Ултразвуков лизис на биоинженерни клетки в промишленото производство

Биоинженерните бактериални видове като E. coli, както и генетично модифицираните видове бозайници и растителни клетки се използват широко в биотехнологиите за експресия на молекули. За да се освободят тези синтезирани биомолекули, е необходима надеждна техника за клетъчно разрушаване. Високоефективната ултразвукова диагностика е доказан метод за ефективен и надежден клетъчен лизис – лесно мащабируем до големи пропускателни способности. Hielscher Ultrasonics ви предлага високопроизводително ултразвуково оборудване за ефикасен клетъчен лизис с цел производство на големи обеми висококачествени биомолекули.

Извличане на молекули от клетъчни фабрики

За производството на широк спектър от биомолекули различни модифицирани микроби и растителни клетки могат да се използват като фабрики за микробни клетки, включително Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica, Nicotiana benthamiana и водорасли, наред с много други. Тези клетъчни фабрики могат да произвеждат протеини, липиди, биохимикали, полимери, биогорива и олеохимикали, които се използват като храна или суровина за промишлени приложения. Клетките, използвани като клетъчни фабрики, се култивират в затворени биореактори, където могат да постигнат висока ефективност, специфичност и ниски енергийни изисквания.
За да се изолират целевите молекули от биоинженерните клетъчни култури, клетките трябва да бъдат разрушени, така че вътреклетъчният материал да се освободи. Ултразвуковите клетъчни разрушители са добре установени като високонадеждна и ефективна техника за разпадане на клетките и освобождаване на съединения.

Фабриките за микробни клетки са метаболитно модифицирани клетки, използвани за синтез на различни ценни съединения. Ултразвуковото разрушаване на клетките е ефективен и надежден метод за освобождаване на ценните съединения от вътрешността на клетката.
проучване и графика: ©Villaverde, 2010.

Предимства на ултразвуковите клетъчни разрушители

Като нетермична, мека, но високоефективна технология, ултразвуковите разрушители се използват в лабораториите и промишлеността за лизиране на клетки и за производство на висококачествени екстракти, например използвани за изолиране на молекули от клетъчни фабрики.

Мощен ултразвук за ефективно разрушаване на фабрики за микробни клетки

Механизъм и ефекти на ултразвуковите клетъчни разрушители:
Ултразвуковото разрушаване на клетките използва силата на ултразвуковите вълни. Ултразвуковият хомогенизатор / клетъчен разрушител е оборудван със сонда (известна още като сонотрод), изработена от титанова сплав, която осцилира с висока честота от около 20 kHz. Това означава, че ултразвуковата сонда свързва 20 000 вибрации в секунда в ултразвуковата течност. Ултразвуковите вълни, свързани с течността, се характеризират с редуващи се цикли на високо / ниско налягане. По време на цикъл на ниско налягане течността се разширява и се появяват малки вакуумни мехурчета. Тези много малки мехурчета растат в продължение на няколко редуващи се цикъла на налягане, докато не могат да абсорбират допълнителна енергия. В този момент кавитационните мехурчета имплодират силно и създават локално изключителна енергийно плътна среда. Това явление е известно като акустична кавитация и се характеризира с локално много високи температури, много високо налягане и сили на срязване. Тези напрежения на срязване разбиват ефективно клетъчните стени и увеличават преноса на маса между вътрешността на клетката и околния разтворител. Като чисто механична техника, ултразвуково генерираните сили на срязване са широко използвани и препоръчителната процедура за разрушаване на бактериалните клетки, както и за изолиране на протеини. Като прост и бърз метод за разрушаване на клетките, ултразвукът е идеален за изолиране на малки, средни и големи обеми. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher са оборудвани с ясно меню от настройки за прецизен контрол на ултразвука. Всички данни за ултразвука се съхраняват автоматично на вградена SD-карта и са лесно достъпни. Усъвършенстваните опции за разсейване на топлината като външно охлаждане, ултразвук в импулсен режим и т.н. по време на процеса на ултразвуково разпадане осигуряват поддържането на идеалната температура на процеса и по този начин целостта на извлечените топлочувствителни съединения.

Изследванията подчертават силните страни на ултразвуковото разрушаване и екстракция на клетки

Chemat et al. (2017) възобновява в своето проучване, че "ултразвуковата екстракция е зелена и икономически жизнеспособна алтернатива на конвенционалните техники за храни и натурални продукти. Основните ползи са намаляване на времето за екстракция и обработка, количеството използвана енергия и разтворители, единични операции и CO₂ емисии."
Gabig-Ciminska et al. (2014) използват хомогенизатор под високо налягане и ултразвуков клетъчен dsintegrator в своето изследване за лизис на спори, за да освободят ДНК. Сравнявайки двата метода за разрушаване на клетките, изследователският екип заключава, че по отношение на клетъчния лизис за спорова ДНК, "анализът е направен чрез използване на клетъчни лизати от хомогенизация под високо налягане. След това разбрахме, че ултразвуковото разрушаване на клетките има изключителни предимства за тази цел. Той е доста бърз и може да бъде обработен за малки обеми проби." (Габиг-Циминска и др., 2014)

Биомолекули от клетъчни фабрики за производство на храни

Фабриките за микробни клетки са жизнеспособна и ефективна производствена методология, използваща микробни организми за производство на високи добиви на местни и неместни метаболити чрез метаболитно биоинженерство на микробни микроорганизми като бактерии, дрожди, гъбички и др. Насипните ензими например се произвеждат с помощта на микроорганизми като Aspergillus oryzae, гъбички и бактерии. Тези насипни ензими се използват за производството на храни и напитки, както и в селското стопанство, биоенергетиката и грижите за домакинството.
Някои бактерии като Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus произвеждат целулоза по време на процеса на ферментация, където нановлакната се синтезират в процес отдолу нагоре. Бактериалната целулоза (известна също като микробна целулоза) е химически еквивалентна на растителната целулоза, но има висока степен на кристалност и висока чистота (без лигнин, хемицелулоза, пектин и други биогенни компоненти), както и уникална структура на триизмерна (3D) мрежеста мрежа, изтъкана от целулозни нановлакна. (срв. Zhong, 2020) В сравнение с целулозата от растителен произход, бактериалната целулоза е по-устойчива и произведената целулоза е чиста, без да изисква сложни стъпки на пречистване. Ултразвукът и екстракцията с разтворител с помощта на NaOH или SDS (натриев додецил сулфат) са много ефективни за изолиране на бактериална целулоза от бактериалните клетки.

Биомолекули от клетъчни фабрики за производство на фармацевтични и ваксини

Един от най-известните фармацевтични продукти, получени от клетъчни фабрики, е човешкият инсулин. За биоинженерно производство на инсулин се използват предимно E. coli и Saccharomyces cerevisiae. Тъй като биосинтезираните наноразмерни молекули предлагат висока биосъвместимост, биологичните наночастици като феритин са изгодни за множество приложения за биопроизводство. Освен това производството на метаболитно модифицирани микроби често е значително по-ефективно при получените добиви. Например, производството на артемизинова киселина, ресвератрол и ликопен се е увеличило десетократно до няколкостотин пъти и вече е установено или е в процес на развитие за промишлено производство. (срв. Liu et al.; Микроб. Клетъчен факт. 2017)
Например, биомолекулите на базата на протеини с наноразмери със самосглобяващи се свойства като феритин и вирусоподобни частици са особено интересни за разработването на ваксини, тъй като имитират както размера, така и структурата на патогените и са податливи на повърхностна конюгация на антигени, за да насърчат взаимодействието с имунните клетки. Такива молекули се експресират в така наречените клетъчни фабрики (напр. инженерни щамове на E. coli), които произвеждат определена целева молекула.

Протокол за ултразвуков лизис и на E. coli BL21 за освобождаване на феритин

Феритинът е протеин, чиято основна функция е съхранението на желязо. Феритинът показва обещаващи възможности като самосглобяващи се наночастици във ваксини, където се използва като средство за доставяне на ваксини (напр. протеини на SARS-Cov-2). Научните изследвания на Сун и др. (2016) показва, че рекомбинантният феритин може да се освободи като разтворима форма от Escherichia coli при ниски концентрации на NaCl (≤50 mmol/L). За да се експресира феритин в E. coli BL21 и да се освободи фертинът, беше успешно приложен следният протокол. Рекомбинантният pET-28a/феритин плазмид се трансформира в щама E coli BL21 (DE3). Клетките на феритин E coli BL21 (DE3) са култивирани в LB растежни среди с 0,5% канамицин при 37°C и индуцирани при OD600 от 0,6 с 0,4% изопропил-β-D-тиогалактопиранозид в продължение на 3 часа при 37°C. След това крайната култура се събира чрез центрофугиране при 8000 g за 10 минути при 4°C и гранулите се събират. След това пеллетата се ресуспендира в LB среда (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% екстракт от дрожди)/буфер за лизис (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) и различни концентрации на разтвор на NaCl (0, 50, 100, 170 и 300 mmol/L), съответно. За бактериален клетъчен лизис ултразвукът се прилага в импулсен режим: например с помощта на Ултразвуков апарат UP400St при 100% амплитуда с работен цикъл от 5 секунди ВКЛЮЧЕНО, 10 секунди ИЗКЛЮЧЕНО за 40 цикъла) и след това центрофугиране при 10 000 g за 15 минути при 4°C. Супернатантът и утайката са анализирани чрез електрофореза с натриев додецил сулфат полиакриламид гел (SDS-PAGE). Всички гелове, оцветени с натриев додецил сулфат, са сканирани със скенер с висока разделителна способност. Изображенията на гела са анализирани с помощта на софтуера Magic Chemi 1D. За оптимална яснота протеиновите ленти бяха открити чрез коригиране на параметрите. Данните за лентите са генерирани от технически тройки. (срв. Sun et al., 2016)

Ултразвукови клетъчни разрушители за промишлен лизис на клетъчни фабрики

Ултразвуковият лизис и екстракция е надежден и удобен метод за освобождаване на метаболити от клетъчни фабрики, като по този начин подпомага ефективното производство на целеви молекули. Ултразвуковите клетъчни разрушители се предлагат от лабораторни до индустриални размери и процесите могат да бъдат мащабирани напълно линейно.
Hielscher Ultrasonics е вашият компетентен партньор за високоефективни ултразвукови разрушители и има дългогодишен опит в областта на имплантирането на ултразвукови системи в настолни и индустриални условия.
Когато става въпрос за усъвършенстван хардуер и софтуер, системите за разрушаване на клетките на Hielscher Ultrasonics отговарят на всички изисквания за оптимален контрол на процеса, лесна работа и удобство за потребителя. Клиентите и потребителите на ултразвуковите разрушители на Hielscher оценяват предимството, че ултразвуковите клетъчни разрушители и екстрактори на Hielscher позволяват прецизно наблюдение и контрол на процеса – чрез цифров сензорен дисплей и дистанционно управление на браузъра. Всички важни данни за ултразвука (напр. нетна енергия, обща енергия, амплитуда, продължителност, температура, налягане) се съхраняват автоматично като CSV файл на вградена SD карта. Това помага за получаване на възпроизводими и повтарящи се резултати и улеснява стандартизацията на процесите, както и изпълнението на добрите производствени практики (cGMP).
Разбира се, ултразвуковите процесори на Hielscher са създадени за работа 24/7 при пълно натоварване и следователно могат да работят надеждно в промишлени производствени условия. Поради високата здравина и ниската поддръжка, времето за престой на ултразвуковото оборудване е наистина ниско. Функциите CIP (почистване на място) и SIP (стерилизиране на място) минимизират трудоемкото почистване, особено след като всички мокри части са гладки метални повърхности (без скрити отвори или дюзи).

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови апарати: