Ултразвукова подготовка на проби на C. Elegans

Ултразвукова подготовка на проби на C. Elegans

В. елеганите са кръгли червеи, които се използват широко в изследователски лаборатории за изследване на геномиката, биологията на развитието и болестите. Много гени в геном на C. elegans имат функционални колеги при хората. По този начин нематодният червей е изключително полезен модел за човешки заболявания. Други предимства за широкото използване на C. elegans са лесното и евтино отглеждане на плочи, съдържащи бактерии (напр. E. coli), неговата прозрачност, удобна обработка, както и възможността за замразяване и съхранение на червеите за по-дълъг период от време.
Протеиновият и липиден анализ са редовни процедури в лабораториите и ултразвуковата подготовка на пробата е установеният метод за lyse C. elegans нематоди във всеки стадий на развитие (т.е. ембриони, ларви L1-L4, възрастни). Тъй като C. elegans се използва също като протеин израз система за свръхизискване на прицелни протеини, е необходима надеждна, възпроизводима лизис и метод за извличане на протеини, който дава високи протеинови добиви. Ултразвукови клетъчни системи за разрушаване и екстракция са на разположение като сонди тип хомогенизатори и като многобази ултразвукови апарати. Кетъринг за удобно приготвяне на проби и всички видове номера на размерите на пробите, Hielscher Ultrasonics има идеалния ултразвуков клетъчен разрушител за вашата лабораторна процедура.

Ултразвукови протоколи за C. Elegans Разрушаване и лизис

Ултразвукова хомогенизация и лизис на C. elegans и последващата протеинова и липидна екстракция могат да се извършват с различни процедури, като се използват различни хомогенизационни и лизисни буфери и т.н. Всички лизизи протоколи имат общо, че пробите трябва да се съхраняват непрекъснато върху лед, за да се предотврати разграждането на протеина. По-долу ви представяме някои надеждни и бързи ултразвукови лизис и протоколи за екстракция за получаване на висококачествени протеинови или липидни съдържащи C. elegans проби.

Предимства на ултразвукови C. elegans лизис

• надежден
• възпроизводим
• прецизно контролирано с
• надежден контрол на процесите
• нежен метод
• лесно за прилагане
• сейф

Ултразвукова екстракция на протеин от C. elegans Проби

Ултразвукова лизис и екстракция на протеин на C. elegans червеи могат да се извършват с помощта на различни протоколи. По-долу ви представяме няколко надеждни и бързи лизис протоколи за възпроизводими резултати от протеин екстракция.

Бързото предварителното препаратиране на цитозолен екстракт от C. elegans Worms чрез ултразвук

С следната процедура можете да подготвите C. elegans лизати за по-малко от 30 минути.
Колекция от C. elegans
Избира се желаният C. elegans червеи в 1,5ml тръба фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS) или ги измийте от плоча с 1,5ml PBS. Центрофугира се в продължение на 1 мин при 2000rpm на пелети. Съхранявайте пробите на лед.
След това, промийте червеите два пъти с PBS.
След това, промийте червеите два пъти с ddH₂O.
Ресуспендира червеите в най-малко 500ul на хомогенизационния буфер (HB). Червейните проби вече са готови за ултразвуков лизис.
За по-високо качество на протеиновия екстракт, може да искате да намалите бактериалното замърсяване чрез измиване на червеите за 5мин в PBS и стерилна, ултрачиста вода (ddH₂O) или да се извърши поплавък на захарозата. Съхранявайте пробите от червея непрекъснато върху леда.

Ултразвуков C. елегази лизис протокол

• Уверете се, че предварително подготвяте ултразвуковия апарат, така че ултразвуковият хомогенизатор да е готов за употреба (монтирана сонда, предварително настроена програма за ултразвук).

Ако вашият ултразвуков апарат е монтиран, поставете ледената баня с епруветките за проби под ултразвуковата сонда и поставете ултразвуковата сонда в тръбата 1,5ml.

