Ултразвукова лизиране на проби от Дрозофила меланогастър

Дрозофила меланогастър се използва широко в лабораториите като модел на организма. Следователно, често трябва да се извършват преданализни препарати като лизис, разрушаване на клетките, екстракция на протеин и ДНК срязване на пробите drosophila melanogaster. Ултразвуковите dismembrators са надеждни и ефективни и могат да се използват за извършване на различни задачи като лизис, екстракция на протеин или фрагментация на ДНК само чрез регулиране на ултразвукови параметри на процеса. Ултразвуковите хомогенизатори са по този начин гъвкави инструменти с широк спектър от приложения.

Ултразвукова лизис и екстракция на протеини

Лизис, клетъчно разтворимо, хомогенизиране на тъканите и екстракция на протеини са типични задачи за ултразвукови dismembrators в биологични лаборатории. Ултразвукови dismembrators и клетъчни разрушители са много подходящи за хомогенизиране на животински тъкани, насекоми (например, Drosophila melanogaster, C. elegans) или растителни проби. Последващи приложения на ултразвук са лизирането на клетъчните суспензии и пелети, както и екстракцията на вътреклетъчни протеини.
Ултразвукова лизис и екстракция на протеин са високо надеждни и възпроизводими процеси, които могат да се извършват въз основа на установените протоколи. Тъй като интензивността на ултразвуковия процес може да бъде точно регулирана чрез параметри на ултразвука като амплитуда, режим на цикъл / импулс, температура и обем на пробата, веднъж доказани протоколи могат да се повтарят с един и същ резултат отново и отново.

Ултразвукова ДНК и РНК Фрагментация

След извличане на клетъчен лизиране и протеин, често изисквана стъпка в подготовката на пробата е срязване и фрагментация на ДНК, РНК и хроматин, например преди имунопреципитация на хроматин (ChIP). Фрагментацията на ДНК и РНК може да бъде надеждно постигната чрез счупване на ковалентни връзки, които държат ДНК заедно чрез физически сили. Използвайки физическо срязване като ултразвук, отначало ДНК нишките се разбиват, след което ДНК се фрагментира на по-малки парчета.
Ултразвукова ДНК фрагментация е надеждна и ефективна в срязване ДНК до целева дължина, например 500bp (базови двойки). Основните предимства на ултразвуковата ДНК фрагментация включват прецизното управление на параметрите на ултразвуковия процес и интензивността. Параметрите на ултразвуковия процес могат да бъдат регулирани чрез настройка на интензивността на ултразвука, циклите и точното време. Това дава възможност за създаване на желаните размери на ДНК и целевата дължина на ДНК може да бъде надеждно произведена, както и да се възпроизведе. Ултразвуковото ДНК срязване също е идеално за създаване на ДНК фрагменти с високо молекулно тегло.

Протоколи за ултразвукова лизиране на Дрозофила меланогастър

По-долу можете да намерите различни протоколи за ултразвуково подпомагани лизис, екстракция на протеин и ДНК или хроматин фрагментиране на пробите на Drosophila.

Ултразвукова лизис за кръстосано свързване имунопреципитация (CLIP)

Анализът на CLIP е извършен, както е съобщено преди това при някои модификации. Приблизително 20 mg яйчници от 0 до 1-дневни диви женски животни са били uv-свързани (3 × 2000 μJ/cm2), хомогенизирани върху лед в 1 mL RCB буфер (50 mM HEPES рН 7,4, 200 mM На Сл, 2.5 тМ MgCl2, 0.1% Тритон X-100, 250 тМ захароза, 1 mM DTT, 1× без EDTA пълно протеазни инхибитори, 1 тМ PMSF) допълнена с 300 U 300 U КъсНаут и пуснати на лед за 30 мин. Хомогенатът се обработва с ултразвук на лед, при 80% мощност, пет пъти в 20 сп с 60 s почивка между използването на ултразвуковия процесор Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) центрофугира (16 000 × g за 5 min при 4°C). Разтворим екстракт е предварително разреден с 20 μl Protein-G dynabeads за 20 min при 4°C. След отстраняване на пробите за имуноблотиване и квантуване на РНК входа (1%), HP1 е имунопреципитиран с анти- HP1 9A9 антитела от 450 μl предварително изцедени екстракт чрез инкубация за 4 часа с 50 μl протеин-G динабийди. Имунопреципитати са измити 4 пъти с RCB. За да се отмият имунопреципираните РНК, гранулираните гранули се варят в 100 μL от обработената с UltraPure DEPC вода за 5 min. 900 μL Qiazol Реагент се прибавя към супернатантата, възстановена за РНК подготовка. Пречистена РНК е използвана като шаблон за синтезиране на CDNA с помощта на олиго dT, случайни хексамери и SuperScript обратна транскриптаза III съгласно протокола на производителя.
(Касале и др., 2019 г.)

Ултразвуков лизис за хроматин имунопреципитация анализ

Имунопреципитация на Хроматин се извършва по метода, описан от Menet с малки изменения. Приблизително 20 mg яйчници от 0 до 1-дневни диви женски животни са хомогенизирани в 1 mL NEB буфер (10 mM HEPES-Na при рН 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при рН 8, 0.5 тМ EDTA-Na при рН 8, 1 тМ DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM spermidine, 0.15 mM spermine, 1× EDTA- свободен пълен протеазни инхибитори) с хомогенизатор / потапяне разпръсквател 1 мин (при 3000 rpm). Хомогенатът се прехвърля в предварително охладено стъкло и 15 пълни удара се нанасят с плътен песъл. Свободните ядра се центрофугират при 6000xg за 10 минути при 4°C. Ядрата, съдържаща гранули се ресуспендират в 1 ml NEB и се центрофугират при 20000 × g за 20 min на захарозен градиент (0.65 mL 1.6 m захароза в NEB, 0.35 mL 0.8 m захароза в NEB). Пелетите се ресуспендира в 1 мл NEB и формалдехид до крайна концентрация от 1%. Ядрата са кръстосани за 10 минути при стайна температура и се угасват чрез добавяне на 1/10 обемен глицин 1,375 M. Ядрата се събират чрез центрофугиране при 6000 × g за 5 мин. Ябълчите се измиват два пъти в 1 ml NEB и се ресуспендират в 1 ml л 0.5 mM EGTA, 1 тМ EDTA при рН 8, 1% Тритон X-100, 0,5 тДТ, 0,1% На деоксихолат, 0,1% SDS, 0,5% N-лавроилсаркозин и 1× EDTA-пълна протеазни инхибитори). Ядрата се обработваха с ултразвук с помощта на Hielscher ултразвуков процесор UP100H (100 W, 30 kHz) 20 s на и 1 мин на лед. Центрофугираните ядра се центрофугират при 13000 × g за 4 минути при 4 °C. По-голямата част от ултразвуковия хроматин е от 500 до 1000 базови двойки (bp) на дължина. За всяко имунопреципитация 15 μg хроматин се инкубира при наличие на 10 μg hp1 9A9 моноклонално антитяло (3 часа при 4°C в въртящо се колело). След това се добавя 50 μl dynabeads протеин G и инкубацията продължава през нощта при 4°C. Супернатантите се изхвърлят и пробите се измиват два пъти в лизисния буфер (всяка промива 15 min при 4 °C) и два пъти в TE буфер (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматинът е елуиран от мъниста в две стъпки; първо в 100 μl от 100 μl от 1 (10 тМ EDTA, 1% SDS, 50 тМ TrisHCl при pH 8) при pH 8) при 65°C в продължение на 15 min, последвано от центрофугиране и възстановяване на супернатанта. Материалите от мъниста се екстрахират отново в 100 μl ЛТ + 0.67% ИЛБ. Комбинираният елуат (200 μl) се инкубира за една нощ при 65 ° С, за да се обърнат кръстосани връзки и обработени с 50 μg/ml RNaseA за 15 min при 65 ° C и с 500 μg/ml Proteinase K за 3 часа при 65°C. Пробите са екстрахирани с фенол-хлороформ и се утаява етанол. ДНК е ресуспендирана в 25 μl вода. За максимизиране на молекулярните анализи с ДНК имунопреципитирани гени, кандидатирани са усилвани по двойки чрез оптимизиран протокол duplex-PCR чрез използване на два различни набора от праймер, които имат сходни температури на топене в една единствена реакция.
(Казале et al. 2019)

Високоефективни ултразвукови клетъчни разрушители за биологични проби

Hielscher Ultrasonics е вашият дългогодишен партньор, когато става въпрос за високопроизводителни ultrasonicators за разрушаване на клетките, лизиране, извличане на протеини, ДНК, РНК и фрагментация на хроматин, както и други предварително аналитични стъпки за подготовка на пробата. Предлагайки цялостно портфолио от ултразвукови хомогенизатори и единици за подготовка на проби, Hielscher има идеалното ултразвуково устройство за вашето биологично приложение и изисквания.
Класически ултразвуков тип сонда с микронакрат, като UP200St (200W; вижте снимката вляво) или една от ултразвуковите единици за подготовка на проби VialTweeter или UP200ST_TD_CupHorn са фаворити в изследователски и аналитични лаборатории. Класическата ултразвукова сонда е идеална, когато се приготвят по-малко проби трябва да бъдат лизирани, екстрахирани или фрагментирани. Единиците за подготовка на проби VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn позволяват едновременното ултразвукиране на до 10 или 5 флакона, съответно.
Ако се извършва голям брой проби (например 96-та клетка, микротитърни 1000000000000000000000 е идеалната настройка на ултразвука. UIP400MTP функционира като по-голяма чаша, която е пълна с вода и има достатъчно място, за да държи микро-кладенци. С мощност 400 вата мощен ултразвуков процесор, UIP400MTP доставя много равномерно и интензивно ултразвук на много добре плочи, за да разруши клетките, лизите проби, да се разтварят пелети, да извлича протеини или срязване ДНК.

Прецизен контрол чрез смарт софтуер

Всички Hielscher sonication решения от 200 вата нагоре са оборудвани с цифров цветен сензорен екран и интелигентен софтуер. Чрез протоколирането на интелигентни данни всички параметри на ултразвуковия процес се запазват автоматично като CSV файл на вградена SD-карта веднага след като ultrasonicator е стартиран. Това прави изследванията и протоколите много по-удобно. След опитите за ултразвук или подготовката на пробата, можете просто да прегледате параметрите на ултразвука на всеки звуков процес и да ги сравните.
Чрез интуитивното меню може да се настрои множество параметри преди ултразвук: Например, за да се контролира температурата в пробата и да се предотврати нейното термично разграждане, може да се определи горна граница на температурата на пробата. Сензор за температура, който се доставя с ултразвуков модул, дава обратна връзка на ултразвуковия процесор за действителната температура на ултразвук. Когато се достигне горната граница на температурата, ултразвуковото устройство спира, докато се достигне долната граница на набора ∆T и след това започва автоматично повторно.
Ако се изисква ултразвук с конкретна енергия, можете да зададете окончателната ултразвукова енергия на звуковата обработка. Разбира се, ултразвукови пулсации и цикъл режим може да бъде индивидуално настроен, също.
За да използвате отново най-успешните параметри за ултразвук, можете да спестите различни режими на ултразвук (напр. време за ултразвук, интензивност, режим на цикъл и т.н.) като предварително зададени режими, така че те да могат да бъдат лесни и бързо да започнат отново.
За по-оперативно удобство всички цифрови ултразвукови устройства могат да се управляват чрез дистанционно управление на браузъра във всеки общ браузър (например InternetExplorer, Safari, Chrome и т.н.). LAN връзката е проста настройка plug-n-play и не изисква допълнителна инсталация на софтуер.
Ние в Hielscher знаем, че успешното ултразвуково изследване на биологични проби изисква прецизност и повторяемост. Ето защо проектирахме нашите ultrasonicators като интелигентни устройства с всички характеристики, които позволяват ефективна, надеждна, възпроизводима и удобна подготовка на пробата.

Таблицата по-долу ви дава индикация за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи от ултразвукови микронапи и класически ултразвукови хомогенизатори до MultiSample ultrasonicators за удобно, надеждно приготвяне на множество проби: