Ултразвуков лизис на E. Coli
- Бактериите E. coli са най-често използваните бактерии в микробиологията и биотехнологиите.
- Ултразвуковите клетъчни разрушители осигуряват надеждни и възпроизводими резултати за лизиса на E. coli.
- Интензивните, но прецизно контролирани сили на кавитация и срязване водят до пълно разрушаване и високи добиви на екстракция (напр. протеини, ДНК).
Защо ултразвуковото клетъчно разрушаване на E. coli е предпочитаният метод?
Ултразвуковите хомогенизатори или ултразвуковите сонди предлагат няколко предимства за лизиса на E. coli, тъй като интензивният ултразвук ефективно разрушава клетъчните стени и мембрани. Ултразвуковите апарати тип сонда се използват широко за лизис на E. coli поради следните причини:
Извличането на протеини от клетките на E.coli се извършва ефективно с ултразвукова сонда UP200St
Ултразвуковият ултразвук тип сонда предлага много предимства за лизис на E. coli. Надеждният и прецизен контрол върху ултразвуковите параметри на процеса позволява да се оптимизират работните параметри като мощност, продължителност и работа с проби за постигане на желаните резултати.
Електрофоретични анализи на геномна ДНК на E. coli EDL933, подложени на 0 – 15 мин ултразвук. L показва ДНК стълбата.
(проучване и изображение: ©Basselet et al. 2008)
Клетъчно разрушаване с помощта на ултразвукова кавитация
Ултразвуковите хомогенизатори тип сонда работят с приблизително 20 000 цикъла в секунда (при 20kHz) и причиняват кавитация в течности или суспензии. Акустична кавитация микроскопични области с вакуумно налягане и високи температури, които разкъсват клетките. Въпреки че температурите могат да достигнат няколко хиляди градуса по Целзий, обемите на кавитацията са толкова малки, че не загряват значително процеса. Ултразвуково генерираната акустична кавитация и срязващи сили перфорират или разрушават клетъчната мембрана на бактериални клетки като E.coli. Ултразвуковите апарати Hielscher позволяват прецизен контрол върху параметрите на процеса като ултразвуков интензитет, амплитуда, входяща енергия и температура. По този начин процесът на ултразвуков лизис може да бъде адаптиран оптимално към типа клетка, клетъчната култура и целта на процеса.
- прецизен контрол на лизиса (интензивност, амплитуда, температура)
- надеждни, възпроизводими резултати
- оптимална адаптация към конкретни проби
- контрол на температурата
- за много малки до много големи проби (μL в литри)
- Чисто механична обработка
- Лесна за използване, безопасна работа
- Линейно мащабиране от лабораторията до производството
ФлаконВисокоговорител за високи честоти за ултразвуков лизис
Ултразвуков хомогенизатор срещу други техники за лизис
Докато химическата и ензимната лизиса може да бъде проблематична – тъй като химичният лизис може да промени протеиновите структури и да създаде проблеми с пречистването, ензимният лизис изисква дълго време на инкубация и не е възпроизводим – Ултразвуковото разрушаване е сложен, бърз метод за разрушаване на клетките.
Ултразвуковият лизис се основава само на механични сили. Не се добавят химикали, ултразвукът разрушава клетъчната стена чрез срязващи сили. Химичният лизис може да промени структурата на протеина и да създаде проблеми с пречистването. Ензимното разрушаване изисква дълго време на инкубация и не е възпроизводимо. Ултразвуковото разрушаване на клетките на бактериите E.coli е бързо, просто, надеждно и възпроизводимо. Ето защо ултразвуковите апарати на Hielscher се използват в биологични и биохимични лаборатории по целия свят за подготовка на проби, преданалитични изследвания, in vitro диагонистика и многообразни анализи.
Общи препоръки за ултразвуков лизис
Соникацията е най-популярната техника за лизинг на много малки, средни и големи количества клетъчни суспензии – от пиколитри до 100 л/час (с помощта на ултразвукова проточна клетка). Клетките се лизират чрез течно срязване и кавитация. ДНК също се срязва по време на ултразвук, така че не е необходимо да се добавя ДНКаза към клетъчната суспензия.
Контрол на температурата по време на ултразвуков лизис на E.coli
Чрез предварително охлаждане на пробата и задържане на пробата по време на ултразвук върху лед, термичното разграждане на пробата може лесно да бъде предотвратено.
В идеалния случай пробите трябва да се съхраняват ледено студени по време на лизис, но за повечето проби е достатъчно температурата да не се повиши над температурата на културата или тъканния източник. Затова се препоръчва суспензията да се държи върху лед и да се ултразвукови импулси с няколко кратки ултразвукови импулса от 5-10 сек и паузи от 10-30 сек. По време на паузите топлината може да се разсее, за да се възстанови ниска температура. За по-големи клетъчни проби се предлагат различни реактори с проточни клетки с охлаждащи ризи.
Прочетете тук подробни съвети и препоръки за успешен ултразвуков лизис!
Протоколи за ултразвуково приготвяне на лизати на E. coli
Изследователите използват ултразвукови хомогенизатори на Hielscher за разрушаване на клетките на E.coli. По-долу можете да намерите различни тествани и доказани протоколи за лизис на E.coli, като използвате ултразвукови хомогенизатори на Hielscher за различни приложения, свързани с E. coli.
Клетъчен растеж, омрежване и приготвяне на клетъчни екстракти от E. coli с помощта на ултразвук
За SeqA и РНК полимераза ChIP-чип E. coli MG1655 или MG1655 ΔseqA се отглежда при 37°C до OD600 около 0,15 в 50 ml LB (+ 0,2% глюкоза) преди добавянето на 27 μl формалдехид (37%) на ml среда (крайна концентрация 1%). Омрежването се извършва при бавно разклащане (100 об / мин) при стайна температура в продължение на 20 минути, последвано от закаляване с 10 ml 2,5 M глицин (крайна концентрация 0,5 M). За експерименти с топлинен шок E. coli MG1655 се отглежда в 65 ml LB среда при 30°C до OD600 от около 0,3. Впоследствие 30 ml култура се прехвърлят в предварително затоплена колба при 43°C, а останалата част се съхранява при 30°C. Омрежването и закаляването са както е описано по-горе, с изключение на това, че клетките се държат на 30 или 43°C в продължение на 5 минути, преди по-нататъшно бавно разклащане при стайна температура. Клетките са събрани чрез центрофугиране и промити два пъти със студена TBS (pH7.5). След ресуспендиране в буфер от 1 ml лизис (10 mM Tris (pH 8.0), 20% захароза, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml лизозим) и инкубация при 37°C за 30 минути, последвано от добавяне на 4 ml IP буфер, клетките се озвучават върху лед с 12 прекъсвания по 30 секунди и 30 секунди с помощта на ултразвуковия процесор на Hielscher UP400St при 100% настройка на мощността. След центрофугиране в продължение на 10 минути при 9000 g, 800 μl аликвоти от супернатанта се съхраняват при -20°C. (Waldminghaus 2010)
Свръхпроизводство и пречистване на ензими с ултразвукова сонда
За свръхпроизводство на маркирани с декахистидин (His10) протеини, E. coli BL21(DE3) е трансформиран с pET19b конструкции. Прекултурата за една нощ е събрана чрез центрофугиране и 1% е използван за инокулиране на експресивна култура. Клетките, носещи pET19mgtB, се отглеждат при 22°C до оптична плътност при 600 nm (OD600) от 0,7. Културата е прехвърлена на 17°C и индуцирана от 100 μM IPTG. След 16 часа културата е събрана чрез центрофугиране при 7 500 × g при 4°C. Клетките са ресуспендирани в 50 mM фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) с 0,3 M NaCl при рН 7,4 и нарушени чрез ултразвук с S2 микро-накрайник сонотрод на ултразвуковия разтвор на Hielscher UP200St при цикъл от 0,5 и амплитуда от 75%.
Свръхпроизводството на маркирани с декахистидин GtfC е индуцирано при 37°C при OD600 от 0,6 със 100 μM IPTG. След това клетките се инкубират в продължение на 4 часа, събират се и се лизират, както е посочено по-горе за MgtB.
Суровите клетъчни екстракти се центрофугират при 15 000 × g и 4°C, за да се утаят клетъчните отломки. Избистрените екстракти са заредени на 1 ml колони HisTrap FF Crude с помощта на система ÄKTAprime Plus. Ензимите са пречистени съгласно протокола на производителя за градиентно елуиране на His-маркирани протеини. Елутираните протеинови разтвори са диализирани два пъти срещу 1,000 обема от 50 mM PBS, pH 7.4, с 0.3 M NaCl при 4°C. Пречистването е анализирано от 12% SDS-PAGE. Концентрацията на протеин е определена по метода на Брадфорд с помощта на Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ултразвукова екстракция на протеин от бактерии E. coli
Протеин на стръвта, представляващ интерес (в този случай MTV1 на Arabidopsis thaliana) се слива с GST етикет и се експресира в BL21 Escherichia coli (E. coli) клетки.
- Вземете по една пелета GST-MTV1 и GST (съответстващи на 50 ml бактериална култура) и ресуспендирайте всяка в 2,5 ml ледено студен буфер за екстракция.
- Използвайте ултразвуков апарат UP100H (оборудван с MS3 микронакрайник-сонотроде за малки обеми от приблизително 2-5 ml), за да разстроите бактериалните клетки, докато се лизират, което се показва от намалена непрозрачност и повишен вискозитет. Това трябва да се извърши върху лед и се препоръчва ултразвук на интервали (напр. 10 секунди ултразвук, последвани от 10 секунди пауза върху лед и т.н.). Трябва да се внимава да не се излъчва ултразвук с твърде висока интензивност. Ако се открие разпенване или образуване на бяла утайка, интензивността трябва да бъде намалена.
- Прехвърлете разтвора на лизирани бактерии в епруветки за микроцентрофуги с вместимост 1,5 ml и центрофугата при 4°C, 16 000 x g за 20 минути.
Ултразвукови апарати тип сонда като UP400St използвайте принципа на работа на акустичната кавитация за ефективна лизис на E.coli.
Анализ на експресията и пречистване на рекомбинантен протеин с помощта на соникация
Пелетите от E. coli бяха ултразвукови с ултразвуковия апарат Hielscher UP100H. За тази цел клетъчната пелета се ресуспендира в охладен буфер за лизис (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) и се охлажда върху лед за 10 минути. След това клетъчната суспензия е ултразвукова с 10 кратки изблика от 10 секунди, последвани от интервал от 30 секунди за охлаждане. Накрая, клетъчните остатъци се отстраняват чрез ултрацентрофугиране при 4°C за 15 минути при 14000 об/мин. За потвърждение на експресията на rPR, супернатантата е пусната на 12% полиакриламиден гел и анализирана чрез SDS-PAGE и Western blotting. Пречистването на rPR е извършено с помощта на Ni2+-NTA смола (Invitrogen, САЩ) съгласно ръководството на производителя. На този етап е използван метод на естествено пречистване. Чистотата на пречистения протеин е оценена с помощта на електрофореза на 12% полиакриламиден гел и последващо оцветяване в синьо Coomassie. Концентрацията на пречистен протеин е измерена с комплект за анализ на микро BCA протеин (PIERCE, САЩ). (Azarnezhad et al. 2016)
Ултразвукови хомогенизатори за лизис на E. coli
Hielscher Ultrasonics проектира, произвежда и доставя високоефективни ултразвукови хомогенизатори за надежден и ефективен лизис на бактерии E. coli и други видове клетки, тъкани и клетъчни култури.
Широкото портфолио от ултразвукови сонди, както и системи за индиректна ултразвукова звукова реакция ни позволява да ви предложим идеалния ултразвуков тъканен хомогенизатор за вашето приложение за разрушаване и екстракция на клетки.
Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Интелигентен софтуер, интуитивно меню, програмируеми настройки и автоматично протоколиране на данни са само някои от функциите на ултразвуковите апарати Hielscher. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в изследователски и биотехнологични съоръжения. Дори тежки условия и взискателна среда се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови апарати:
| Обем на партидата | Дебит | Препоръчителни устройства |
|---|---|---|
| многоямкови / микротитрни плаки | Н.А. | UIP400MTP |
| CupHorn за флакони или чаша | Н.А. | Ултразвуков CupHorn |
| ултразвуков микропоточн реактор | Н.А. | GDmini2 |
| до 10 флакона с вместимост от 0,5 до 1,5 ml | Н.А. | ФлаконВисокоговорител за високи честоти |
| 0.5 до 1,5 мл | Н.А. | ФлаконВисокоговорител за високи честоти |
| 1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | UP100H |
| 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 до 20L | 0.2 до 4 л/мин | UIP2000hdT |
| 10 до 100L | 2 до 10 л/мин | UIP4000 |
| Н.А. | 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
| Н.А. | Голям | Клъстер от UIP16000 |
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Допълнителни протоколи за ултразвукова лизис на E. coli
Алицин-модифицирани протеини в E. coli с помощта на ултразвуков високоговорител за високи честоти
Определяне на сулфхидрилното съдържание чрез анализ на 5,5'-дитиобис (2-нитробензоена киселина) (DTNB)
За инокулиране на минимална среда на MOPS е използвана култура с E. coli MG1655 през нощта (1:100). Културата се отглежда аеробно, докато не се достигне A600 от 0,4. Културата е разделена на три култури от 15 ml за лечение на стрес. Нелекуваната култура служи като отрицателен контрол. 0,79 mM алицин (128 μg ml-1) или 1 mM диамид се добавят към една от останалите две култури всяка. Културите се инкубират в продължение на 15 минути. 5 ml от всяка култура се събират чрез центрофугиране (8 525 × g, 4°C, 10 min). Клетките се промиват два пъти с 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, съхраняват се анаеробно преди употреба) и се центрофугират (13 000 × g, 4°C, 10 min). Клетките са ресуспендирани в лизис буфер (PBS с 6 mM гуанидиний HCl, pH 7.4) преди разрушаване при 4°C чрез ултразвук (ФлаконВисокоговорител за високи честоти ултразвуков апарат, Hielscher GmbH, Германия) (3 × 1 мин). Клетъчните остатъци са гранулирани чрез центрофугиране (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Супернатантата се прехвърля в 3,5 ml QS-макро кювета (10 mm) с магнитно разбъркване и се смесва с 1 ml лизисен буфер. Изчезването на пробите се наблюдава при 412 nm със спектрофотометър Jasco V-650, оборудван с държач за клетка с контролирана температура PSC-718 при стайна температура. Добавени са 100 μl 3 mM разтвор на дитиобис (2-нитробензоена киселина). Изчезването е наблюдавано, докато достигне насищане. Изчисляването на концентрацията на тиол е извършено с помощта на коефициента на екстинкция ε412 = 13 700 М-1 См-1 за тио-2-нитробензоена киселина (TNB). Клетъчните концентрации на тиол са изчислени въз основа на обем клетки на E. coli от 6,7 × 10-15 литър и клетъчна плътност A600 = 0,5 (еквивалентна на 1 × 108 клетки ml-1 култура). (Müller et al. 2016)
Определяне на глутатион in vivo с помощта на ултразвукова клетъчна трошачка
E.coli MG1655 се отглежда в минимална среда MOPS в общ обем от 200 ml, докато се достигне A600 от 0,5. Културата е разделена на 50 ml култури за лечение на стрес. След 15 минути инкубация с 0,79 mM алицин, 1 mM диамид или диметилсулфоксид (контрола), клетките са събрани при 4 000 g при 4°C за 10 минути. Клетките са промити два пъти с KPE буфер преди ресуспендирането на пелетите в 700 μl KPE буфер. За депротеинация се добавят 300 л 10% (w/v) сулфосалицилова киселина преди разрушаване на клетките чрез ултразвук (3 x 1 min; ФлаконВисокоговорител за високи честоти ултразвук). Супернатантите са събрани след центрофугиране (30 min, 13 000 g, 4°C). Концентрациите на сулфосалицилова киселина са намалени до 1% чрез добавяне на 3 обема KPE буфер. Измерванията на общия глутатион и GSSG са извършени, както е описано по-горе. Клетъчните концентрации на глутатион са изчислени въз основа на обем клетки на E. coli от 6,7×10-15 литър и клетъчна плътност A600 0,5 (еквивалентна на 1×108 клетки ml-1 култура). Концентрациите на GSH са изчислени чрез изваждане на 2[GSSG] от общия глутатион. (Müller et al. 2016)
Експресия на човешки mAspAT при E. coli с помощта на ултразвуков хомогенизатор
Единичната колония на E. coli BL21 (DE3), съдържаща експресионния вектор в 30 ml среда на Лурия-Бертани (LB), съдържаща 100 μg/ml ампицилин, и след това култивирана при 37ºC до оптична плътност (OD600) достига 0,6. Клетките са събрани чрез центрофугиране при 4 000 × g за 10 минути и ресуспендирани в 3 L прясна LB среда, съдържаща 100 μg/ml ампицилин.
Впоследствие протеиновата експресия е индуцирана с 1 mM изопропил β-ᴅ-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в продължение на 20 часа при 16ºC. Клетките се събират чрез центрофугиране при 8 000 × g за 15 минути и се промиват с буфер A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Приблизително 45 g (мокро тегло) клетки са получени от 3 L култура. След центрофугирането, клетъчните пелети са ресуспендирани в 40 ml (за 1 L култура) ледено студен екстракционен буфер А и лизирани чрез ултразвукова при ледено студена температура с помощта на ултразвуковата клетъчна трошачка Hielscher UP400St. Клетъчният лизис се центрофугира при 12 000 оборота в минута за 15 минути, за да се отделят разтворимите (супернатант) и утаените (пелети) фракции. (Jiang et al. 2015)
Факти, които си струва да знаете
Ешерихия коли
Escherichia coli (E. coli) е грам-отрицателна, факултативно анаеробна, пръчковидна, колиформна бактерия от рода Escherichia, която обикновено се среща в долната част на червата на топлокръвни организми (ендотерми). Има голям брой щамове (или подтипове) на E. coli с различни характеристики. Повечето щамове на E. coli са безвредни за хората, например щамове B и K-12, които обикновено се използват за изследователски приложения в лаборатории. Някои щамове обаче са вредни и могат да причинят сериозно заболяване.
E. coli играе важна роля в съвременното биологично инженерство и индустриална микробиология, тъй като бактериите са лесни за манипулиране. Често срещани лабораторни приложения, които често включват използването на E. coli, например за създаване на рекомбинантна дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) или за действие като моделен организъм.
E. coli е много универсален гостоприемник за производството на хетероложни протеини и са налични многобройни системи за експресия на протеини за производство на рекомбинантни протеини в E. coli. С помощта на плазмиди, които позволяват високо ниво на експресия на протеин, гените могат да бъдат въведени в бактериите, което позволява да се произвеждат такива протеини в големи количества в промишлени ферментационни процеси.
E.coli се използват като клетъчни фабрики за производство на инсулин. Други приложения включват използването на модифицирани клетки на E. coli за разработване и производство на ваксини и обездвижени ензими, за производство на биогорива, както и за биоремедиация.
Щамът K-12 е мутантна форма на E. coli, която свръхекспресира ензима алкална фосфатаза (ALP). Тази мутация възниква поради дефект в гена, който постоянно кодира ензима. Ако ген произвежда продукт без никакво инхибиране, това е известно като конститутивна активност. Тази специфична мутантна форма се използва за изолиране и пречистване на ензима ALP.
Бактериите E. coli също се използват широко като клетъчни фабрики. Модифицираните микроби (напр. бактерии) и растителни клетки могат да се използват като така наречените клетъчни фабрики. Тези генетично модифицирани клетки произвеждат молекули, химикали, полимери, протеини и други вещества, които се използват например във фармацевтичната, хранително-вкусовата и химическата промишленост. За да се освободят молекулите, произведени във вътрешността на такива биоинженерни клетки, ултразвуковият лизис е често срещан метод за разрушаване на клетъчните стени и за прехвърляне на целевите вещества в околната течност. Прочетете повече за лизиса на биоинженерни клетки!
Ултразвуково срязване на ДНК
Ултразвуковите сили на срязване са често използван метод за освобождаване на молекули, органели и протеини от вътрешността на клетката, както и за разбиване на ДНК нишки на парчета. Акустичната кавитация разрушава клетъчните стени и мембрани, за да извлече ДНК от клетките и да генерира фрагменти от около 600 – 800 bp дължина, което е идеално за анализ.
Кликнете тук, за да научите повече за ултразвуковите хомогенизатори за фрагментация на ДНК!
Литература / Препратки
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.