Ултразвуково срязване на ДНК

По време на срязването на ДНК и РНК, дългите ДНК молекули се фрагментират на по-малки парчета, решаваща стъпка в подготовката на проби за изграждане на библиотека за секвениране от следващо поколение (NGS). Ултразвуковото срязване на ДНК използва акустични кавитационни сили, за да разбие ДНК или РНК на фрагменти, вариращи от 100 bp до 5 kb. Този метод позволява прецизен контрол върху размера на фрагмента, улеснявайки персонализирането на желаната дължина на ДНК за оптимални резултати от секвенирането.

Срязване на ДНК с помощта на ултразвук

Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за срязване на ДНК, РНК и хроматина. Изберете между ултразвукови апарати тип сонда (напр. UP100H) за директно ултразвукоизвличане с помощта на микронакрайник или използвайте VialTweeeter или ултразвуковия куперн за индиректно ДНК препариране на различни проби едновременно. Hielscher предлага идеалното устройство, съобразено с вашите нужди: независимо дали имате 1 или до 10 проби, обеми от микролитрови до литрови обеми – Ултразвуковите апарати Hielscher ще отговорят на вашите изисквания за подготовка на фрагменти от ДНК, РНК и хроматин с правилната дължина. Възпроизводимостта, лесната работа и прецизното управление позволяват надеждна библиотека за секвениране от следващо поколение.
За разлика от ензимната фрагментация на ДНК, ултразвуковото срязване прилага чисти механични сили на срязване без добавяне на химикали. Чрез прецизната настройка на параметрите на процеса, ултразвуковото срязване произвежда ДНК фрагменти с високо молекулно тегло (плазмидна и геномна ДНК).
Пречистените нуклеинови киселини могат да бъдат амплифицирани преди или след етап на фрагментация.
Параметрите на уникирането (мощност, импулсен цикъл / изблици, време и температура) могат да се контролират безопасно чрез настройките на софтуера.

Протоколи за ултразвуково срязване на ДНК

За хроматин имунопреципитационен анализ

Накратко, клетките са поставени в съдове с диаметър 60 mm (400 000 на чиния) и трансфектирани с RhoA siRNA (както е описано); след 72 часа те са инкубирани с формалдехид (крайна концентрация, 1%) в продължение на 10 минути при 37°C, за да се свържат протеини с ДНК. Реакцията на омрежване се гаси чрез добавяне на една десета от обема 1,25 mol/L глицин, което дава 125 mmol/L крайна концентрация. Клетките се промяват два пъти с ледено студен PBS, ресуспендирани в буфер за радиоимунопреципитация [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолат, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], съдържащ 1 mmol/L фенилметилсулфонил флуорид, 1 Ag/mL апротинин и 1 Ag/mL пепстатин А, и се държат на лед в продължение на 30 минути. След това клетъчните лизати се озвучават върху лед с Hielscher UP200S ултразвуков ултразвук (3 x 40 s, амплитуда 40%, цикъл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), докато омрежените хроматини не бъдат срязани, за да се получат ДНК фрагменти между 200 и 1,000 bp. Една десета от целия лизат е използвана за количествено определяне на количеството ДНК, присъстващо в различни проби и се счита за “обща входна ДНК”. Супернатантите са инкубирани с ДНК/протеин агароза на сперматозоиди от сьомга, за да се намали неспецифичният фон. След това имунопреципитацията се извършва през нощта при 4°C с 5 Ag анти-NF-nB p65 (Upstate) или без антитяло (отрицателна контрола). Тези супернатанти са допълнени с 5 mol/L NaCl и се нагряват през нощта при 65°C, за да се върнат кръстосаните връзки протеин-ДНК. Имунокомплексите са допълнително третирани с протеиназа К без ДНК и РНКаза, а ДНК е пречистена чрез екстракция на фенол/хлороформ и преципитация на етанол. PCR се прави със специфични праймери, съответстващи на последователност в промоторния регион на човешкия ген iNOS (p1 праймер: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 праймер: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Изследвания на експресията на EGFP

За изследвания на експресията, рекомбинантният щам L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Германия) с гена за EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), интегриран хромозомен ssu, е култивиран в различни среди, както е описано по-горе и допълнително допълнен със 100 mg l^-1 Нурсеотрицин (Jena Bioscience, Германия). По време на култивирането се вземат проби от 1 ml, центрофугирани (2000 × g, 20°C, 10 min) и се измиват с 0,9% разтвор на NaCl. Пелетите са ресуспендирани в буфер (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) и се разпадат чрез сонификация с ултразвуковия процесор UP400S (прилагане на енергия ∼ 400 Ws). Клетъчните остатъци са отстранени чрез центрофугиране (6000 × g, 4°C, 5 min) и анализирани чрез електрофореза на натриев додецил сулфат – полиакриламиден гел (SDS-PAGE) при редуциращи условия по метода на Laemmli (1970) с 12,5% полиакраламидни гелове. Експресията на EGFP е изследвана във възбудена култура. (Fritsche et al. 2007)

Хроматин имунопреципитация

Анализът за хроматин имунопреципитация е извършен с помощта на ChIP-IT^ТМ Express (Active Motif, Карлсбад, Калифорния, САЩ) според инструкциите на производителя с някои модификации. Накратко, диференцираните човешки подоцити са омрежени с 1% формалдехид в продължение на 10 минути при стайна температура. Клетките се измиват с ледено студен PBS и реакцията на фиксиране се спира чрез добавяне на 0,125 M глицин за 5 минути при стайна температура. Клетките отново се измиват с ледено студен PBS и се изстъргват от чинията. Клетките са гранулирани чрез центрофугиране и ресуспендирани в лизисния буфер. След центрофугиране гранулираните ядра се ресуспендират в буфера за срязване, инкубират се върху лед в продължение на 30 минути и хроматинът се срязва чрез ултразвук, напр. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Телтов, Германия) при 25% мощност 5 импулса по 20 секунди всеки върху лед на фрагменти от приблизително 200–600 bp. След това срязаният хроматин се центрофугира и се събира супернатантът. За имунопреципитация 60 μl хроматин се инкубира с 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) или NF-κB p50 (Abcam) антитела или със заешки IgG (Zymed Laboratories), като отрицателна контрола, през нощта при 4°C с леко въртене. Имунокомплексите, свързани с магнитни топчета, са събрани с помощта на магнитна стойка, промити обилно и кръстосаните връзки протеин/ДНК са обърнати и ДНК елюирана за PCR анализ в реално време. (Ristola et al. 2009)

Подготовка на EHEC ДНК за анализ на чип масиви

Подреждане на клетъчни лизати и извлечени ДНК
Бактериалните пелети, суспендирани в PBS до желаната крайна концентрация, са третирани с ултразвуков разрушител UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оборудван с микронакрайник MS1 (1 mm в диаметър). Работната честота е 30 kHz, а ефективната изходна мощност е 100 W. По време на операцията пробите се охлаждат в баня с ледена вода, смесват се и се центрофугират. Пробите са използвани за изследвания с проточна цитометрия, докато за по-късна обработка пробите са подложени на термична обработка (95°C, 5 минути). Суровите клетъчни лизати са обработени със смес от фенол:хлороформ:изоамилов алкохол (25:24:1). Равен обем от тази смес се добавя към лизатната проба, разтворът се завихрява енергично в продължение на 15 s и се центрофугира при 15 000 x g в продължение на 2 минути при стайна температура (RT) около 22°C. Горната водна фаза, съдържаща геномната ДНК, е внимателно отделена и събрана в нова стерилна епруветка на Епендорф.
Впоследствие пробите са били ултразвукови, за да се фрагментира ДНК. Стъпката на ултразвук е реализирана при същите условия, както е описано по-горе. За да се оценят ефектите на фрагментация върху геномната ДНК, пробите са анализирани с помощта на електрофореза с агарозен гел.
(…) Пробите, озвучавани преди това в продължение на 2,5 минути, бяха подложени на етап на екстракция след термична обработка и центрофугиране. Освободената ДНК се извлича два пъти със смес фенол:хлороформ:изоамилов алкохол и след това се подлага на втора ултразвук за 0 – 15 минути. Електрофореза с агарозен гел е използвана за определяне на разпределението по размер на ДНК, подложена на ултразвукова фрагментация след екстракция (фиг. в горната дясна част). Силно фрагментираната ДНК е очевидна от наличието на ДНК цитонамазка, а не ленти с високо молекулно тегло, които са елиминирани от проби, ултразвук за 2,5 минути или повече. По-дългата ултразвук постепенно намалява дължините на фрагментите до приблизително 150 – 600 bp, а ултразвукът в продължение на 15 минути допълнително влошава тези фрагменти, както може да се види най-вече от горната част на цитонамазката. По този начин средният размер на ДНК фрагмента постепенно намалява с времето за ултразвукова диагностика и 5-минутната обработка позволява да се получат размерите на ДНК фрагментите, най-подходящи за чип масиви. Най-накрая беше установена процедурата за подготовка на ДНК аналит, включваща първите 2 минути ултразвукова обработка, екстракция на ДНК (2×) и последващи 5 минути ултразвук. (Basselet et al. 2008)

Хроматин имунопреципитация (ChIP)

HEK293 клетките са култивирани, както е описано по-горе, и фиксирани с 2 mM диссукцинимидил-глутарат за 45 минути при стайна температура. Впоследствие клетките са промити два пъти с PBS. Хроматинът се омрежва в продължение на 10 минути при стайна температура, като се използва 1% (v/v) формалдехид и се измива два пъти с ледено студен PBS. Реакцията на омрежване е спряна чрез инкубация с глицин в крайна концентрация 0,125 M в продължение на 5 минути при стайна температура. След инкубация с трипсин, клетките се изстъргват от съда за клетъчна култура и се измиват два пъти с PBS. Клетъчната пелета е ресуспендирана в лизис буфер (5 mM тръби, pH 8.0, 85 mM KCl и 0.5% (v/v) Nonidet P-40), инкубирана върху лед в продължение на 10 минути и хомогенизирана с хомогенизатор на Dounce. Впоследствие ядрата са гранулирани чрез центрофугиране (3500 x g, 5 min, 4 °C) и ресуспендирани в буфер на ядрата (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA и 1% (w/v) SDS). Ядрата са нарушени от ултразвук с три 20-секундни импулса в Ултразвуков уред UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при настройка на цикъл 0,5 и амплитуда 30%, като се получават геномни ДНК фрагменти с насипен размер 200 – 1000 bp. За ChIP 50 g ДНК се разреждат 4 пъти в имунопреципитационен буфер (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 и 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Анализ на модификация на хистони чрез хроматинова имунопреципитация (ChIP)

Накратко, 6 x 10⁶ клетките се измиват два пъти с PBS и се омрежват върху култивната плоча в продължение на 15 минути при стайна температура в присъствието на 0,5% формалдехид. Реакцията на омрежване е спряна чрез добавяне на 0,125 M глицин. Всички следващи стъпки бяха извършени при 48°C. Всички буфери са предварително охладени и съдържат протеазни инхибитори (Complete Mini, Roche). Клетките се измиват два пъти с PBS и след това се изстъргват. Събраните пелети се разтварят в буфер от 1 ml лизис (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) и се овлажняват в студена етанолова вана в продължение на 10 цикъла при 100% амплитуда с помощта на Ултразвуков уред UP50H (Хилшер, Телтов, Германия). Фрагментацията на хроматина се визуализира в 1% агарозен гел. Получените фрагменти са в диапазона 200–500pb. Разтворим хроматин е получен чрез центрофугиране на ултразвуковите проби при 14 000 g за 10 минути при 48°C. Разтворимата фракция се разрежда 1/10 в буфер за разреждане (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), след което се аликвотира и съхранява при 80°C до употреба. (Rodriguez et al. 2008)