Ултразвуков лизис на биоинженерни клетки в промишленото производство

Биоинженерни бактериални видове като E. coli, както и генетично модифицирани типове клетки на бозайници и растения, се използват широко в биотехнологиите за експресия на молекули. За освобождаването на тези синтезирани биомолекули е необходим надежден метод за разрушаване на клетките. Високопроизводителната ултразвукова обработка е доказан метод за ефективен и надежден клетъчен лизис – лесно мащабируем до големи обеми на обработка. Hielscher Ultrasonics Ви предлага високопроизводително ултразвуково оборудване за ефективен клетъчен лизис с цел производство на големи обеми висококачествени биомолекули.

Извличане на молекули от клетъчни фабрики

За производството на широк спектър от биомолекули като микробни клетъчни фабрики могат да се използват различни инженерно модифицирани микроорганизми и растителни клетки, включително Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana и водорасли, наред с много други. Тези клетъчни фабрики могат да произвеждат протеини, липиди, биохимични вещества, полимери, биогорива и олеохимикали, които се използват като храна или суровина за промишлени приложения. Клетките, използвани като клетъчни фабрики, се култивират в затворени биореактори, където могат да постигнат висока ефективност, специфичност и ниски енергийни потребности.
За да се изолират целевите молекули от биоинженерните клетъчни култури, клетките трябва да бъдат разрушени, така че да се освободи вътреклетъчният материал. Ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките са утвърдени като изключително надежден и ефективен метод за дезинтеграция на клетките и освобождаване на съединения.

Микробните клетъчни фабрики са клетки с инженерно модифициран метаболизъм, използвани за синтез на различни ценни съединения. Ултразвуковото разрушаване на клетките е ефективен и надежден метод за освобождаване на ценните съединения от вътрешността на клетките.
изследване и графика: ©Villaverde, 2010.

Предимства на ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките

Като нетермична, щадяща, но високоефективна технология, ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките се използват в лаборатории и в промишлеността за лизис на клетки и за производство на висококачествени екстракти, използвани например за изолиране на молекули от клетъчни фабрики.

Мощен ултразвук за ефективно разрушаване на микробни клетъчни фабрики

Механизъм и ефекти на ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките:
Ултразвуковото разрушаване на клетките използва мощността на ултразвуковите вълни. Ултразвуковият хомогенизатор / устройството за разрушаване на клетките е оборудвано със сонда (наричана също сонотрод), изработена от титанова сплав, която осцилира с висока честота от приблизително 20 kHz. Това означава, че ултразвуковата сонда предава 20 000 трептения в секунда в течността, подложена на ултразвукова обработка. Ултразвуковите вълни, предавани в течността, се характеризират с редуващи се цикли на високо / ниско налягане. По време на цикъл на ниско налягане течността се разширява и възникват миниатюрни вакуумни мехурчета. Тези много малки мехурчета нарастват в продължение на няколко редуващи се цикъла на налягане, докато вече не могат да поглъщат допълнителна енергия. В този момент кавитационните мехурчета имплодират бурно и локално създават среда с изключително висока енергийна плътност. Това явление е известно като акустична кавитация и се характеризира с локално много високи температури, много високи налягания и сили на срязване. Тези напрежения на срязване ефективно разрушават клетъчните стени и увеличават масообмена между вътрешността на клетката и околния разтворител. Като изцяло механичен метод, ултразвуково генерираните сили на срязване се използват широко и представляват препоръчителна процедура за разрушаване на бактериалните клетки, както и за изолиране на протеини. Като прост и бърз метод за разрушаване на клетките, ултразвуковата обработка е идеална за изолиране в малки, средни и големи обеми. Цифровите ултразвукови устройства на Hielscher са оборудвани с ясно меню с настройки за прецизен контрол на ултразвуковата обработка. Всички данни за ултразвуковата обработка се съхраняват автоматично на вградена SD карта и са леснодостъпни. Усъвършенстваните възможности за отвеждане на топлина, като външно охлаждане, ултразвукова обработка в импулсен режим и др. по време на ултразвуковата дезинтеграция, осигуряват поддържането на идеалната температура на процеса и по този начин запазването на целостта на извлечените термочувствителни съединения.

Изследванията подчертават силните страни на ултразвуковото разрушаване на клетките и екстракцията

Проф. Chemat и съавт. (2017) обобщават в своето изследване, че „ултразвуково подпомаганата екстракция е екологична и икономически жизнеспособна алтернатива на конвенционалните методи за хранителни и природни продукти. Основните ползи са намаляване на времето за екстракция и обработка, количеството използвана енергия и разтворители, броя на единичните операции и емисиите на CO₂ .“
Gabig-Ciminska и съавт. (2014) използват хомогенизатор с високо налягане и ултразвуков клетъчен дезинтегратор в своето изследване за лизис на спори с цел освобождаване на ДНК. Сравнявайки двата метода за разрушаване на клетките, изследователският екип заключава относно клетъчния лизис за получаване на ДНК от спори: „анализът беше извършен с клетъчни лизати, получени чрез хомогенизация с високо налягане. След това осъзнахме, че ултразвуковото разрушаване на клетките има изключителни предимства за тази цел. То е доста бързо и може да се прилага за малки обеми проби.“ (Gabig-Ciminska и съавт., 2014)

Биомолекули от клетъчни фабрики за производство на храни

Микробните клетъчни фабрики представляват жизнеспособен и ефективен производствен подход, който използва микробни организми за получаване на високи добиви на естествени и неестествени за тях метаболити чрез метаболитно биоинженерство на микроорганизми като бактерии, дрожди, гъби и др. Например ензими в големи количества се произвеждат с помощта на микроорганизми като Aspergillus oryzae, гъби и бактерии. Тези ензими се използват за производство на храни и напитки, както и в селското стопанство, биоенергетиката и грижата за дома.
Някои бактерии като Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus произвеждат целулоза по време на ферментационния процес, при който нановлакната се синтезират чрез изграждане от по-малки структурни единици. Бактериалната целулоза (известна също като микробна целулоза) е химически еквивалентна на растителната целулоза, но има висока степен на кристалинност и висока чистота (без лигнин, хемицелулоза, пектин и други биогенни компоненти), както и уникална структура на триизмерна (3D) мрежа, изплетена от целулозни нановлакна. (вж. Zhong, 2020) В сравнение с целулозата от растителен произход, бактериалната целулоза е по-устойчива от екологична гледна точка, а произведената целулоза е чиста и не изисква сложни етапи на пречистване. Ултразвуковата обработка и екстракцията с разтворител с използване на NaOH или SDS (натриев додецилсулфат) са много ефективни за изолиране на бактериална целулоза от бактериалните клетки.

Биомолекули от клетъчни фабрики за производство на фармацевтични продукти и ваксини

Един от най-значимите фармацевтични продукти, получавани от клетъчни фабрики, е човешкият инсулин. За биоинженерно производство на инсулин се използват предимно E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Тъй като биосинтезираните молекули с наноразмери осигуряват висока биосъвместимост, биологични наночастици като феритина са полезни за множество приложения в биопроизводството. Освен това производството в микроорганизми с инженерно модифициран метаболизъм често е значително по-ефективно по отношение на получените добиви. Например производството на артемизининова киселина, ресвератрол и ликопен е увеличено от десет до няколкостотин пъти и вече е установено или се разработва за производство в промишлен мащаб. (вж. Liu и съавт.; Microb. Cell Fact. 2017)
Например протеинови биомолекули с наноразмери и свойства за самосглобяване, като феритин и вирусоподобни частици, са особено интересни за разработването на ваксини, тъй като имитират както размера, така и структурата на патогените и позволяват конюгиране на антигени към повърхността си за насърчаване на взаимодействието с имунните клетки. Такива молекули се експресират в така наречените клетъчни фабрики (например инженерно модифицирани щамове на E. coli), които произвеждат определена целева молекула.

Протокол за ултразвуков лизис на E. coli BL21 за освобождаване на феритин

Феритинът е протеин, чиято основна функция е съхранението на желязо. Феритинът показва обещаващи възможности като самосглобяващи се наночастици във ваксини, където се използва като носител за доставяне на ваксини (например шиповите протеини на SARS-Cov-2). Научното изследване на Sun и съавт. (2016) показва, че рекомбинантният феритин може да бъде освободен в разтворима форма от Escherichia coli при ниски концентрации на NaCl (≤50 mmol/L). За експресия на феритин в E. coli BL21 и за освобождаването му е приложен успешно следният протокол. Рекомбинантният плазмид pET-28a/ferritin е въведен чрез трансформация в щама E coli BL21 (DE3). Клетките E coli BL21 (DE3), експресиращи феритин, са култивирани в хранителна среда LB с 0,5% канамицин при 37°C и са индуцирани при OD600 от 0,6 с 0,4% изопропил-β-D-тиогалактопиранозид за 3 часа при 37°C. След това крайната култура е събрана чрез центрофугиране при 8000g за 10 минути при 4°C и е отделена утайката. След това утайката е ресуспендирана съответно в среда LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% екстракт от дрожди)/лизисен буфер (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) и разтвор на NaCl с различни концентрации (0, 50, 100, 170 и 300 mmol/L). За лизис на бактериалните клетки е приложена ултразвукова обработка в импулсен режим: например с използване на ултразвуковото устройство UP400St при 100% амплитуда с работен цикъл от 5 секунди включено, 10 секунди изключено, за 40 цикъла), последвана от центрофугиране при 10 000g за 15 минути при 4°C. Супернатантът и утайката са анализирани чрез електрофореза в полиакриламиден гел с натриев додецилсулфат (SDS-PAGE). Всички гелове, оцветени с натриев додецилсулфат, са сканирани със скенер с висока разделителна способност. Изображенията на геловете са анализирани със софтуера Magic Chemi 1D. За оптимална яснота протеиновите ивици са открити чрез настройване на параметрите. Данните за ивиците са получени от три технически повторения. (вж. Sun и съавт., 2016)

Ултразвукови устройства за разрушаване на клетките за промишлен лизис на клетъчни фабрики

Ултразвуковият лизис и екстракцията са надежден и удобен метод за освобождаване на метаболити от клетъчни фабрики, като по този начин подпомагат ефективното производство на целеви молекули. Ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките се предлагат в размери от лабораторни до промишлени, а процесите могат да се мащабират напълно линейно.
Hielscher Ultrasonics е Вашият компетентен партньор за високопроизводителни ултразвукови устройства за разрушаване на клетките и има дългогодишен опит във внедряването на ултразвукови системи в настолни и промишлени установки.
Що се отнася до усъвършенствания хардуер и софтуер, системите за разрушаване на клетките на Hielscher Ultrasonics изпълняват всички изисквания за оптимален контрол на процеса, лесна работа и удобство за потребителя. Клиентите и потребителите на ултразвуковите устройства на Hielscher ценят предимството, че ултразвуковите устройства за разрушаване на клетките и екстракция на Hielscher позволяват прецизно наблюдение и контрол на процеса – чрез цифров сензорен дисплей и дистанционно управление през браузър. Всички важни данни за ултразвуковата обработка (например нетна енергия, обща енергия, амплитуда, продължителност, температура, налягане) се съхраняват автоматично като CSV файл на вградена SD карта. Това спомага за получаването на възпроизводими и повторяеми резултати и улеснява стандартизирането на процеса, както и спазването на добрите производствени практики (cGMP).
Разбира се, ултразвуковите процесори на Hielscher са конструирани за работа 24/7 при пълно натоварване и следователно могат да се използват надеждно в условията на промишлено производство. Благодарение на високата издръжливост и малките потребности от поддръжка, времето на престой на ултразвуковото оборудване е наистина кратко. Функциите CIP (почистване на място) и SIP (стерилизация на място) свеждат до минимум трудоемкото почистване, особено защото всички части в контакт с течността имат гладки метални повърхности (без скрити отвори или дюзи).

Таблицата по-долу Ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови устройства: