Hielscher Ultrasonics
Ще се радваме да обсъдим вашия процес.
Обадете ни се: +49 3328 437-420
Изпратете ни поща: info@hielscher.com

Плазмидна подготовка с помощта на ултразвук

Ултразвукът е надеждна техника за фрагментиране на плазмидна ДНК. Прецизно контролираната амплитуда, режимът на пулсация и контролът на температурата са най-важните характеристики на ултразвуковия апарат за неувреждаща плазмидна фрагментация. Освен това използването на определени агенти помага за предпазване от разграждане на плазмидите. Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за контролирана плазмидна фрагментация от единични флакони, едновременно ултразвук на множество проби, както и на многолункови плаки. Научете повече за успешната ултразвукова плазмидна фрагментация!

Искане за информация




Обърнете внимание на нашите Политика за поверителност.




Ултразвуковата фрагментация на ДНК е надеждна и ефективна техника, която обикновено се използва в секвенирането от следващо поколение (NGS)

В UIP400MTP позволява прецизно контролирана ултразвукова диагностика на многоямкови плочи. Едно от приложенията на UIP400MTP е фрагментацията на плазмидната ДНК с цел получаване на фрагменти със специално целева дължина.

Плазмидно срязване с помощта на ултразвук

Когато ДНК пробите са подложени на ултразвукови вълни, ултразвуково генерираните вибрации създават акустична кавитация в течността, която срязва или разрушава ДНК молекули с високо молекулно тегло чрез механични сили. Соникацията е най-широко използваният метод за експерименти с насипно срязване на ДНК, включително приложения, като хроматинова имунопреципитация (ChIP), за която малките размери на фрагментите са от решаващо значение за получаване на висока разделителна способност. (срв. Tseng et al., 2012)
Плазмидната ДНК (пДНК) е специфична форма на ДНК, характеризираща се с пръстеновидната си форма и се среща при бактерии и някои еукариоти.
Супернавитата пДНК е желаната форма на плазмидна ДНК, тъй като показва най-добри резултати в процеси надолу по веригата като автоматизирано секвениране и трансфекция. Ултразвукът е подходящ за успешно фрагментиране на пДНК, включително супернавита пДНК.
Thompson et al. (2008) демонстрират, че плазмидната ултразвук, за която е известно, че фрагментира супернавита ДНК, е ефективен начин за подобряване на дължината на четене на последователността phred20 до степен, че те не се различават значително от контролния шаблон на Beckman Coulter или ензимно линеаризираните плазмиди.

Предимства на ултразвуковата фрагментация на ДНК

  • прецизно контролиран
  • Възпроизводими резултати
  • Регулируеми според целевите дължини на ДНК фрагментите
  • контрол на температурата
  • Мащабируем до всеки размер на пробата
Видеото показва ултразвуковата система за подготовка на проби UIP400MTP, която позволява надеждна подготовка на проби от всякакви стандартни пластини с много ямки с помощта на ултразвук с висока интензивност. Типичните приложения на UIP400MTP включват клетъчен лизис, срязване на ДНК, РНК и хроматин, както и екстракция на протеини.

Ултразвуков UIP400MTP за ултразвукова обработка на многоямкови плочи

Миниатюра на видео

Използване на плазмидни вектори

Плазмидите често се използват като инструменти за клониране, прехвърляне и манипулиране на гени. Когато плазмидите се използват експериментално за тези цели, те се наричат вектори. ДНК фрагменти или гени могат да бъдат вмъкнати в плазмиден вектор, създавайки така наречения рекомбинантен плазмид. Плазмидните вектори се използват като превозни средства за задвижване на рекомбинантна ДНК в клетката гостоприемник и са ключов компонент на молекулярното клониране.
“Невирусните вектори се изследват широко за потенциалното им използване в генната терапия за лечение на различни сложни заболявания. Невирусните вектори предпазват плазмидната ДНК от физическо, химично и ензимно разграждане и доставят молекулата на ДНК до целевото място. Например, катионни липозоми, хитозан и други положително заредени наночастици образуват комплекси с плазмидна ДНК чрез електростатични взаимодействия. Въпреки това, лесно образуваните катионни липозоми/плазмидни ДНК комплекси са относително големи (т.е. 300–400 nm) и хетерогенни по природа, което ги прави трудни за използване във фармацевтични приложения. Големите и хетерогенни плазмидни ДНК/липозоми, плазмидните ДНК/аерозоли и плазмидните ДНК/пептидни комплекси могат да бъдат намалени до по-малки и хомогенни частици с помощта на ултразвук.” (Sarker et al., 2019)
Ярък пример за използването на плазмидни вектори е CRISPR-Cas9. Системата CRISPR-Cas9 обикновено се доставя в клетките като един голям плазмид или множество по-малки плазмиди, които кодират целева последователност, CRISPR водач и Cas9.

Ултразвукова подготовка на заредени с ДНК PLGA наночастици чрез наноутаждение

Jo et al. (2020) използват поли(млечно-когликолова киселина) (PLGA), за да образуват носител на наночастици за доставяне на модел на плазмид CRISPR-Cas9 в първични макрофаги, получени от костен мозък. За наноутаицирането на PLGA наночастици са използвани PLGA с две различни крайни групи (естерни и аминови групи) с цел положително заредените аминови крайни капачки да увеличат ефективността на капсулиране и натоварването поради зарядовите взаимодействия между него и отрицателно заредения гръбнак на ДНК. В 50 ml полипропиленова конична центрофужна тръба 100 mg Pluronic F127 се разтваря в 20 ml автоклавна DI вода чрез вихрово смесване, последвано от 30 минути нежна ултразвукова вана (виж CupHorn). Добавя се автоклавна магнитна бъркалка и разтворът се разбърква при 600 оборота в минута за 30 минути, докато се правят другите разтвори. Пластмасови лабораторни съдове са използвани вместо стъклени съдове, за да се сведе до минимум неспецифичната адсорбция на ДНК. Разтвори на PLGA, разтворени в DMF (44,48 mg/ml) и TIPS пентацен, разтворен в THF (0,667 mg/ml), са направени отделно. PLGA беше оставен в покой да се намокри в DMF за 30 минути, преди да бъде ултразвук за 30 минути.

Свързани приложения:

  • Извличане на ДНК
  • Капсулиране на ДНК
  • Дисперсия на ДНК, покрита с наночастици
  • Доставка на плазмидна ДНК в клетките
UP200St TD_CupHorn за индиректна ултразвук на семпли

UP200St CupHorn за индиректна ултразвук на проби, например за извличане и фрагментиране на ДНК.

Искане за информация




Обърнете внимание на нашите Политика за поверителност.




Защита на плазмидната ДНК по време на съниране

ДНК, включително плазмиди и супернавити плазмиди, е силно чувствителна деградация. Всички налични методи за фрагментация са известни с определени недостатъци. Ултразвуковата фрагментация на ДНК е един от предпочитаните методи, тъй като контролираната ултразвук в комбинация със защитни мерки позволява да се намали увреждането на ДНК веригите, предизвикано от срязване и топлина.
Освен настройки на ниска амплитуда, режим на пулсация и контрол на температурата по време на ултразвуково срязване на ДНК, използването на определени агенти показва значителен защитен ефект срещу разграждането на ДНК. Например, различни полимери, пептиди и липиди защитават плазмидната ДНК по време на ултразвук.

Йонните течности могат да предпазят плазмидната ДНК от повреди по време на ултразвук.

Стабилността на плазмидната ДНК и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси срещу ултразвуково напрежение на срязване е изследвана с помощта на електрофореза на агарозен гел. Както плазмидната ДНК, така и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за различни времеви точки. Плазмидната ДНК е изложена на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30 и 40 минути. Въпреки това, плазмидните ДНК/IL нанокомплекси са били изложени на ултразвуков стрес на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минути.
(проучване и снимка: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) демонстрира, че когато наноструктурите на плазмидната ДНК / йонна течност (pDNA/IL) са подложени на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минути и са комплексирани с наличния в търговската мрежа агент за доставка на катионни гени липофектамин, процентът на флуоресцентните положителни клетки е 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, съответно 65% и 50% (виж графиката по-долу). Процентът на флуоресцентните положителни клетки се увеличава, когато наноструктурите са подложени на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 10 и 20 минути и след това бавно намалява.

Ултразвукова фрагментация на плазмидна ДНК

Влияние на йонна течност [Bmim][PF6] върху доставката на плазмидна ДНК до COS7 клетките. Плазмидните ДНК/IL (йонна течност) нанокомплекси са подложени на ултразвуков стрес на срязване до 120 минути и се комплексират с LA, преди да бъдат доставени в COS7 клетки. Данните показват средния брой (%) на GFP положителните HeLa клетки, преброени в 10 различни микроскопични полета и експериментът е проведен няколко пъти в три различни дни. (Проучване и графика: ©Sarker et al., 2019)

Плазмидната ДНК може да бъде защитена с добавяне на агент преди ултразвукова фрагментация.

Плазмидната ДНК може да бъде защитена с добавяне на агент преди ултразвукова фрагментация: индуцирана от сонация разграждане на гола пДНК (А) и на пДНК, формулирана с 1,5 mM CaCl2 и 20 % (v/v) t-бутанол (B)
Пробите бяха ултразвук с 20W сонда до 120 секунди, както е посочено в горната част на всяка лента. Лента H съответства на маркера Hyperladder I ™️. Показани са плазмидните ленти OC и SC.
(проучване и снимки: ©Wu et al., 2009)

Ултразвуков лизат

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис
Ултразвуков апарат UP200Ht с микронакрайник S26d2 за ултразвуков лизис на биологични пробиЗапочнете с обогатена проба от клетки, която е приготвена чрез метод на клетъчно разделяне (напр. имуномагнитно разделяне на клетки, флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране (FACS), центрофугиране с градиент на плътността, изолиране на клетки с имунна плътност).
Клетъчните проби трябва да показват обем на лизисен буфер, който е подходящ за експерименталната цел и ултразвуков сигнал тип сонда.
Хипотоничните буфери са предпочитани, тъй като подобряват ултразвуковия клетъчен лизис. Важно е добавките и концентрацията на сол да се използват по подходящ начин.
Изберете вашето устройство за ултразвуков лизис: За индиректно ултразвуково ултразвуково излъчване на флакони се препоръчват VialTweeter или CupHorn. За многоямкови плочи UIP400MTP е идеалният ултразвуков уред. А класическата сонда, ултразвуков хомогенизатор като UP100H или UP200Ht с микронакрайник са най-подходящи.
Протокол за ултразвук тип сонда: Поставете ултразвуковата сонда в обема на пробата в епруветка за микроцентрофуга и ултразвук за около 10 секунди. В зависимост от пробата от ДНК, ултразвукът може да се повтори още един или два пъти. Необходимата входяща ултразвукова енергия (Ws/ml) зависи от вискозитета на пробата и вида на ДНК. Охлаждането чрез ледена баня и режим на пулсация на ултразвука помага да се предотврати термичното разграждане на пробата.
След ултразвуков лизис пробата се центрофугира, за да се отделят остатъците от пелети (съдържащи нелизирани клетки, ядра и нелизирани органели)
Ако пробата не бъде незабавно обработена допълнително, тя може да се съхранява при подходяща температура, за да се запази нейната жизнеспособност.

Ултразвукови апарати за фрагментация на ДНК

Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови платформи за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), индиректни решения за ултразвук за едновременна подготовка на проби от множество епруветки или многолункови плочи (напр. 96-ямкови плочи, микротитърни плаки), сонореактори и ултразвукови куперни. Всички платформи за срязване на ДНК се захранват от честото-настроени, високопроизводителни ултразвукови процесори, които са прецизно контролируеми и осигуряват възпроизводими резултати.

Ултразвукови процесори за всякакъв брой и размер на пробата

С ултразвуковите апарати на Hielscher VialTweeter (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки/многоямкови плаки) става лесно възможно да се намали времето за обработка на пробата благодарение на интензивна и прецизно контролирана ултразвукова обработка, като същевременно се получи желаното разпределение на размера на ДНК фрагмента и добива. Ултразвуковата фрагментация на ДНК прави стъпките за подготовка на плазмидите ефективни, надеждни и мащабируеми. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до множество проби чрез прилагане на постоянни ултразвукови параметри.
Ултразвуковите сонди с един до пет пръста са идеални за приготвяне на по-малки проби. Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher се предлагат с различни нива на мощност, така че можете да изберете идеалния ултразвуков разрушител за вашето приложение, свързано с ДНК.

VialTweeter е ултразвуков ултразвук MultiSample, който позволява надеждна подготовка на пробата при прецизно контролирани температурни условия.

Ултразвуковият модул за подготовка на няколко проби VialTweeter Позволява едновременно ултразвук на до 10 флакона. Със затягащото устройство VialPress могат да се притиснат до 4 допълнителни тръби отпред за интензивно ултразвук.

прецизен контрол на процеса

Ултразвуковите апарати Hielscher могат да се управляват дистанционно чрез управление на браузъра. Параметрите на уникирането могат да се наблюдават и регулират точно според изискванията на процеса.Прецизно контролираните настройки на ултразвука са от решаващо значение, тъй като изчерпателната сонификация може да унищожи ДНК, РНК и хроматин, но неадекватното ултразвуково срязване води до твърде дълги ДНК и хроматинови фрагменти. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher могат лесно да бъдат настроени на прецизен параметър за ултразвук. Специфичните настройки за ултразвук също могат да бъдат запазени като програмирана настройка за бързо повторение на една и съща процедура.
Всички ултразвуки се протоколират автоматично и се съхраняват като CSV файл на вградена SD-карта. Това позволява точно документиране на извършените опити и дава възможност за лесно преразглеждане на ултразвука.
Чрез дистанционното управление на браузъра всички цифрови ултразвукови уреди могат да се управляват и наблюдават чрез всеки стандартен браузър. Не се изисква инсталиране на допълнителен софтуер, тъй като LAN връзката е много проста настройка plug-n-play.

Най-голямо удобство за потребителя по време на ултразвукова подготовка на ДНК

Всички ултразвукови апарати Hielscher са проектирани да осигуряват високоефективен ултразвук, като в същото време винаги са много лесни за използване и лесни за работа. Всички настройки са добре структурирани в ясно меню, което може лесно да бъде достъпно чрез цветен сензорен дисплей или дистанционно управление на браузъра. Интелигентният софтуер с програмируеми настройки и автоматичен запис на данни осигурява оптимални настройки за ултразвук за надеждни и възпроизводими резултати. Изчистеният и лесен за използване интерфейс на менюто превръща ултразвуковите апарати Hielscher в удобни за потребителя и ефективни устройства.
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати за клетъчен лизис и фрагментация на ДНК:

Обем на партидата Дебит Препоръчителни устройства
Плочи с много ямки Не е UIP400MTP
флакони, малка чаша Не е Ултразвуков CupHorn
до 10 флакона Не е ФлаконВисокоговорител за високи честоти
1 до 500 мл 10 до 200 мл/мин UP100H
10 до 2000 мл 20 до 400 мл/мин UP200Ht, UP400St

Свържете се с нас! / Попитайте ни!

Поискайте повече информация

Моля, използвайте формата по-долу, за да поискате допълнителна информация относно ултразвуковите хомогенизатори за екстракция и фрагментиране на ДНК, протоколи за приложение и цени. Ще се радваме да обсъдим Вашия процес с Вас и да Ви предложим ултразвукова система, отговаряща на Вашите изисквания!









Моля, обърнете внимание на нашите Политика за поверителност.






Литература / Препратки

Факти, които си струва да знаете

Какво представляват плазмидите?
Плазмидът е малка кръгла ДНК молекула, която е физически отделена от хромозомната ДНК и се репликира независимо. Плазмидите често се свързват с гени, които допринасят за оцеляването на организма и придават специфични предимства, например антибиотична резистентност. Плазмидите най-често се срещат като малки кръгли, двуверижни ДНК молекули в бактериите; Въпреки това, плазмидите понякога присъстват в археи и еукариотни организми. Плазмидите са важни инструменти в молекулярната биология, генетиката, биохимията и науките за живота. Известни като вектори в генното инженерство, плазмидите се използват за репликация или експресия на определени гени. Целенасочената промяна на вектор се нарича векторен дизайн.

GFP анализ в клетъчните изследвания
Зеленият флуоресцентен протеин (GFP) е универсален биологичен маркер за наблюдение на физиологичните процеси, визуализиране на локализацията на протеина и откриване на трансгенна експресия in vivo. GFP може да се възбуди от 488 nm лазерна линия и се открива оптимално при 510 nm.


High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.

Ще се радваме да обсъдим вашия процес.

Let's get in contact.