Hielscher ултразвукова технология

Ултразвуково Лизис на Е. Coli

  • На E.coli бактерии са най-често използваните бактерии в микробиология и биотехнология.
  • Ултразвукови клетъчни нарушаващи осигуряват надеждни и възпроизводими резултати за лизиса на Е.коли.
  • Силните още точно контролируеми кавитация и срязващи сили водят до пълно прекъсване и високи добиви екстракция (например протеини, ДНК).

Cell Прекъсване от кавитация

Escherichia Coli бактерии са надеждно лизирани с помощта на ултразвукови хомогенизатори тъкан.Ултразвукова сонда тип хомогенизатори работят с прибл. 20,000 цикъла в секунда (в 20kHz) и предизвика кавитация в течности или supsensions. Акустични кавитация микроскопични сфери на вакуум-подобен натиск и високи температури, които разкъсват клетки отделно. Въпреки че температурите могат да достигнат до няколко хиляди градуса по Целзий, обеми кавитация са толкова малки, че не се нагрява значително процеса. Ултразвукът генерира акустичен кавитация и сили на срязване перфорират пауза или клетъчната мембрана на Е. coli – в зависимост от настройките на устройството на ултразвуков хомогенизатор.

Предимства на Ултразвуков Lysis

  • прецизен контрол на лизис (интензитет, амплитуда, температура)
  • оптимално приспособяване към специфични проби
  • контрол на температурата
  • за много малки до много големи проби (цЬ да литра)
  • чисто механично третиране
  • линейна скала-нагоре от лаборатория за производство
Ултразвуковите устройството VialTweeter дава възможност за получаване едновременно проба до 10 флакони под същите условия на процеса. (Кликнете за увеличение!)

VialTweeter за ултразвукова лиза

Искане на информация




Забележете нашите Правила за поверителност,


Докато химически и enzymtic лиза може да бъде проблематично – от химически лизис може да промени протеинови структури и въвеждане проблеми пречистване и ензимно лизиране изисква дълги инкубационни времена и не е възпроизводимо – ултразвукова прекъсване е изтънчен, метод за бързо клетъчно разрушаване.
Ултразвукова лизис се основава само на механични сили. Не се добавят химикали, ултразвук разгражда клетъчната стена от срязващи сили. Химически лизис може да промени протеиновата структура и въвеждане на проблеми с пречистването. при ензимно смущение се изисква дълго инкубационно време и не е възпроизводимо.

Общи препоръки

UP400St ултрасоннкаторът с реактор потокSonication е най-популярната техника за лизиране на много малки, средни и големи количества от клетъчни суспензии – от пико-литра до 100 L / час (при използване на ултразвукова клетка на потока). Клетките се лизират чрез течна срязване и кавитация. ДНК също е отделена по време на обработка с ултразвук, така че не е необходимо да се добави ДНК-аза към клетъчната суспензия.
Контрол на температурата:
Чрез предварително охлаждане на пробата и поддържане на пробата по време на обработка с ултразвук върху лед, проба термично разграждане на пробата може лесно да бъде предотвратено.
В идеалния случай пробите трябва да се държат ледено студени по време на лизис, но за повечето проби е достатъчно, ако температурата не се покачва над температурата на културата или източника на тъканите. Затова се препоръчва, за да се запази спирането на леда и да се ултразвук с няколко кратки ултразвук импулси на 5-10 сек и паузи от 10-30 сек. По време на пауза топлината може да се разсее, за да се възстанови ниска температура. За по-големи клетки проби, различни клетъчни поток реактори с охладителни якета са на разположение.

Протоколи за получаване на Е. Coli Лизатите

Експресия анализ и пречистване на рекомбинантен протеин

Е.коли пелета Е. се обработва с ултразвук с ултразвуков система UP100H (Hielscher). За тази цел, клетъчна пелета се ресуспендира в охладени лизисен буфер (50 тМ Tris-HCl рН = 7.5, 100 тМ NaCl, 5 тМ DTT, 1 тМ PMSF) и се охлажда върху лед за 10 минути. След това клетъчната суспензия се обработва с ултразвук с 10 кратки импулси от 10 сек, последвани от интервал от 30 сек за охлаждане. Накрая клетъчните отломки се отстраняват чрез ултрацентрофугиране при 4 ° С в продължение на 15 минути при 14 000 оборота в минута. За потвърждаване на RPR експресия, супернатантата се провежда върху 12% полиакриламиден гел и се анализират чрез SDS-PAGE и Western блотинг. Пречистване на RPR се извършва с помощта на Ni2 +-NTA смола (Invitrogen, USA) съгласно указания на производителя. В този етап се използва родния метод за пречистване. Чистотата на пречистения протеин се оценява чрез използване на електрофореза върху 12% полиакриламиден гел и последващо Coomassie синьо оцветяване. Пречистена концентрация на протеин се измерва чрез Micro ВСА протеин анализен комплект (Pierce, USA). (Azarnezhad и др. 2016 г.)

Ултразвуково клетъчен дезинтегратор UP100H (100W) в продължение на лизис, разрушаване на клетка и ДНК срязване.

Ултразвуков хомогенизатор UP100H 100W

Клетъчен растеж, Омрежване и Получаване на E.coli, клетъчни екстракти

За SeqA и РНК полимераза чип чип на E.coli MG1655 или MG1655 ΔseqA се култивира при 37 ° С до OD600 от около 0.15 в 50 ml LB (+ 0.2% глюкоза) преди да се добавят 27 ц1 формалдехид (37%) на ml среда (крайна концентрация 1%). Омрежването се извършва при бавно разклащане (100 об / мин) при стайна температура в продължение на 20 минути, последвано от охлаждане с 10 ml от 2.5 М глицин (крайна концентрация 0.5 М). За експерименти с топлинни шокове, Е. coli MG1655 се отглежда в 65 ml LB среда при 30 ° С до OD600 от около 0.3. След 30 мл култура се прехвърля в предварително загрята колба при 43 ° С и остатъкът се държи при 30 ° С. Омрежване и охлаждане е както е описано по-горе с изключение на това клетките се съхраняват при 30 или 43 ° С в продължение на 5 минути преди допълнително бавно разклащане при стайна температура. Клетките се събират чрез центрофугиране и се промиват два пъти със студен TBS (рН 7.5). След ресуспендиране в 1 мл лизисен буфер (10 тМ Tris (рН 8.0), 20% захароза, 50 тМ NaCl, 10 тМ EDTA, 10 мг / мл лизозим) и инкубиране при 37 ° С в продължение на 30 минути, последвано от прибавяне на 4 мл IP буфер, клетките се обработват с ултразвук върху лед с 12 пъти по 30 секунди и 30 секунди прекъсвания в един UP400St ултразвуков процесор (Hielscher Ultrasonics GmbH) с 100% мощност. След центрофугиране за 10 минути при 9000 д, 800 мкл аликвотни части от супернатантата се съхраняват при -20 ° С. (Waldminghaus 2010)

Свръхпроизводството и пречистване на ензими.

За свръхпродукция на decahistidine (His10) -свободен край протеини, на E.coli BL21 (DE3) се трансформира с рЕТ19Ь конструкти. Една нощ предкултура се събира чрез центрофугиране, и 1% се използва за инокулиране на експресия култура. Клетките носещи pET19mgtB бяха отгледани при 22 ° С до оптична плътност при 600 нм (OD600) От 0,7. Културата се прехвърля към 17 ° С и се индуцират с 100 цМ IPTG. След 16 часа, културата се събира чрез центрофугиране при 7500 х г при температура 4 ° С. Клетките се суспендират отново в 50 тМ фосфат-буфериран физиологичен разтвор (PBS) с 0.3 М NaCl при рН 7.4 и разрушават чрез ултразвук с S2 микро връх издатина в един UP200St ултрасоннкаторът (Hielscher, Teltow, Германия) при цикъл от 0.5 и амплитуда от 75%.
В свръхпроизводството на decahistidine-маркиран GtfC се индуцира при 37 ° С при OD600 на 0,6 със 100 цМ IPTG. След това клетките се инкубират в продължение на 4 часа, се събират и се лизират, както е посочено по-горе за MgtB.
Сурови клетъчни екстракти се центрофугират при 15 000 х г и 4 ° С за утаяване на клетъчните остатъци. Пречистените екстракти бяха натоварени на 1-мл HisTrap FF суров колони, като се използва система ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Ензимите се пречистват съгласно протокола на производителя за градиентно елуиране с His-таг протеини. Елуираните протеинови разтвори се диализират двукратно срещу 1,000 обема 50 тМ PBS, рН 7.4, с 0.3 М NaCl при 4 ° С. Пречистването се анализира чрез 12% SDS-PAGE. Концентрацията на протеин се определя по метода на Брадфорд с използване Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Карлсруе, Германия). (Rabausch и др. 2013 г.)

Екстракция на протеин от Е. коли бактерии
Примамка протеин от интерес (в този случай, MTV1 на Arabidopsis thaliana) е слят с GST маркер и изразено в BL21 Ешерихия коли (Е.коли) клетки.
1. Вземете един пелети от GST-MTV1 и GST (съответстващи на 50 мл бактериална култура) и ресуспендиране всеки в 2.5 мл ледено студен екстракционен буфер.
2. Използвайте ултрасоникатор UP100H (Оборудвана с MS3 микротип-издатина за малки обеми (2-5mL)) за разрушаване на бактериалните клетки, докато те се лизират, която е обозначена с намалена непрозрачност и повишен вискозитет. Това трябва да се извърши върху лед, и се препоръчва да се хомогенизира в интервали (например 10 сек звукова обработка, последвано от 10 секунди върху лед и т.н.). Грижа трябва да се внимава да не се озвучава с твърде висока интензивност. Ако пяна или образуването на бяла утайка се открива, интензитетът трябва да бъде намалена.
3. Прехвърлете лизират бактериите разтвор на 1.5 мл микроцентрофужни епруветки и се центрофугира при 4 ° С, 16,000 х грам за 20 мин.

Алицин-модифицирани протеини в E.coli

В VialTweeter е комфортен ултрасоникатор за малка проба хомогенизиранеОпределяне на Сулфхидрилни Съдържание от 5,5'-дитиобис (2-нитробензоена киселина) анализ (DTNB)
Една нощ култура на E.coli MG1655 се използва за инокулиране MOPS минимална среда (1: 100). Културата се култивира аеробно докато беше постигнато A600 0.4. Културата се разделя на три 15-милилитрови култури за лечение на стрес. Един нетретирана култура служи като отрицателна контрола. 0.79 тМ Алицин (128 мкг мл-1) Или 1 тМ диамид се прибавя към един от останалите две култури всяка. Културите се инкубират в продължение на 15 минути. 5 мл от всяка култура се събират чрез центрофугиране (8525 х д, 4 ° С, 10 минути). Клетките се промиват два пъти с 1 мл PBS (137 тМ NaCl, 2.7 тМ KCI, 10 тМ Na2НРО4, 2 тМ KH2Po4, РН 7.4, се съхранява анаеробно преди употреба) и се центрофугира (13000 х д, 4 ° С, 10 минути). Клетките отново се суспендират в лизисен буфер (PBS с 6 тМ гуанидин HCI, рН 7.4) преди разрушаване при 4 ° С с помощта на ултразвук (VialTweeter ултрасоннкаторът, Hielscher GmbH, Германия) (3 х 1 мин). Клетъчните остатъци се утаяват чрез центрофугиране (13 000 х д, 4 ° С, 15 минути). Супернатантата се прехвърля в 3.5 мл QS-макро кювета (10 mm) с магнитна бъркалка и се смесва с 1 мл лизисен буфер. Изчезване на пробите се наблюдава при 412 нм с Jasco V-650 спектрофотометър, снабден с контролирана температура държача на клетка PSC-718 (Jasco) при стайна температура. се прибавят 100 ul разтвор на 3 тМ дитиобис (2-нитробензоена киселина). Extinction се контролира до достигане на насищане. Изчисляване на тиол концентрация като се използва коефициент на екстинкция на епсилон412 = 13700 М-1 см-1 за тио-2-нитробензоена киселина (TNB). Клетъчни тиолови концентрации са изчислени на базата на обем на E.coli клетки от 6.7 х 10-15 литър и плътност на клетките А600 = 0,5 (еквивалентно на 1 х 108 клетки мл-1 култура). (Мюлер и др. 2016 г.)

In Vivo Глутатионът Определяне

Е. coli MG1655 се отглежда в MOPS минимална среда в общ обем от 200 ml до А600 0,5 е било постигнато. Културата се разделя на 50 мл култури за лечение на стрес. След 15 минути на инкубиране с 0.79 тМ алицин, 1 тМ диамид, или диметил сулфоксид (контрола), клетките бяха събрани при 4000 гр при 4 ° С в продължение на 10 минути. Клетките се промиват два пъти с буфер KPE преди ресуспендиране на пелети в 700μl на KPE буфер. За deproteination, 300L на 10% (т / о) сулфосалицилова киселина се прибавят преди разрушаване на клетките с помощта на ултразвук (3 х 1 минути; VialTweeter ултрасоникатор). Супернатантите се събират след центрофугиране (30 минути, 13000 гр, 4 ° С). концентрации сулфосалицилова киселина се намалява до 1% чрез прибавяне на 3 обема KPE буфер. Измерванията на общия глутатион и GSSG се провеждат, както е описано по-горе. Клетъчни концентрации глутатион се изчислява въз основа на обема на Е. Coli клетки от 6.7×10-15 литър и плътност на клетките А600 00,5 (еквивалентно на 1×108 клетки мл-1 култура). концентрации на GSH се изчисляват чрез изваждане на 2 [GSSG] от общо глутатион. (Мюлер и др. 2016 г.)

Ултразвуков разкъсващо за клетъчно разграждане и добив на биологичен материал (Кликнете за увеличение!)

Сонда тип ултрасоникатор UP400St

Експресия на човешки mAspAT в E.coli

Ултразвуково клетка дисруптор UP400St (400W) за добив на вътреклетъчния значение (например протеини, органели, ДНК, РНК и т.н.)Единична колония на Е.коли BL21 (DE3), приютяващ експресионния вектор в 30 мл Luria-Bertani (LB) среда, съдържаща 100 ug / мл ампицилин, и след това култивирани при 37 ° С до оптична плътност (OD600) Достигна 0.6. Клетките се събират чрез центрофугиране при 4000 х г за 10 минути и се ресуспендират в 3L прясна LB среда, съдържаща 100 ug / мл ампицилин.
След това, експресия на протеин се индуцира с 1 тМ изопропил-β ᴅ-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в продължение на 20 часа при 16 °. Клетките се събират чрез центрофугиране при 8000 х г за 15 минути и се промиват с буфер А (20 тМ NaH2PO4, 0.5 М NaCl, рН 7.4). Приблизително 45 g (влажно тегло) клетки са получени от 3 L култура. След центрофугиране, клетъчните пелети се суспендират отново в 40 мл (1 L култура) леденостуден екстракционен буфер А, и се лизират чрез ултразвук в ледено студен температура, като се използва UP400St инструмент (д-р Hielscher GmbH, Германия). лизис на клетките се центрофугират при 12,000 оборота в минута в продължение на 15 минути за отделяне разтворим (супернатант) и се утаява (пелети) фракции. (Jiang и др. 2015 г.)

Таблицата по-долу дава индикация за приблизителната капацитет за преработка на нашите ultrasonicators:

Партида том Дебит Препоръчителни Devices
00,5 до 1,5 ml п.а. VialTweeter
1 до 500mL 10 до 200 ml / мин UP100H
10 до 2000mL 20 до 400 ml / мин Uf200 ः т, UP400St
00,1 до 20L 00,2 до 4 л / мин UIP2000hdT
10 до 100L 2 до 10 л / мин UIP4000
п.а. 10 до 100 L / мин UIP16000
п.а. по-голям струпване на UIP16000

Свържете се с нас! / Попитай ни!

Моля, използвайте формата по-долу, ако желаете да изиска допълнителна информация за ултразвукова хомогенизиране. Ние ще се радваме да Ви предложим ултразвукова система, отговарящи на вашите изисквания.









Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,


Позоваването литература /



Факти заслужава да се знае

Д. Коли

Escherichia coli (Е. coli) е грам-отрицателна, факултативно анаеробна, пръчковидна колоидна бактерия от рода Escherichia, която обикновено се намира в долната част на червата на топлокръвни организми (ендотерми). Има голям брой щамове (или подтипове) от Е. coli с различни характеристики. Повечето щамове на Е. coli са безвредни за хората, напр. Щамове В и К-12, които се използват обикновено за изследователски приложения в лаборатории. Някои щамове обаче са вредни и могат да причинят сериозно заболяване.
Е. коли играе важна роля в съвременната биологична инженеринг и индустриалната микробиология тъй като бактериите е лесно да се манипулира. Общи лабораторни приложения, които включват често използването на Е. коли, например да се създаде рекомбинантен дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) или да действа като модел организъм.
Е.коли е много гъвкав гостоприемник за производство на хетероложни протеини и многобройни протеин експресионни системи са на разположение за производство на рекомбинантни протеини в E.coli. Използването на плазмиди, които позволяват високо ниво на експресия на протеин, гените могат да бъдат въведени в бактериите, което позволява да се получат такива протеини в големи количества в процеса на промишлени ферментация.
E.coli се използват като клетъчни фабрики за производството на инсулин. Други приложения включват използването на модифицирани клетки от E.coli за разработване и производство на ваксини и имобилизирани ензими, за производство на биогорива, както и за биоремедиацията.
Щамът К-12 е мутантна форма на Е. Coli, че свръх-експресира ензима алкална фосфатаза (ALP). Тази мутация се дължи на дефект в гена, който постоянно кодира ензима. Ако ген произвежда продукт без инхибиране това е известно като конститутивна активност. Този специфичен мутантна форма се използва за изолиране и пречистване на ензима алкална фосфатаза.

Ултразвуково ДНК срязване

Ултразвукови сили на срязване са често използван метод за отделяне от клетката и се прекъсне ДНК нишки на парчета. Акустични кавитация разгражда стените и мембрани клетъчните за извличане на ДНК от клетки и генерират фрагменти от около 600 – 800 нд в дължина, която е идеална за анализ.
Кликнете тук, за да научите повече за ултразвукови хомогенизатори за ДНК фрагментация!