Ултразвуков лизис на проби от Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster се използва широко в лабораториите като моделен организъм. Поради това трябва често да се извършват етапи на преданалитична подготовка като лизис, клетъчно разрушаване, екстракция на протеини и срязване на ДНК на проби от Drosophila melanogaster. Ултразвуковите дисмембранори са надеждни и ефективни и могат да се използват за лесно изпълнение на различни задачи като лизис, екстракция на протеини или фрагментация на ДНК, като се регулират само параметрите на ултразвуковия процес. По този начин ултразвуковите хомогенизатори са гъвкави инструменти с широк спектър от приложения.

Ултразвуков лизис и екстракция на протеини

Лизисът, клетъчната солубилизация, хомогенизацията на тъканите и екстракцията на протеини са типични задачи за ултразвуковите дисмембранатори в биологични лаборатории. Ултразвуковите дисмембранори и клетъчните разрушители са много подходящи за хомогенизиране на животински тъкани, насекоми (напр. Drosophila melanogaster, C. elegans) или растителни екземпляри. Последващите приложения на ултразвука са лизис на клетъчни суспензии и пелети, както и екстракция на вътреклетъчни протеини.
Ултразвуковият лизис и екстракцията на протеини са високо надеждни и възпроизводими процеси, които могат да се извършват въз основа на утвърдени протоколи. Тъй като ултразвуковият интензитет на процеса може да бъде точно регулиран чрез параметри на ултразвука като амплитуда, режим на цикъл / импулс, температура и обем на пробата, веднъж доказани протоколи могат да се повтарят с един и същ резултат отново и отново.

Ултразвукова фрагментация на ДНК и РНК

След клетъчен лизис и екстракция на протеини, често срещана необходима стъпка в подготовката на пробата е срязването и фрагментирането на ДНК, РНК и хроматина, например преди хроматинова имунопреципитация (ChIP). Фрагментацията на ДНК и РНК може да бъде надеждно постигната чрез разрушаване на ковалентните връзки, които държат ДНК заедно чрез физически сили. Използвайки физическо срязване, като ултразвук, първо ДНК веригите се разрушават, след това ДНК се фрагментира на по-малки парчета.
Ултразвуковата фрагментация на ДНК е надеждна и ефективна при срязване на ДНК до целева дължина, например 500bp (базови двойки). Основните предимства на ултразвуковата фрагментация на ДНК включват прецизния контрол на параметрите и интензивността на ултразвуковия процес. Параметрите на ултразвуковия процес могат да се регулират чрез прецизна настройка на интензивността, циклите и времето на ултразвука. Това дава възможност да се създадат желаните размери на ДНК и целевата дължина на ДНК може да бъде надеждно произведена, както и възпроизведена. Ултразвуковото срязване на ДНК също е идеално за създаване на ДНК фрагменти с високо молекулно тегло.

Протоколи за ултразвуков лизис на Drosophila melanogaster

По-долу можете да намерите различни протоколи за ултразвуков лизис, екстракция на протеини и фрагментация на ДНК или хроматин на проби от Drosophila.

Ултразвуков анализ за омрежване на имунопреципитация (CLIP)

CLIP анализът е извършен, както беше съобщено по-горе, с някои модификации. Приблизително 20 mg яйчници от 0- до 1-дневни женски от див тип са UV омрежени (3 × 2000 μJ/cm2), хомогенизирани върху лед в 1 ml RCB буфер (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM захароза, 1 mM DTT, 1× без EDTA пълни протеазни инхибитори, 1 mM PMSF), допълнени с 300 U RNAseOUT и поставени върху лед за 30 минути. Хомогенатът е ултразвук върху лед, при 80% мощност, пет пъти на 20 s изблици с 60 s почивка между тях с помощта на ултразвуковия процесор Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) и центрофугирани (16000 × g за 5 минути при 4°C). Разтворимият екстракт е предварително изчистен с 20 μl Protein-G dynabeads за 20 минути при 4°C. След отстраняване на проби за имуноблотиране и количествено определяне на входа на РНК (1%), HP1 е имунопреципитиран с анти-HP1 9A9 антитяло от 450 μl предварително изчистен екстракт чрез инкубация в продължение на 4 часа с 50 μl Protein-G dynabeads. Имунопреципитатите се промиваха 4 пъти с RCB. За да се елуират имунопреципитираните РНК, гранулираните гранулирани зърна се варят в 100 μL ултрачиста вода, обработена с DEPC в продължение на 5 минути. 900 μL реактив на Qiazol се добавя към супернатанта, възстановен за приготвяне на РНК. Пречистената РНК е използвана като шаблон за синтез на кДНК с помощта на олиго dT, случайни хексамери и SuperScript обратна транскриптаза III съгласно протокола на производителя.
(Cassale et al. 2019)

Ултразвуков лизис за хроматин имунопреципитационен анализ

Хроматиновата имунопреципитация е извършена по метода, описан от Menet, с малки модификации. Приблизително 20 mg яйчници от 0- до 1-дневни женски от див тип са хомогенизирани в 1 ml NEB буфер (10 mM HEPES-Na при рН 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при рН 8, 0,5 mM EDTA-Na при рН 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM спермидин, 0,15 mM спермин, 1× EDTA- пълни протеазни инхибитори) с хомогенизатор / потапящ диспергатор 1 min (при 3000 об / мин). Хомогенатът се прехвърля в предварително охладен стъклен дънс и се нанасят 15 пълни удара със стегнат пестик. След това свободните ядра се центрофугират при 6000xg за 10 минути при 4°C. Гранулите, съдържащи ядра, се ресуспендират в 1 ml NEB и се центрофугират при 20000 × g в продължение на 20 min върху градиент на захарозата (0,65 ml 1,6 M захароза в NEB, 0,35 ml 0,8 M захароза в NEB). Пелетите са ресуспендирани в 1 ml NEB и формалдехид до крайна концентрация от 1%. Ядрата са омрежени в продължение на 10 минути при стайна температура и загасени чрез добавяне на 1/10 об. 1,375 M глицин. Ядрата се събират чрез центрофугиране при 6000 × g за 5 минути. Ядрата се промиват два пъти в 1 ml NEB и се ресуспендират в 1 ml лизис буфер (15 mM HEPES-Na при рН 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA при рН 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na дезоксихолат, 0,1% SDS, 0,5% N-лауроилсаркозин и 1× EDTA пълни протеазни инхибитори). Ядрата са ултразвукови с помощта на ултразвуков процесор на Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) шест пъти по 20 секунди и 1 минута на лед. Зонираните ядра се центрофугират при 13000 × g за 4 минути при 4°C. По-голямата част от ултразвуковия хроматин е с дължина от 500 до 1000 базови двойки (bp). За всяка имунопреципитация се инкубират 15 μg хроматин в присъствието на 10 μg моноклонално антитяло HP1 9A9 (3 часа при 4°C във въртящо се колело). След това се добавят 50 μl протеин G и инкубацията продължава през нощта при 4°C. Супернатантите се изхвърлят и пробите се промиват два пъти в лизисен буфер (всяко промиване 15 минути при 4 °C) и два пъти в TE буфер (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматинът се елюира от мъниста на две стъпки; първо в 100 μl елуициен буфер 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl при pH 8) при 65°C за 15 минути, последвано от центрофугиране и възстановяване на супернатанта. Материалът на мънистата се извлича повторно в 100 μl TE + 0,67% SDS. Комбинираният елуат (200 μl) се инкубира за една нощ при 65°C, за да се обърнат кръстосаните връзки и се третира с 50 μg/ml РНКаза за 15 минути при 65°C и с 500 μg/ml протеиназа К в продължение на 3 часа при 65°C. Пробите са извлечени фенол-хлороформ и етанолът се утаява. ДНК е ресуспендирана в 25 μl вода. За максимизиране на молекулярните анализи с имунопреципитирана ДНК, кандидат-гените са амплифицирани по двойки чрез оптимизиран дуплекс-PCR протокол чрез използване на два различни набора праймери със сходни температури на топене в една реакция.
(Casale et al. 2019)
 