• За C. elegans лизиране с UP200St или UP200Ht, ултразвук трябва да се извърши с помощта на микротип (например, 2 мм сонда S26d2; вижте снимката вляво) на 40% амплитуда за 1sec с 30sec паузира между. 5 цикъла на ултразвук за всеки 1 секунда с 30сек паузи са идеални за C. elegans лизиране. Ако извършите лизиса за първи път, можете да проверите прогресията на лизиса в малки аликвотни части на пробата след всеки импулс с помощта на микроскоп.
• Лизисът се завършва успешно, когато червеите са нарушени. Свръх-sonication води до счупване на ядрата и става видима, когато пробата получава вискозен или пяна. За да се предотврати разграждането на пробата, при необходимост използвайте повече импулси. Не увеличавайте времето на всеки ултразвуков импулсен цикъл, за да получите висококачествени протеинови екстракти.
• Изчистване на клетката лизат чрез центрофугиране на ултразвуково лизирани червеи при 14,000rpm за 10 минути при 4ºC.
• След това се прехвърля супернатант в прясна епруветка и се приготвя за имунопреципитация или други тестове.

Забележка за хомогенизиране на буфера: Пригответе хомогенизационния буфер за протокола ултразвуков лизис по-горе, както следва:

Ултразвукова лизис на C. elegans за количествени анализи на пречистване на афинитет

C. елегони ембриони (∼2 милиона на повторение) са събрани прясно в биологичен триполив чрез избелване на млади гравитадни хермафродити и ултразвуково наледяване (цикъл: 0.5 s, амплитуда: 40-45%, 5 инсулти / сесия, 5 сесии, интервал между сесиите: 30 s; UP200S ултразвуков процесор с микрошукция S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в лизис буфер (общ обем: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, рН 7,4, 100 mm KCl, mgCl2 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% глицерол, протеазна инхибиторна смес, 0,1% Nonidet P-40 заместител). След ултразвук се добавя Неснидет P-40 заместител до 1% и лизати се инкубират с главата над опашката при въртене на опашката при 4 ° C за 30 min, последвано от центрофугиране при 20 000 × g за 20 min при 4 ° C. Изчистен лизат след това се аспират без да се нарушава горният липиден слой и се разделя на половината от анти-GFP агарозните зърна или блокираните контролни мъниста (40-50 μl). След преобръщане на главата над опашната глава при 4°C за 60–90 min, зърната се измиват веднъж с lysis буфер, съдържащ 0,1% Nonidet P- 40 заместител, последвани от два пъти промиване в буфер I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, mgCl2 mm) или буфер II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) или и двете. За GFP:MBK-2 pull-down се извършват два отделни експеримента, като се използват различни условия на пране. Протеините се отмиват чрез орбитално разклащане в 50 μl от 6 m карбамид/2 M тиуреа при стайна температура. За МБК-1:: GFP издърпващи експерименти, протеините се елуират два пъти чрез разклащане в 50μl от 8 m guanidinium хлорид при 90° C, последвано от етанол утаяване. След това се усвояват проби от елуирани протеини.
(срв. Чен и др., 2016 г.)

Ултразвукова хомогенизация и лизис

За C.elegans лзи и добив на протеини, 30,000 немотодки от съответния етап са събрани на проба и се измиват в ледено-студен S-базал, концентриран чрез центрофугиране при 1500 rpm в продължение на 2 min., измити шест пъти с лед-студ S-базал за отстраняване на остатъчните бактерии, а след това се съхраняват на лед до готовност за употреба. За екстракция на протеини, гравитационните възрастни червеи са били допуснати да образуват компактна пелета след последното S-базално измиване. Пелетите за червеи се ресуспендираха в 1 ml ледено-студена екстракция буфер [20 mM калиев фосфат, рН 7.4, 2mM EDTA, 1% Тритон-X-100, протеазни инхибитори (Сигма P2714)] и се обработват незабавно.
∼30,000 гравитачно-възрастни червеи (съответстващи на ∼100 mg мокро тегло), се ултразвуково на лед с помощта на ултразвуков тип сонда (например UP50H с микротип MS2) при 40% амплитуда за 10 цикъла от 3 сек на, 30 сек разстояние, в 1 ml леден екстрахиране буфер. (срв. Baskharan et al. 2012 г.)

Ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans

При липидомите се характеризира и анализира клон на метаболомиката, липидното допълнение на биологичните системи. C. елеган се използва широко в липидомични средства за изследване на взаимодействието на метаболитните липиди и тяхното въздействие върху здравето и живота.
Ултразвуковият лизис и екстракция се използват за освобождаване на липиди като сфинголипиди от C. elegans ембриони, ларви и възрастни червеи. Ultrasonication се използва за приготвяне на червеи хомогенати и впоследствие за извличане на липидите от пробата.
Протокол за ултразвукова екстракция на липиди от C. elegans
Размразявайте С. елегони на пелети върху лед и ресуспендирайте с 0,5 ml ултра вода. 
Пробите C. elegans се проби в 1,5mL епруветки, като същевременно пробите се съхраняват непрекъснато върху лед.
Sonication може да се извърши с помощта на сонда-ултразвуков Uf200 ः т, ултразвукова подготовка на пробата единица VialTweeter (едновременно ултразвуково изследване на 10 проби) или 1000000000000000000000 (за ултразвукова обработка на многоелеменни плочи като 96-ямки плочи). За ултразвуков лизис с UP200Ht използвайте микрошпокрита S26d2. Предварително задайте режим на ултразвуков цикъл в цифровото меню. Задайте амплитуда на 10% и режим на цикъл на ултразвук на 2 сек импулси от 20 цикъла с пауза от 30 секунди между всеки ултразвуков пулсиращ спукване.
Прехвърлете супернатантите в стъклени епруветки с капачка на винт. 
Извършва се екстракция на Фолч чрез добавяне на 1 ml ултра вода към всяка стъклена епруветка, след което се добавят 6 ml хлороформ/метанол (съотношение = 2:1) към всяка стъклена тръба.
30 секунди за 4 пъти. 
Епруветките се центрофугират при 1258 x g за 15 min (Eppendorf, 5810 R), за да се подобри допълнително разделянето на фазите. 
Прехвърля се долната хидрофобична фракция в чиста стъклена тръба с пипета от стъкло Pasteur. 
Изсушава се долната хидрофобична фракция под азотен поток в азотен изпарител. 
Да се съхранява изсушената пелети във фризер –80 °C до момента на употреба.

Ултразвукова подготовка на глиза на червеите

Глиза лизат: глисти с стадий L4 са събрани и измити три пъти с M9 буфер (42,26 mM Na₂НРО₄22.04 mM KH₂Po₄, 85.56 mM Насло и 0.87 mM MgSO₄) с цел отстраняване на всички бактерии. След отстраняването на възможно най-много от M9 буфера, червеите се ресуспендираха в лизисния буфер: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM фосфат β-глицерол, 0,1% (v/v) Тритон X-100, 50 mM натриев флуорид, 1 mM натриев ортоводат, 5 mM натриев пирософосфат, 0.2 mM фенилметанесулфонилфлуорид и проте инхибитор. Червеите бяха замразени в течен азот и се размразяват при 37 ° С в продължение на три пъти, след което червеите се обстудяват с ултразвуково изследване VialTweeter единица за едновременно приготвяне на 10 епруветки за проби. Sonication се извършва при 50% амплитуда в 10 цикъла на 2 сек. с 30 сек пауза между звуковите спуквания. След това пробите се центрофугират при 12 000 rpm при 4°C в продължение на 15 минути. Супернатантът се събира и съхранява при -70 °C. Аликвот е използван за количествено определяне на белтъчините чрез анализ на Брадфорд.
Определяне на общия глутатион, GSH, и GSSG: За глутатион, количествено определяне, лизати и определяне са направени в един и същи ден. Глюкозните и контролните L4 ларви се събират и измиват с M9 буфер три пъти. След отстраняването на колкото е възможно повече от M9 буфер, червеите се ресуспендират в ледено студена метафосфорна киселина (5% w / v), тогава червеите се скапват в лед с ултразвук с ултразвуков VialTweeter при 50% амплитуда в десет цикъла на ултразвукова обработка от 2 сек. с 30 секунди пауза между всеки цикъл. След това се центрофугират при 12 000 оборота при 4 ̊C за 15 min.
(срв. Алкантар-Фернандес и др., 2018)

C. елегани Проба Подготовка преди имунопреципитация и Западната петна

Накратко, за ембрионални екстракти, C. elegans L1 ларви са отгледани в големи течни S-средни култури до зряла възраст. Ембрионите са събрани по стандартния избелешки метод и суспендирани в лизисния буфер (50 mM Tris, pH 7,5, 100 тМ КCl, 1 тМ EDTA, 1 тМ MgCl2, 8.7% глицерол, 0.05% NP-40, 1􏰅 коктейл протеазни инхибитори и 1􏰅 Фосфатаз инхибитор коктейл I и II), бързо замразени в течен азот, и лизира чрез ултразвуково разрушаване на клетките с помощта на ултразвуков апарат с микротип като микротип като микротип като микротип като микротип Uf200 ः т с S26d2 за 10 импулса над 10 сек при 30% амплитуда. Ако трябва да се приготви по-голям брой проби, VialTweeter или мултиСample-Ultrasonicator UIP400MTP за добре плочи се препоръчва. След ултразвук екстрактите бяха предварително изчистени чрез центрофугиране при 30,000g за 20 минути при 4 ° C. Предварително изчистеният екстракт (300 μg общ протеин) се инкубира с 40μ􏰂g анти-CDC-25,1 пречистен антитяло (това проучване) или като контрол, подобно количество на заешки имуноглобулин (Ig) G, което е свързано с протеин А- агароза, е използвано в общ обем 200 μl lysis буфер, съдържащ 1% NP-40, чието включване намалява неспецифичното свързване на протеините с матрицата. Пробите се завъртат за 1 h при 4 ° C, перлите се измиват три пъти с lysis буфер, елуирани с 30μl глицин / HCl и 200 mM NaCl, рН 2, 2. 2. След имунопреципитация елуатите се разреждат в 30μ􏰂l от SDS буфера за пробата, нагряван до 95°C в продължение на 4 min, 30% за Елюатите са приложени към SDS-PAGE, последвано от western blotting с анти-CDC-25,1 (1:400), анти- (1:1000), анти-GSK3􏰁 (1:500), анти-􏰁β-актин (1:2000) антитела. Когато екстрактите не са били подложени на имунопреципитация, същото количество от общия протеин, получен от тези екстракти, се ресуспендира в буфера на пробата sdSS, нагрята до 95 °C, след което се прилага директно към SDS-PAGE и се анализира чрез Western blotting. (срв. Шегфс и 2020 г.)

Ултразвукова лизис под Контрол на температурата на прескочите

Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури инициират термично индуцирано разграждане на протеина в пробите.
Както всички техники за механично приготвяне на проба, ултразвукът създава топлина. Въпреки това, температурата на пробите може да бъде добре контролирана, когато се използва VialTweeter. Представяме ви различни опции за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте с VialTweeter и VialPress за анализ.

1. Мониторинг на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и термокана за включване. Включете температурния датчик в UP200St и поставете върха на температурния сензор в една от епруветките за проби. Чрез цифров цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St определен температурен диапазон за вашата проба ултразвук. Ултразвукът автоматично ще спре, когато се достигне максималната температура и се спира, докато температурата на пробата достигне до по-ниската стойност на зададената температура ∆. Тогава ултразвукът започва автоматично отново. Тази интелигентна функция предотвратява предизвиканото от топлината разграждане.
2. Блокът VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блок VialTweeter (само сонотрода без преобразувател!) в хладилника или фризера предварително охлаждане на титанов блок помага да се отложи повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба може да бъде предварително охладена.
3. Използвайте сух лед, за да се охлади по време на ултразвук. Използвайте плитка поднос, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter на сухия лед, така че топлината бързо да може да се разсее.

Намерете оптималния ултразвуков разрушител на клетките за вашето приложение Lysis

Hielscher Ultrasonics е дългогодишен опитен производител на високопроизводителни ултразвукови разрушители и хомогенизатори за лаборатории, пейка-отгоре и промишлени мащаб системи. Вашият размер на бактериалната клетъчна култура, вашата цел за изследване или производство и обемът на клетката за обработка на час или ден са основни фактори за намиране на правилния ултразвуков клетъчен разрушител за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременното ултразвуково управление на мулти-проби (до 10 флакона), както и масови проби (т.е., микротитърни плочи / 96-кладенци), класическия ултразвуков лаборатор с ултразвуков лаборатор с различни нива на мощност от 50 до 400 вата до напълно промишлени ултразвукови процесори с до 16,0000was на единица за търговски клетки и екстракция на протеин в голямо производство. Всички Hielscher ultrasonicators са построени за 24 / 7 / 365 работа при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично протоколиране на данни, което прави ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лабораторни и производствени съоръжения.
Нека знаем, какви клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате биологичните проби. Ние ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков клетъчен разрушител за вашите изисквания за процеса.

Таблицата по-долу ви дава индикация за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи от компактни ръчни хомогенизатори и MultiSample Ultrasonicators до промишлени ултразвукови процесори за търговски приложения: