Ултразвуково срязване на ДНК

При срязването на ДНК и РНК дългите молекули на ДНК се фрагментират на по-малки части – решаваща стъпка при подготовката на проби за създаване на библиотеки за секвениране от следващо поколение (NGS). Ултразвуковото срязване на ДНК използва силите на акустичната кавитация, за да разкъса ДНК или РНК на фрагменти с размери от 100 bp до 5 kb. Този метод позволява прецизен контрол върху размера на фрагментите, което улеснява адаптирането към желаната дължина на ДНК за оптимални резултати от секвенирането.

Срязване на ДНК чрез ултразвукова обработка

Hielscher Ultrasonics предлага различни решения, базирани на ултразвук, за срязване на ДНК, РНК и хроматин. Изберете ултразвуков апарат със сонда (напр. UP100H) за директна ултразвукова обработка с микровръх или използвайте VialTweeter или ултразвуковия CupHorn за едновременна индиректна подготовка на ДНК от различни проби. Hielscher предлага идеалния уред според вашите нужди: независимо дали имате 1 или до 10 проби, с обеми от микролитри до литри – ултразвуковите апарати на Hielscher ще отговорят на вашите изисквания за подготовка на фрагменти от ДНК, РНК и хроматин с подходящата дължина. Възпроизводимостта, лесната работа и прецизният контрол позволяват получаването на надеждна библиотека за секвениране от следващо поколение.
За разлика от ензимното фрагментиране на ДНК, ултразвуковото срязване прилага чисто механични сили на срязване без добавяне на химикали. Чрез прецизно задаване на параметрите на процеса ултразвуковото срязване получава ДНК фрагменти с висока молекулна маса (плазмидна и геномна ДНК).
Пречистените нуклеинови киселини могат да бъдат амплифицирани преди или след етапа на фрагментиране.
Параметрите на ултразвуковата обработка (мощност, импулсен цикъл / импулсни серии, време и температура) могат да се контролират безопасно чрез софтуерните настройки.

Протоколи за ултразвуково срязване на ДНК

За анализ чрез хроматинова имунопреципитация

Накратко, клетките бяха посяти в блюда с диаметър 60mm (400 000 на блюдо) и трансфектирани с RhoA siRNA (както е описано); след 72 h бяха инкубирани с формалдехид (крайна концентрация 1%) за 10 min при 37°C за образуване на напречни връзки между белтъците и ДНК. Реакцията на образуване на напречни връзки беше прекратена чрез добавяне на една десета от обема 1,25 mol/L глицин, при което се получи крайна концентрация 125 mmol/L. Клетките бяха промити два пъти с ледено студен PBS, ресуспендирани в буфер за радиоимунопреципитационен анализ [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолат, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], съдържащ 1 mmol/L фенилметилсулфонил флуорид, 1 Ag/mL апротинин и 1 Ag/mL пепстатин A, и оставени върху лед за 30 min. След това клетъчните лизати бяха обработени ултразвуково върху лед с Hielscher UP200S – ултразвуков апарат (3 x 40 s, амплитуда 40%, цикъл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), докато хроматинът с напречни връзки беше срязан до получаване на ДНК фрагменти между 200 и 1 000 bp. Една десета от целия лизат беше използвана за количествено определяне на ДНК в различните проби и беше разглеждана като „обща входна ДНК“. Супернатантите бяха инкубирани с 50% суспензия на ДНК от сперма на сьомга/белтък-агароза за намаляване на неспецифичния фон. След това имунопреципитацията беше извършена за една нощ при 4°C с 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) или без антитяло (отрицателна контрола). Към тези супернатанти беше добавен 5 mol/L NaCl и те бяха нагрявани за една нощ при 65°C за разкъсване на напречните връзки белтък–ДНК. Имунокомплексите бяха допълнително обработени с протеиназа K, свободна от DNase и RNase, а ДНК беше пречистена чрез екстракция с фенол/хлороформ и преципитация с етанол. PCR беше извършена със специфични праймери, съответстващи на последователност в промоторната област на човешкия ген iNOS (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Изследвания на експресията на EGFP

За изследванията на експресията рекомбинантният щам L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Германия) с гена за EGFP (усилен зелен флуоресцентен белтък), интегриран в хромозомния локус ssu, беше култивиран в различните среди, както е описано по-рано, с допълнително добавяне на 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Германия). По време на култивирането бяха вземани проби от 1 ml, центрофугирани (2000 × g, 20°C, 10 min) и промивани с 0,9% разтвор на NaCl. Утайката беше ресуспендирана в буфер (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) и разрушена чрез ултразвукова обработка с ултразвуковия процесор UP400S (прилагане на енергия ∼ 400 Ws). Клетъчните остатъци бяха отстранени чрез центрофугиране (6000 × g, 4°C, 5 min) и анализирани чрез електрофореза в полиакриламиден гел с натриев додецилсулфат (SDS-PAGE) при редуциращи условия по метода на Laemmli (1970) с 12,5% полиакриламидни гелове. Експресията на EGFP беше изследвана в култура с разбъркване. (Fritsche et al. 2007)

Хроматинова имунопреципитация

Анализът чрез хроматинова имунопреципитация беше извършен с ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, САЩ) съгласно инструкциите на производителя с някои модификации. Накратко, в диференцирани човешки подоцити бяха образувани напречни връзки с 1% формалдехид за 10 min при стайна температура. Клетките бяха промити с ледено студен PBS и реакцията на фиксация беше спряна чрез добавяне на 0,125 M глицин за 5 min при стайна температура. Клетките бяха промити отново с ледено студен PBS и отделени от блюдото чрез остъргване. Клетките бяха утаени чрез центрофугиране и ресуспендирани в буфера за лизис. След центрофугиране утаените ядра бяха ресуспендирани в буфера за срязване, инкубирани върху лед за 30 min и хроматинът беше срязан чрез ултразвукова обработка, напр. с UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Германия) при 25% мощност с 5 импулса от по 20 sec върху лед до фрагменти с размер приблизително 200–600 bp. След това срязаният хроматин беше центрофугиран и супернатантът беше събран. За имунопреципитациите 60 μl хроматин бяха инкубирани с 1 μg антитела срещу Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, САЩ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Обединеното кралство) или NF-κB p50 (Abcam), или със заешки IgG (Zymed Laboratories) като отрицателна контрола, за една нощ при 4°C с леко въртене. Имунокомплексите, свързани с магнитни микросфери, бяха събрани с магнитна стойка, старателно промити, напречните връзки белтък/ДНК бяха разкъсани и ДНК беше елуирана за PCR анализ в реално време. (Ristola et al. 2009)

Подготовка на ДНК от EHEC за анализ с чипови микроматрици

Подготовка на клетъчни лизати и екстрахирани ДНК
Бактериалните утайки, суспендирани в PBS до желаната крайна концентрация, бяха обработени с ултразвуков апарат за разрушаване на клетките UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оборудван с микровръх MS1 (с диаметър 1mm). Работната честота беше 30 kHz, а ефективната изходна мощност беше 100 W. По време на работата пробите бяха охлаждани в баня с лед и вода, смесвани и центрофугирани. Пробите бяха използвани за изследвания чрез проточна цитометрия, а за последваща обработка бяха подложени на топлинна обработка (95°C, 5 min). Суровите клетъчни лизати бяха обработени със смес от фенол:хлороформ:изоамилов алкохол (25:24:1). Равен обем от тази смес беше добавен към пробата от лизат, разтворът беше интензивно разбъркан на вортекс за 15 s и центрофугиран при 15 000 x g за 2 min при стайна температура (RT), около 22°C. Горната водна фаза, съдържаща геномната ДНК, беше внимателно отделена и събрана в нова стерилна епруветка Eppendorf.
След това пробите бяха обработени ултразвуково за фрагментиране на ДНК. Етапът на ултразвукова обработка беше извършен при същите условия, както е описано по-горе. За оценка на ефектите от фрагментирането върху геномната ДНК пробите бяха анализирани чрез електрофореза в агарозен гел.
(…) Пробите, предварително обработени ултразвуково за 2,5 min, бяха подложени на етап на екстракция след топлинна обработка и центрофугиране. Освободената ДНК беше екстрахирана два пъти със смес от фенол:хлороформ:изоамилов алкохол и след това подложена на втора ултразвукова обработка за 0 – 15 min. Електрофореза в агарозен гел беше използвана за определяне на разпределението по размер на ДНК, подложена на ултразвуково фрагментиране след екстракцията (фигурата горе вдясно). Силно фрагментираната ДНК се установяваше по наличието на размазана ДНК зона вместо ивици с висока молекулна маса, които липсваха в пробите, обработени ултразвуково за 2,5 min или повече. По-продължителната ултразвукова обработка постепенно намаляваше дължината на фрагментите до приблизително 150 – 600 bp, а обработката за 15 min допълнително разграждаше тези фрагменти, както се вижда най-вече от горната част на размазаната зона. Така средният размер на ДНК фрагментите постепенно намаляваше с времето на ултразвукова обработка, а обработката за 5 min позволяваше получаването на ДНК фрагменти с най-подходящите размери за анализи с чипови микроматрици. Накрая беше установена процедура за подготовка на ДНК аналита, включваща първоначална ултразвукова обработка за 2 min, екстракция на ДНК (2×) и последваща ултразвукова обработка за 5 min. (Basselet et al. 2008)

Хроматинова имунопреципитация (ChIP)

Клетките HEK293 бяха култивирани, както е описано по-горе, и фиксирани с 2 mM дисукцинимидилглутарат за 45 min при стайна температура. След това клетките бяха промити два пъти с PBS. В хроматина бяха образувани напречни връзки за 10 min при стайна температура с 1% (v/v) формалдехид и той беше промит два пъти с ледено студен PBS. Реакцията на образуване на напречни връзки беше спряна чрез инкубиране с глицин при крайна концентрация 0,125 M за 5 min при стайна температура. След инкубиране с трипсин клетките бяха отделени чрез остъргване от блюдото за клетъчна култура и промити два пъти с PBS. Клетъчната утайка беше ресуспендирана в буфер за лизис (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl и 0,5% (v/v) Nonidet P-40), инкубирана върху лед за 10 min и хомогенизирана с хомогенизатор Dounce. След това ядрата бяха утаени чрез центрофугиране (3500 x g, 5 min, 4 °C) и ресуспендирани в буфер за ядра (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Ядрата бяха разрушени чрез ултразвукова обработка с три импулса от по 20 s в ултразвуков апарат UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при настройка на цикъла 0,5 и амплитуда 30%, при което се получиха геномни ДНК фрагменти, предимно с размер 200 – 1000 bp. За ChIP 50g ДНК бяха разредени 4 пъти в буфер за имунопреципитация (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Анализ на хистоновите модификации чрез хроматинова имунопреципитация (ChIP)

Накратко, 6 x 10⁶ клетки бяха промити два пъти с PBS и в тях бяха образувани напречни връзки върху плаката за култивиране за 15 min при стайна температура в присъствието на 0,5% формалдехид. Реакцията на образуване на напречни връзки беше спряна чрез добавяне на 0,125 M глицин. Всички последващи етапи бяха извършени при 48°C. Всички буфери бяха предварително охладени и съдържаха протеазни инхибитори (Complete Mini, Roche). Клетките бяха промити два пъти с PBS и след това отделени чрез остъргване. Събраните утайки бяха разтворени в 1 ml буфер за лизис (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) и обработени ултразвуково в студена етанолова баня в продължение на 10 цикъла при 100% амплитуда с ултразвуков апарат UP50H (Hielscher, Teltow, Германия). Фрагментирането на хроматина беше визуализирано в 1% агарозен гел. Получените фрагменти бяха в диапазона 200–500pb. Разтворим хроматин беше получен чрез центрофугиране на ултразвуково обработените проби при 14 000g за 10 min при 48°C. Разтворимата фракция беше разредена 1/10 в буфер за разреждане (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), след което беше разделена на аликвотни части и съхранявана при 80°C до употреба. (Rodriguez et al. 2008)