Високоефективни ултразвукови клетъчни разрушители за биологични проби

Hielscher Ultrasonics е вашият дългогодишен партньор, когато става въпрос за високоефективни ултразвукови апарати за клетъчно разрушаване, лизис, извличане на протеини, фрагментация на ДНК, РНК и хроматин, както и други стъпки за преданалитична подготовка на пробата. Предлагайки цялостно портфолио от ултразвукови лабораторни хомогенизатори и устройства за подготовка на проби, Hielscher разполага с идеалното ултразвуково устройство за вашето биологично приложение и изисквания.
Класически ултразвуков уред тип сонда с микронакрайник като UP200St (200 W; вижте снимката вляво) или един от ултразвуковите устройства за подготовка на проби ФлаконВисокоговорител за високи честоти или UP200ST_TD_CupHorn с VialHolder са любими модели в изследователски и аналитични лаборатории. Класическата ултразвукова сонда е идеална, когато се подготвят по-малко проби трябва да бъдат лизирани, извлечени или фрагментирани. Устройствата за подготовка на проби VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn позволяват едновременно ултразвук съответно на до 10 или 5 флакона.
Ако трябва да се обработват голям брой проби (напр. плаки с 96 ямки, плаки с микротитър и др.), UIP400MTP е идеалната настройка за ултразвук. UIP400MTP функционира като по-голям чаша, който се пълни с вода и има достатъчно място за съхранение на плочи с микроямки. Захранван от мощен ултразвуков процесор с мощност 400 вата, UIP400MTP осигурява много равномерна и интензивна ултразвук на многоямкови плочи, за да разрушава клетките, да лизира проби, да разтваря пелети, да извлича протеини или да срязва ДНК.

Прецизен контрол чрез интелигентен софтуер

Всички решения за ултразвук на Hielscher от 200 вата нагоре са оборудвани с цифров цветен сензорен екран и интелигентен софтуер. Чрез интелигентното протоколиране на данни всички параметри на ултразвуковия процес се записват автоматично като CSV файл на вградена SD-карта веднага след стартиране на ултразвуковия уред. Това прави проучването и протоколирането много по-удобни. След изпитанията на ултразвука или подготовката на пробата можете просто да прегледате параметрите на ултразвука на всеки цикъл на ултразвук и да ги сравните.
Чрез интуитивното меню могат да бъдат предварително зададени множество параметри преди ултразвук: Например, за да се контролира температурата в пробата и да се предотврати нейното термично разграждане, може да се зададе горна граница на температурата на пробата. Щепселният температурен сензор, който се доставя с ултразвуковия модул, дава обратна връзка на ултразвуковия процесор за действителната температура на ултразвук. Когато се достигне горната температурна граница, ултразвуковото устройство спира, докато се достигне долната граница на зададената ∆T и започва автоматично да озвучава отново.
Ако се изисква ултразвук със специфична входяща енергия, можете предварително да зададете крайната ултразвукова енергия на ултразвука. Разбира се, ултразвуковата пулсация и режимът на цикъл също могат да бъдат индивидуално настроени.
За да използвате повторно най-успешните си параметри на ултразвук, можете да запазите различни режими на ултразвук (напр. време за ултразвук, интензивност, режим на цикъл и т.н.) като предварително зададени режими, така че те да могат лесно и бързо да се стартират отново.
За по-голямо удобство при работа всички цифрови ултразвукови устройства могат да се управляват чрез дистанционно управление на браузъра във всеки общ браузър (напр. InternetExplorer, Safari, Chrome и др.). LAN връзката е проста plug-n-play настройка и не изисква инсталиране на допълнителен софтуер.
Ние от Hielscher знаем, че успешното ултразвук на биологични проби изисква прецизност и повторяемост. Затова проектирахме нашите ултразвукови апарати като интелигентни устройства с всички функции, които позволяват ефективна, надеждна, възпроизводима и удобна подготовка на проби.

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови системи от ултразвукови микронакрайници и класически ултразвукови хомогенизатори до ултразвукови ултразвукораздвижители MultiSample за удобна и надеждна подготовка на множество проби: