Ултразвуково ДНК срязване

• По време на ДНК и РНК срязване, ДНК молекули се разграждат по-малки парчета. ДНК / РНК фрагментиране е един от най-важните стъпки проба препаративни изисква създаване на библиотеки за следващото поколение секвениране (NGS).
• Ултразвуково ДНК срязване използва силите на акустични кавитация за прекъсване на ДНК или РНК на парчета от 100 – 5kb вр.
• Ултразвуково срязване позволява прецизен ДНК фрагментация и адаптация на желаната дължина на ДНК.

Ултразвуково ДНК срязване

Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови базирани решения за ДНК, РНК и хроматин срязване. Изберете между сонда тип ultrasonicators (напр UP100H) за обработка с ултразвук с помощта на микротип или използвайте VialTweeeter или ултразвукова cuphorn за непряко препарат ДНК от различни проби едновременно. Hielscher предлага идеалното устройство има предвид вашите нужди: овен имате 1 или до 10 проби, обеми от микролитърен до обеми литрови – Hielscher ултразвукови процесори са на разположение, за да отговори на Вашите изисквания, за да се подготвят ДНК, РНК и хроматина фрагменти в правилната дължина. Възпроизводимост, лесна работа и прецизен контрол позволява надеждна библиотека за следващо поколение секвениране.
За разлика от ензимна ДНК фрагментация ултразвукови срязване прилага чисто механични сили на срязване, без прибавяне на химикали. Чрез точното определяне на параметрите на процеса, ултразвукова срязване произвежда високомолекулни ДНК фрагменти молекулни (плазмид и геномна ДНК).
Пречистените нуклеинови киселини могат да бъдат амплифицирани преди или след етап на раздробяване.
Соникацията параметри (мощност, пулс цикъл / залпове, време и температура) могат да бъдат контролирани безопасно чрез софтуерни настройки.

Протоколи за ултразвукова ДНК срязване

За Хроматиново имунопресичане Изследване

Накратко, клетките се посяват в блюда с диаметър 60 мм (400 000 на блюдо) и се трансфектират с RhoA siRNA (както е описано); след 72 часа, те се инкубират с формалдехид (крайна концентрация, 1%) в продължение на 10 минути при 37 ° С, за да се омрежат протеините към ДНК. Реакцията на омрежване се угасява чрез добавяне на една десета обем от 1.25 mol / L глицин, като се получава 125 mmol / L крайна концентрация. Клетките се промиват двукратно с ледено студен PBS, ресуспендират се в буфер за радиоимунопреципитация [150 mmol / 1 NaCl, 1% NP40, 0.5% деоксихолат, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl )], съдържащ 1 mmol / L фенилметилсулфонил флуорид, 1 Ag / mL апротинин и 1 Ag / mL пепстатин А и се държат на лед за 30 min. След това клетъчните лизати се обработват с ултразвук върху лед с a Hielscher UP200S ултразвук соникатор (3 х 40 S, амплитуда 40%, цикъл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) до омрежени chromatins бяха срязани до получаване на ДНК фрагменти между 200 и 1000 вр. Една десета от цялата лизат се използва за количествено определяне количеството на ДНК присъства в различни проби и счита “общо въвеждане на ДНК”, Супернатантите се инкубират с ДНК от сперма на сьомга / протеин агароза-50% суспензия да се намали неспецифичното фон. след имунопреципитация беше направено за една нощ при 4 ° С с 5 Ag на анти-NF-NB р65 (Upstate) или без антитяло (отрицателна контрола). Тези супернатанти бяха допълнени с 5 мола / L NaCl и се загрява една нощ при 65 ° С, за да се върне протеин-ДНК напречни връзки. На имунокомплексите са допълнително обработени с DNase- и свободна от РНКаза протеиназа К, и ДНК се пречиства от фенол екстракция / хлороформ и утаяване с етанол. PCR се извършва със специфични праймери, съответстващи на последователност в промоторната област на човешки ИНОС ген (p1 праймер: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 праймер: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier и сътр., 2008)

проучвания EGFP-експресионни

За експресия проучвания, рекомбинантния щам L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Германия) с гена за EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), хромозомна SSU интегрирани, се култивира в различни медии, както е описано по-рано и допълнително, допълнена с 100 мг л^-1 Nourseothricin (Йена Bioscience, Германия). По време на култивиране, са взети 1 мл проби, центрофугират се (2000 х д, 20 ° С, 10 минути) и се промиват с 0,9% разтвор на NaCl. Пелетите се суспендират отново в буфер (20 тМ HEPES, 5 тМ EDTA, 2 тМ DTT) и се разпада чрез обработка с ултразвук с ултразвуков процесор UP400S (Прилагане на енергия ~ 400 WS). Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране (6000 х д, 4 ° С, 5 минути) и се анализира чрез натриев додецил сулфат - полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE) при редуциращи условия съгласно метода на Laemmli (1970) с 12.5% ​​polyacralamide гелове , EGFP-експресия се изследва в разбърква култура. (Fritsche и др. 2007 г.)

Хроматиново имунопреципитация

Анализът на хроматин имунопреципитация се извършва с помощта на чип-IT^Tm Изразете (Active Motif, Карлсбад, Калифорния, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя с някои изменения. Накратко, диференцирани човешки podocytes са омрежени с 1% формалдехид в продължение на 10 минути при стайна температура. Клетките се промиват с ледено студен PBS и реакцията на свързване се прекратява чрез добавяне на 0.125 М глицин за 5 минути при стайна температура. Клетките се промиват отново с ледено студен PBS и остъргват от съда. Клетките се утаяват чрез центрофугиране и се ресуспендират в буфера лизис. След центрофугиране, утаяват ядра се ресуспендират в буфера срязване, инкубират върху лед за 30 минути и хроматина се остригана чрез ултразвук, например UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) при 25% мощност 5 импулса от по 20 секунди върху лед на фрагменти от приблизително 200-600 bp. След това нарязаният хроматин се центрофугира и супернатантата се събира. За имунопреципитации 60 ц1 хроматин се инкубират с 1 ug от Spl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, СА, САЩ), NF-кВ р65 (Abcam, Cambridge, UK) или NF-кВ р50 (Abcam) антитела или със заек IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, СА, САЩ), като отрицателна контрола, през нощта при 4 ° С с леко въртене. Имунокомплексите, свързани с магнитни перли, се събират, като се използва магнитна стойка, промиват се екстензивно и протеиновите / ДНК напречните връзки се обръщат и ДНК се елуира за PCR анализ в реално време. (Ristola et al., 2009)

ЕНЕС препарат ДНК за анализ чип масив

Разположение на клетъчни лизати и се екстрахира ДНКи
Бактериалните пелети се суспендират в PBS до желаната крайна концентрация бяха третирани с ултразвук разкъсващо UP100H (Hielscher GmbH, Германия), оборудван с микрочип MS1 (1 mm в диаметър). Работната честота е 30 kHz и ефективната изходна мощност е 100 W. По време на операцията пробите се охлаждат в ледена водна баня, смесват се и се центрофугират. Пробите се използват за проучвания с поточна цитометрия, а за по-нататъшна обработка пробите се подлагат на термична обработка (95 ° С, 5 минути). Суровите клетъчни лизати се обработват със смес от фенол: хлороформ: изоамилов алкохол (25: 24: 1). Към пробата от лизат се прибавя равен обем от тази смес, разтворът се завихря енергично в продължение на 15 секунди и се центрофугира при 15,000 хд в продължение на 2 минути при стайна температура (RT) около 22 ° С. Горната водна фаза, съдържаща геномната ДНК, внимателно се отделя и се събира в нова стерилна Eppendorf епруветка.
Впоследствие пробите се обработват с ултразвук, за да фрагментират ДНК. Етапът на ултразвук се осъществява при същите условия, както е описано по-горе. За да се оценят ефектите на фрагментиране върху геномната ДНК, пробите се анализират чрез използване на електрофореза с агарозен гел.
(…) Пробите, получени преди това в продължение на 2.5 минути, бяха подложени на етап на екстракция след топлинна обработка и центрофугиране. Освободената ДНК се екстрахира двукратно с смес от фенол: хлороформ: изоамилов алкохол и след това се подлага на втора обработка с ултразвук в продължение на 0-15 мин. Електрофорезата с агарозен гел се използва за определяне на разпределението на размера на ДНК, подложена на ултрасоларна фрагментация след екстракция (Фигура в горната дясна страна). Високо фрагментираната ДНК е очевидна от наличието на ДНК оцветяване, а не от ленти с висока молекулна маса, които се елиминират от образци, подложени на ултразвук за 2.5 минути или по-дълго. По-дългата обработка с ултразвук постепенно намалява дължината на фрагментите до приблизително 150-600 базисни точки, а ултразвуковата обработка за 15 минути по-нататък разгражда тези фрагменти, както се вижда най-вече от горната част на намазката. По този начин средният размер на ДНК фрагмента постепенно намалява с ултразвуково време и 5 min третирането позволява да се получат размерите на ДНК фрагментите, които са най-подходящи за анализи с чип масив. Най-накрая беше установена процедурата за получаване на ДНК аналит, включваща първите 2 минути ултразвукова обработка, ДНК екстракция (2х) и последващо 5 минути ултразвук. (Basselet et al., 2008)

Хроматин имунопреципитация (чип)

НЕК293 клетките се култивират, както е описано по-горе, и се фиксират с 2 мМ дисукцинимидил-глутарат в продължение на 45 минути при стайна температура. След това клетките се промиват два пъти с PBS. Хроматинът беше омрежен за 10 минути при стайна температура с използване на 1% (v / v) формалдехид и промит два пъти с ледено студен PBS. Реакцията на кръстосано свързване се спира чрез инкубиране с глицин при крайна концентрация от 0.125 М в продължение на 5 минути при стайна температура. След инкубация с трипсин, клетките се остъргват от ямката за клетъчна култура и се промиват два пъти с PBS. Клетъчната пелета се ресуспендира в лизисен буфер (5 тМ тръби, рН 8.0, 85 тМ КС1 и 0.5% (об. / Об.) Nonidet Р-40), инкубира се върху лед за 10 min и се хомогенизира с хомогенизатор Dounce. След това ядрата се пелетизират чрез центрофугиране (3500 х g, 5 min, 4 ° С) и се ресуспендират в ядрен буфер (50 mM Tris-HCI, рН 8.1, 10 mM EDTA и 1% (w / v) SDS). Ядките бяха прекъснати чрез ултразвук с три 20 импулса в a UP50H звукоонработка (Hielscher Ultraschall Technologie) при настройка на цикъла 0.5 и амплитуда 30%, при което се получават геномни ДНК фрагменти с размер на насипни 200-1000 базисни пункта. За чип 50гр на ДНК се разрежда 4-кратно в имунопреципитация буфер (16.7 тМ Tris-HCl, рН 8.1, 167 тМ NaCl, 1.2 тМ EDTA, 1.1% (об / об) Triton Х-100 и 0.01% (w / об) SDS). (Weiske и др. 2006 г.)

Хистон модификация анализ от хроматин имунопреципитация (чип)

Накратко, 6 х 10⁶ клетките се промиват два пъти с PBS и омрежен на плочата за култура в продължение на 15 минути при стайна температура в присъствието на 0.5% формалдехид. реакция на кръстосано свързване се прекратява чрез добавяне на 0.125 М глицин. Всички следващи етапи се провеждат при 48 ° С. Всички буфери бяха предварително охладени и съдържащи протеазни инхибитори (Complete Мини, Roche). Клетките се промиват два пъти с PBS и след това се остъргват. Събраните пелети се разтварят в 1 мл лизисен буфер (1% SDS, 5 тМ EDTA, 50 тМ Tris рН 8) и се обработва с ултразвук в студен етанол баня в продължение на 10 цикъла при 100% амплитуда, използвайки UP50H звукоонработка (Hielscher, Teltow, Германия). Хроматин фрагментация се визуализира в 1% агарозен гел. Получените фрагменти бяха в 200-500pb диапазон. Разтворим хроматин се получава чрез центрофугиране на ултразвукова вана пробите при 14 000 грама за 10 минути при 48 ° С. Разтворимата фракция се разрежда 1/10 в буфер за разреждане (1% Triton Х-100, 2 тМ EDTA, 20 тМ Tris рН 8, 150 тМ NaCl), след това разделя на аликвотни части и се съхранява при 80 ° С до използването им. (Rodriguez и др. 2008 г.)