Ултразвуков лизис на проби от Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster се използва широко в лабораториите като моделен организъм. Затова често трябва да се извършват преданалитични подготвителни стъпки като лизис, разрушаване на клетките, екстракция на протеини и срязване на ДНК в проби от Drosophila melanogaster. Ултразвуковите дезинтегратори са надеждни и ефективни и могат да се използват за лесно изпълнение на различни задачи като лизис, екстракция на протеини или фрагментация на ДНК само чрез регулиране на параметрите на ултразвуковия процес. По този начин ултразвуковите хомогенизатори са гъвкави инструменти с широк спектър от приложения.

Ултразвуков лизис и екстракция на протеини

Лизисът, солюбилизацията на клетките, хомогенизацията на тъканите и екстракцията на протеини са типични задачи за ултразвуковите дезинтегратори в биологичните лаборатории. Ултразвуковите дезинтегратори и устройствата за разрушаване на клетките са подходящи за хомогенизиране на животински тъкани, насекоми (напр. Drosophila melanogaster, C. elegans) или растителни образци. Последващи приложения на ултразвуковата обработка са лизисът на клетъчни суспензии и утайки, както и екстракцията на вътреклетъчни протеини.
Ултразвуковият лизис и екстракцията на протеини са изключително надеждни и възпроизводими процеси, които могат да се извършват въз основа на установени протоколи. Тъй като интензивността на ултразвуковия процес може да се регулира точно чрез параметри на ултразвуковата обработка като амплитуда, цикличен / импулсен режим, температура и обем на пробата, веднъж проверените протоколи могат да се повтарят многократно със същия резултат.

Ултразвукова фрагментация на ДНК и РНК

След клетъчния лизис и екстракцията на протеини често необходима стъпка в подготовката на проби е срязването и фрагментацията на ДНК, РНК и хроматин, например преди хроматинова имунопреципитация (ChIP). Фрагментацията на ДНК и РНК може да се постигне надеждно чрез разкъсване с физични сили на ковалентните връзки, които държат ДНК свързана. При използване на физично срязване, например чрез ултразвукова обработка, първо се разкъсват веригите на ДНК, след което ДНК се фрагментира на по-малки части.
Ултразвуковата фрагментация на ДНК е надеждна и ефективна за срязване на ДНК до целева дължина, например 500bp (базови двойки). Основните предимства на ултразвуковата фрагментация на ДНК включват прецизния контрол на параметрите и интензивността на ултразвуковия процес. Параметрите на ултразвуковия процес могат да се регулират чрез прецизно настройване на интензивността, циклите и времето на ултразвуковата обработка. Това позволява получаването на ДНК с желаните размери, като целевата дължина на ДНК може надеждно да се получава и възпроизвежда. Ултразвуковото срязване на ДНК е идеално и за получаване на ДНК фрагменти с висока молекулна маса.

Протоколи за ултразвуков лизис на Drosophila melanogaster

По-долу можете да намерите различни протоколи за подпомогнати с ултразвук лизис, екстракция на протеини и фрагментация на ДНК или хроматин в проби от Drosophila.

Ултразвуков лизис за анализ чрез имунопреципитация с кръстосано свързване (CLIP)

CLIP анализът е извършен съгласно описаното по-рано с някои модификации. Приблизително 20 mg яйчници от женски индивиди от див тип на възраст от 0 до 1 ден са подложени на кръстосано свързване с UV (3 × 2000 μJ/cm2), хомогенизирани върху лед в 1 mL RCB буфер (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM захароза, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors без EDTA, 1 mM PMSF), допълнен с 300 U RNAseOUT, и поставени върху лед за 30 min. Хомогенатът е обработен с ултразвук върху лед при 80% мощност, пет пъти с импулси от 20 s и пауза от 60 s между тях, с помощта на ултразвуковия процесор на Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) и центрофугиран (16 000 × g за 5 min при 4°C). Разтворимият екстракт е предварително пречистен с 20 μl Protein-G dynabeads за 20 min при 4°C. След отделяне на проби за имуноблотинг и количествено определяне на входната РНК (1%), HP1 е имунопреципитиран с антитяло anti-HP1 9A9 от 450 μl предварително пречистен екстракт чрез инкубиране за 4 h с 50 μl Protein-G dynabeads. Имунопреципитатите са промити 4 пъти с RCB. За елуиране на имунопреципитираните РНК утаените микросфери са кипнати в 100 μL вода UltraPure, обработена с DEPC, за 5 min. Към супернатанта, отделен за получаване на РНК, са добавени 900 μL реагент Qiazol. Пречистената РНК е използвана като матрица за синтезиране на кДНК с помощта на oligo dT, случайни хексамери и обратна транскриптаза SuperScript III съгласно протокола на производителя.
(Cassale et al. 2019)

Ултразвуков лизис за анализ чрез хроматинова имунопреципитация

Хроматиновата имунопреципитация е извършена съгласно метода, описан от Menet, с незначителни модификации. Приблизително 20 mg яйчници от женски индивиди от див тип на възраст от 0 до 1 ден са хомогенизирани в 1 mL NEB буфер (10 mM HEPES-Na при pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при pH 8, 0,5 mM EDTA-Na при pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM спермидин, 0,15 mM спермин, 1× Complete Protease Inhibitors без EDTA) с хомогенизатор / потопяем диспергатор за 1 min (при 3000 rpm). Хомогенатът е прехвърлен в предварително охладен стъклен хомогенизатор Dounce и са извършени 15 пълни хода с плътно прилягащо бутало. След това свободните ядра са центрофугирани при 6000xg за 10 min при 4°C. Утайките, съдържащи ядра, са ресуспендирани в 1 mL NEB и центрофугирани при 20 000 × g за 20 min върху захарозен градиент (0,65 mL 1,6 M захароза в NEB, 0,35 mL 0,8 M захароза в NEB). Утайката е ресуспендирана в 1 mL NEB и формалдехид до крайна концентрация 1%. Ядрата са подложени на кръстосано свързване за 10 min при стайна температура, а реакцията е прекратена чрез добавяне на 1/10 обем 1,375 M глицин. Ядрата са събрани чрез центрофугиране при 6000 × g за 5 min. Ядрата са промити два пъти в 1 mL NEB и ресуспендирани в 1 mL буфер за лизис (15 mM HEPES-Na при pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA при pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% натриев дезоксихолат, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine и 1× Complete Protease Inhibitors без EDTA). Ядрата са обработени с ултразвук с помощта на ултразвуков процесор на Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) шест пъти с 20 s включена ултразвукова обработка и 1 min върху лед. Обработените с ултразвук ядра са центрофугирани при 13 000 × g за 4 min при 4°C. По-голямата част от обработения с ултразвук хроматин е с дължина от 500 до 1000 базови двойки (bp). За всяка имунопреципитация 15 μg хроматин е инкубиран в присъствието на 10 μg моноклонално антитяло HP1 9A9 (3 h при 4°C на въртящо се колело). След това са добавени 50 μl dynabeads protein G и инкубирането е продължило през нощта при 4°C. Супернатантите са изхвърлени и пробите са промити два пъти в буфер за лизис (всяко промиване за 15 min при 4 °C) и два пъти в TE буфер (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматинът е елуиран от микросферите в две стъпки; първо в 100 μl елуиращ буфер 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl при pH 8) при 65°C за 15 min, последвано от центрофугиране и отделяне на супернатанта. Материалът върху микросферите е екстрахиран повторно в 100 μl TE + 0,67% SDS. Обединеният елуат (200 μl) е инкубиран през нощта при 65°C за разрушаване на кръстосаните връзки и обработен с 50 μg/ml RNaseA за 15 min при 65°C и с 500 μg/ml протеиназа K за 3 h при 65°C. Пробите са екстрахирани с фенол–хлороформ и преципитирани с етанол. ДНК е ресуспендирана в 25 μl вода. За максимално използване на имунопреципитираната ДНК за молекулярните анализи кандидатните гени са амплифицирани по двойки чрез оптимизиран протокол за дуплексна PCR, като в една реакция са използвани два различни набора праймери с близки температури на топене.
(Casale et al. 2019)
 

Високопроизводителни ултразвукови устройства за разрушаване на клетките в биологични проби

Hielscher Ultrasonics е вашият партньор с дългогодишен опит в областта на високопроизводителните ултразвукови хомогенизатори за разрушаване на клетките, лизис, екстракция на протеини, фрагментация на ДНК, РНК и хроматин, както и за други стъпки в преданалитичната подготовка на проби. Предлагайки цялостна гама от ултразвукови лабораторни хомогенизатори и устройства за подготовка на проби, Hielscher разполага с идеалното ултразвуково устройство за вашето биологично приложение и изисквания.
Класическият ултразвуков хомогенизатор със сонда и микровръх, като UP200St (200W; вижте изображението вляво), или някое от ултразвуковите устройства за подготовка на проби VialTweeter или UP200ST_TD_CupHorn с VialHolder са предпочитани модели в изследователските и аналитичните лаборатории. Класическата ултразвукова сонда е идеална, когато трябва да се извършат лизис, екстракция или фрагментация на по-малък брой проби. Устройствата за подготовка на проби VialTweeter и UP200St_TD_CupHorn позволяват едновременна ултразвукова обработка съответно на до 10 или 5 флакона.
Ако трябва да се обработят голям брой проби (напр. плаки с 96 ямки, микротитърни плаки и др.), UIP400MTP е идеалната система за ултразвукова обработка. UIP400MTP функционира като по-голям чашков сонотрод CupHorn, който е напълнен с вода и разполага с достатъчно пространство за поставяне на плаки с микроямки. Задвижван от мощен ултразвуков процесор с мощност 400 вата, UIP400MTP осигурява много равномерна и интензивна ултразвукова обработка на плаки с множество ямки за разрушаване на клетките, лизис на проби, солюбилизация на утайки, екстракция на протеини или срязване на ДНК.

Прецизен контрол чрез интелигентен софтуер

Всички решения на Hielscher за ултразвукова обработка с мощност от 200 вата нагоре са оборудвани с цифров цветен сензорен екран и интелигентен софтуер. Чрез интелигентното регистриране на данни всички параметри на ултразвуковия процес се записват автоматично като CSV файл върху вградена SD карта веднага щом ултразвуковият хомогенизатор бъде стартиран. Това прави изследванията и документирането много по-удобни. След изпитванията с ултразвукова обработка или подготовката на проби можете лесно да прегледате параметрите на всеки цикъл на ултразвукова обработка и да ги сравните.
Чрез интуитивното меню множество параметри могат да се зададат предварително преди ултразвуковата обработка: например за контролиране на температурата в пробата и предотвратяване на термичното ѝ разграждане може да се зададе горна граница на температурата на пробата. Температурен сензор с възможност за включване, който се доставя с ултразвуковото устройство, предоставя на ултразвуковия процесор обратна връзка за действителната температура на ултразвуковата обработка. Когато се достигне горната температурна граница, ултразвуковото устройство прави пауза, докато се достигне долната граница на зададената ∆T, след което автоматично възобновява ултразвуковата обработка.
Ако е необходима ултразвукова обработка с конкретно вложено количество енергия, можете предварително да зададете крайното количество ултразвукова енергия за цикъла на обработка. Разбира се, ултразвуковата пулсация и цикличният режим също могат да се настройват индивидуално.
За повторно използване на най-успешните ви параметри на ултразвукова обработка можете да запазите различни режими на ултразвукова обработка (напр. време на ултразвукова обработка, интензивност, цикличен режим и др.) като предварително зададени режими, така че да могат лесно и бързо да се стартират отново.
За по-голямо удобство при работа всички цифрови ултразвукови устройства могат да се управляват дистанционно чрез всеки широко използван браузър (напр. InternetExplorer, Safari, Chrome и др.). LAN връзката се настройва лесно чрез включване и непосредствено използване и не изисква инсталиране на допълнителен софтуер.
Ние в Hielscher знаем, че успешната ултразвукова обработка на биологични проби изисква прецизност и повторяемост. Затова проектирахме нашите ултразвукови хомогенизатори като интелигентни устройства с всички функции, които позволяват ефективна, надеждна, възпроизводима и удобна подготовка на проби.

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи – от ултразвукови микровърхове и класически ултразвукови хомогенизатори до ултразвукови устройства MultiSample за удобна и надеждна подготовка на множество проби: