.
След това промийте червеите два пъти с PBS.
После промийте червеите два пъти с ddH₂O.
Ресуспендирайте червеите в най-малко 500ul буфер за хомогенизация (HB). Пробите от червеи вече са готови за ултразвуков лизис.
За по-високо качество на протеиновия екстракт можете да намалите бактериалното замърсяване, като промивате червеите по 5min в PBS и в стерилна, ултрачиста вода (ddH₂O), или да извършите флотация в захарозен разтвор. Дръжте пробите от червеи непрекъснато върху лед.

Протокол за ултразвуков лизис на C. elegans

• Уверете се, че сте подготвили ултразвуковия апарат предварително, така че ултразвуковият хомогенизатор да е готов за употреба (монтирана сонда, предварително зададена програма за ултразвукова обработка). 

Ако ултразвуковият ви апарат е монтиран на стойка, поставете ледената баня с епруветките с проби под ултразвуковата сонда и вкарайте ултразвуковата сонда в епруветката от 1,5ml.

• За лизис на C. elegans с UP200St или UP200Ht ултразвуковата обработка трябва да се извършва с микронакрайник (напр. сонда S26d2 с диаметър 2mm; вижте изображението вляво) при 40% амплитуда за 1sec с паузи от 30sec между обработките. 5 цикъла на ултразвукова обработка, всеки по 1 секунда с паузи от 30sec, са идеални за лизис на C. elegans. Ако извършвате лизис за първи път, можете да проверявате напредъка му в малки аликвоти от пробата след всеки импулс с помощта на микроскоп.
• Лизисът е завършил успешно, когато червеите са разрушени. Прекомерната ултразвукова обработка води до разрушаване на ядрата и се проявява, когато пробата стане вискозна или се разпени. За да предотвратите разграждането на пробата, използвайте повече импулси, ако е необходимо. Не увеличавайте продължителността на всеки ултразвуков импулсен цикъл, за да получите висококачествени протеинови екстракти.
• Избистрете клетъчния лизат чрез центрофугиране на ултразвуково лизираните червеи при 14 000rpm за 10min при 4ºC.
• След това прехвърлете супернатанта в нова епруветка и го подгответе за имунопреципитация или други анализи.

Бележка за буфера за хомогенизация: Пригответе буфера за хомогенизация за горния протокол за ултразвуков лизис, както следва:

Лизис на C. elegans с висок капацитет в плаки с 96 ямки с ултразвуковия апарат за плаки UIP400MTP

Лизис на C. elegans (възрастни нематоди)
UIP400MTP 80% амплитуда, 20 цикъла (всеки цикъл на ултразвукова обработка: 30 sec включено, 30 sec изключено)
Буфер за лизис:

• Вариант 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Вариант 2) за коимунопреципитация (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (коктейл от протеиназни инхибитори Complete)

Фрагментация на ДНК с висок капацитет
ДНК от C. elegans (възрастни нематоди) 200–300bp: ултразвуков апарат за плаки UIP400MTP – задайте 80% амплитуда, 30 импулса – всеки с 30sec включено, 30sec изключено

Ултразвуковият апарат за плаки UIP400MTP за подготовка на проби с висок капацитет обработва равномерно с ултразвук проби в плаки с множество ямки, микротитърни плаки и плаки с 96 ямки

Ултразвуков лизис на C. elegans за количествени анализи чрез афинитетно пречистване

Ембриони на C. elegans (∼2 милиона на повторение) бяха събрани непосредствено преди обработката в три биологични повторения чрез третиране с белина на млади хермафродити, носещи яйца, и обработени с ултразвук върху лед (цикъл: 0,5 s, амплитуда: 40–45%, 5 импулса/сесия, 5 сесии, интервал между сесиите: 30 s; ултразвуков процесор UP200S с микронакрайник S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в буфер за лизис (общ обем: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% глицерол, смес от протеазни инхибитори, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). След ултразвуковата обработка беше добавен Nonidet P-40 Substitute до 1% и лизатите бяха инкубирани с въртене с преобръщане при 4°C за 30 min, последвано от центрофугиране при 20 000 × g за 20 min при 4°C. След това избистреният лизат беше аспириран, без да се нарушава горният липиден слой, и разделен на две половини за добавяне съответно към агарозните микросфери с anti-GFP или към блокираните контролни микросфери (40–50 μl). След въртене с преобръщане при 4°C за 60–90 min микросферите бяха промити веднъж с буфер за лизис, съдържащ 0,1% Nonidet P-40 Substitute, последвано от две промивания с буфер I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) или с буфер II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), или и с двата. За афинитетното улавяне на GFP:MBK-2 бяха проведени два отделни експеримента с различни условия на промиване. Протеините бяха елуирани чрез орбитално разклащане в 50 μl 6 m урея/2 M тиоурея при стайна температура. За експериментите с афинитетно улавяне на MBK-1::GFP протеините бяха елуирани два пъти чрез разклащане в 50μl 8 m гуанидиниев хлорид при 90°C, последвано от преципитация с етанол. След това елуираните протеинови проби бяха подложени на ензимно разграждане в разтвор.
(вж. Chen et al., 2016)

Ултразвукова хомогенизация и лизис на червеи

За процедурата за лизис на C.elegans и екстракция на протеини за всяка проба бяха събрани 30 000 нематоди в съответния стадий и промити с леденостуден S-basal, концентрирани чрез центрофугиране при 1500 rpm за 2 min., промити шест пъти с леденостуден S-basal за отстраняване на остатъчните бактерии и след това съхранявани върху лед до употреба. За екстракция на протеини възрастните червеи, носещи яйца, бяха оставени да образуват компактна утайка след последното промиване със S-basal. След това утайките от червеи бяха ресуспендирани в 1 ml леденостуден буфер за екстракция [20 mM калиев фосфат, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, протеазни инхибитори (Sigma P2714)] и обработени незабавно.
∼30 000 възрастни червеи, носещи яйца (съответстващи на ∼100 mg мокра маса), бяха обработени с ултразвук върху лед с ултразвуков апарат със сонда (напр. UP50H с микронакрайник MS2) при 40% амплитуда за 10 цикъла с 3 sec включено, 30 sec изключено, в 1 ml леденостуден буфер за екстракция. (вж. Baskharan et al. 2012)

Ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans

В липидомиката, клон на метаболомиката, се характеризира и анализира съвкупността от липиди в биологичните системи. C. elegans се използва широко в липидомиката за изследване на взаимодействието между метаболитните липиди и техните ефекти върху здравето и продължителността на живота.
Ултразвуковият лизис и екстракция се използват за освобождаване на липиди, като сфинголипиди, от ембриони, ларви и възрастни червеи C. elegans. Ултразвуковата обработка се използва за приготвяне на хомогенати от червеи и впоследствие за екстракция на липидите от пробата.
Протокол за ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans
Размразете утайката от C. elegans върху лед и ресуспендирайте с 0,5 ml ultrawater. 
Обработете с ултразвук пробите от C. elegans в епруветки от 1,5mL, като ги държите непрекъснато върху лед.
Ултразвуковата обработка може да се извърши с ултразвуков апарат със сонда, като UP200Ht, с ултразвуковото устройство за подготовка на проби VialTweeter (едновременна ултразвукова обработка на 10 проби) или с UIP400MTP (за ултразвукова обработка на плаки с множество ямки, като плаки с 96 ямки).
За ултразвуков лизис с UP200Ht използвайте микронакрайника S26d2. Предварително задайте режима на ултразвуковите цикли в цифровото меню. Задайте амплитуда 10% и режим на ултразвукова обработка с импулси от 2 sec за 20 цикъла с пауза от 30 sec. между всеки пакет ултразвукови импулси.
Прехвърлете супернатантите в стъклени епруветки с капачки на винт. 
Извършете екстракция по Folch, като добавите 1 ml ultrawater във всяка стъклена епруветка, последвано от добавяне на 6 ml 
смес от хлороформ/метанол (съотношение = 2:1) във всяка стъклена епруветка.
Разбъркайте всяка стъклена епруветка на вортекс за 30 sec, 4 пъти. 
Центрофугирайте епруветките при 1 258 x g за 15 min (Eppendorf, 5810 R), за да подобрите допълнително разделянето на фазите. 
Прехвърлете долната хидрофобна фракция в чиста стъклена епруветка със стъклена пипета на Pasteur. 
Изсушете долната хидрофобна фракция под поток от азот в азотен изпарител. 
Съхранявайте изсушената утайка във фризер при -80 °C до употреба. 


Ултразвуково приготвяне на лизати от червеи

Лизат от червеи: Червеи в стадий L4 бяха събрани и промити три пъти с буфер M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl и 0,87 mM MgSO₄), за да се отстранят всички бактерии. След отстраняване на възможно най-голямо количество буфер M9 червеите бяха ресуспендирани в буфер за лизис: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-глицеролфосфат, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM натриев флуорид, 1 mM натриев ортованадат, 5 mM натриев пирофосфат, 0,2 mM фенилметансулфонилфлуорид и протеазен инхибитор. Червеите бяха замразени в течен азот и размразени при 37°C три пъти, след което бяха обработени с ултразвук върху сух лед с ултразвуково устройство VialTweeter за едновременна подготовка на 10 епруветки с проби. Ултразвуковата обработка беше извършена при 50% амплитуда в 10 цикъла по 2 sec. с пауза от 30 sec между пакетите ултразвукови импулси. След това пробите бяха центрофугирани при 12 000 rpm при 4°C за 15 min. Супернатантът беше събран и съхраняван при -70°C. Една аликвота беше използвана за количествено определяне на протеините чрез анализ по Bradford.
Определяне на общ глутатион, GSH и GSSG: За количественото определяне на глутатион приготвянето на лизатите и определянето бяха извършени в един и същи ден. Хранени с глюкоза и контролни ларви L4 бяха събрани и промити три пъти с буфер M9. След отстраняване на възможно най-голямо количество буфер M9 червеите бяха ресуспендирани в леденостудена метафосфорна киселина (5% w/v), след което бяха обработени с ултразвук в лед с ултразвуков VialTweeter при 50% амплитуда в десет цикъла на ултразвукова обработка по 2 sec. с пауза от 30 sec. между всеки цикъл. След това бяха центрофугирани при 12 000 rpm при 4 ̊C за 15 min.
(вж. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Подготовка на проби от C. elegans преди имунопреципитация и уестърн блотинг

Накратко, за ембрионални екстракти ларвите L1 на C. elegans бяха отглеждани в голямомащабни течни култури в S-среда до зрялост. Ембрионите бяха събрани по стандартния метод с белина и суспендирани в буфер за лизис (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% глицерол, 0,05% NP-40, 1􏰅 коктейл от протеазни инхибитори и 1􏰅 коктейл от фосфатазни инхибитори I и II), бързо замразени в течен азот и лизирани чрез ултразвуково разрушаване на клетките с ултразвуков апарат с микронакрайник, като UP200Ht със S26d2 за 10 импулса в рамките на 10 s при 30% амплитуда. Ако трябва да се подготвят по-голям брой проби, се препоръчват ултразвуковият VialTweeter или ултразвуковият апарат за множество проби UIP400MTP за плаки с ямки. След ултразвуковата обработка екстрактите бяха предварително избистрени чрез центрофугиране при 30 000g за 20 min при 4°C. Предварително избистреният екстракт (300µg общ протеин) беше инкубиран с 40µ􏰂g афинитетно пречистено антитяло anti-CDC-25.1 (това изследване), кръстосано свързано с протеин A-агароза, или като контрола беше използвано подобно количество заешки имуноглобулин (Ig)G, кръстосано свързан с протеин A-агароза, в общ обем от 200µl буфер за лизис, съдържащ 1% NP-40, чието включване намаляваше неспецифичното свързване на протеините с матрицата. Пробите бяха въртени за 1 h при 4°C, микросферите бяха промити три пъти с буфер за лизис и елуирани с 30µl глицин/HCl и 200 mM NaCl, pH 2,2. След имунопреципитацията елуатите бяха разредени в 30µ􏰂l буфер за проби за SDS, нагрети до 95°C за 4 min и обикновено 3% от общото количество за изходната проба и 30% за елуатите бяха нанесени за SDS-PAGE, последвана от уестърн блотинг с антитела anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), анти-убиквитин (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) или anti-􏰁β-actin (1:2000). Когато екстрактите не бяха подложени на имунопреципитация, същото количество общ протеин, получено от тези екстракти, беше ресуспендирано в буфер за проби за SDS, нагрето до 95°C и след това директно нанесено за SDS-PAGE и анализирано чрез уестърн блотинг. (вж. Segref et al. 2020)

Ултразвуков лизис при прецизен контрол на температурата

Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури предизвикват термично разграждане на протеините в пробите.
Както всички механични техники за подготовка на проби, ултразвуковата обработка генерира топлина. Температурата на пробите обаче може да се контролира добре при използване на VialTweeter. Представяме ви различни възможности за наблюдение и контрол на температурата на пробите, докато ги подготвяте с VialTweeter и VialPress за анализ.

1. Наблюдение на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и включваем температурен сензор. Свържете температурния сензор към UP200St и поставете върха му в една от епруветките с проби. Чрез цифровия цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St конкретен температурен диапазон за ултразвуковата обработка на пробите. Ултразвуковият апарат ще спре автоматично при достигане на максималната температура и ще остане в пауза, докато температурата на пробата спадне до долната стойност на зададената температурна ∆. След това ултразвуковата обработка ще започне отново автоматично. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, причинено от топлина.
2. Блокът на VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блока на VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилник или фризер, за да охладите предварително титановия блок, което помага да се отложи повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да бъде предварително охладена.
3. Използвайте сух лед за охлаждане по време на ултразвуковата обработка. Използвайте плитка тава, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter върху сухия лед, така че топлината да може бързо да се разсейва.

Намерете оптималното ултразвуково устройство за разрушаване на клетките за вашето приложение за лизис

Hielscher Ultrasonics е производител с дългогодишен опит във високопроизводителните ултразвукови устройства за разрушаване на клетките и хомогенизатори за лаборатории, настолни системи и системи в промишлен мащаб. Размерът на вашата бактериална клетъчна култура, вашата изследователска или производствена цел и обемът клетки за обработка на час или ден са съществени фактори за намиране на подходящото ултразвуково устройство за разрушаване на клетките за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременна ултразвукова обработка на множество проби (до 10 флакона), както и на голям брой проби (т.е. микротитърни плаки / плаки с 96 ямки), от класическия лабораторен ултразвуков апарат със сонда с различни мощности от 50 до 400 вата до изцяло промишлени ултразвукови процесори с мощност до 16 000 вата на устройство за разрушаване на клетките и екстракция на протеини в голямомащабно производство за търговски цели. Всички ултразвукови апарати Hielscher са конструирани за работа 24/7/365 при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично протоколиране на данните, които превръщат ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лаборатории и производствени обекти.
Уведомете ни какъв вид клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате биологичните си проби. Ще ви препоръчаме най-подходящото ултразвуково устройство за разрушаване на клетките според изискванията на вашия процес.

Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи – от компактни ръчни хомогенизатори и ултразвукови апарати за множество проби до промишлени ултразвукови процесори за търговски приложения: