Подготовка на плазмиди чрез ултразвукова обработка

Ултразвуковата обработка е надеждна техника за фрагментиране на плазмидна ДНК. Прецизно регулируемата амплитуда, импулсният режим и контролът на температурата са най-важните характеристики на ултразвуковия апарат за фрагментиране на плазмиди без увреждане. Освен това използването на определени агенти помага за защита срещу разграждането на плазмидите. Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за контролирано фрагментиране на плазмиди в отделни флакони, за едновременна ултразвукова обработка на многобройни проби, както и на многоямкови плаки. Научете повече за успешното ултразвуково фрагментиране на плазмиди!

Срязване на плазмиди чрез ултразвукова обработка

Когато проби от ДНК се подлагат на ултразвукови вълни, генерираните от ултразвука вибрации създават акустична кавитация в течността, която чрез механични сили срязва или разкъсва молекулите на ДНК с висока молекулна маса. Ултразвуковата обработка е най-широко използваният метод за експерименти със срязване на ДНК в обем, включително приложения като хроматинова имунопреципитация (ChIP), при които малките размери на фрагментите са абсолютно решаващи за постигането на висока разделителна способност. (вж. Tseng et al., 2012)
Плазмидната ДНК (pDNA) е специфична форма на ДНК, която се характеризира с пръстеновидната си форма и се среща при бактерии и някои еукариоти.
Суперспирализираната pDNA е желаната форма на плазмидна ДНК, тъй като дава най-добри резултати в последващи процеси като автоматизирано секвениране и трансфекция. Ултразвуковата обработка е подходяща за успешно фрагментиране на pDNA, включително на суперспирализирана pDNA.
Thompson et al. (2008) показват, че ултразвуковата обработка на плазмиди, за която е известно, че фрагментира суперспирализирана ДНК, е ефективен начин за увеличаване на дължините на секвенционните прочити с качество phred20 до степен, при която те не се различават значимо от тези на контролната матрица на Beckman Coulter или на ензимно линеаризираните плазмиди.

Използване на плазмидни вектори

Плазмидите често се използват като инструменти за клониране, пренос и манипулиране на гени. Когато плазмидите се използват експериментално за тези цели, те се наричат вектори. ДНК фрагменти или гени могат да бъдат вмъкнати в плазмиден вектор, като така се създава т.нар. рекомбинантен плазмид. Плазмидните вектори се използват като носители за въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетка гостоприемник и са ключов компонент на молекулното клониране.
„Невирусните вектори се изследват широко за потенциалното им използване в генната терапия за лечение на различни сложни заболявания. Невирусните вектори предпазват плазмидната ДНК от физично, химично и ензимно разграждане и доставят молекулата на ДНК до целевото място. Например катионните липозоми, хитозанът и други положително заредени наночастици образуват комплекси с плазмидната ДНК чрез електростатични взаимодействия. Лесно образуващите се комплекси катионни липозоми/плазмидна ДНК обаче са относително големи (т.е. 300–400 nm) и хетерогенни по природа, което затруднява използването им във фармацевтични приложения. Големите и хетерогенни комплекси плазмидна ДНК/липозоми, плазмидна ДНК/аерозоли и плазмидна ДНК/пептиди могат да бъдат преобразувани в по-малки и хомогенни частици чрез ултразвукова обработка.“ (Sarker et al., 2019)
Известен пример за използването на плазмидни вектори е CRISPR–Cas9. Системата CRISPR–Cas9 обикновено се доставя в клетките като един голям плазмид или няколко по-малки плазмида, които кодират целева последователност, направляваща РНК за CRISPR и Cas9.

Ултразвукова подготовка на PLGA наночастици, натоварени с ДНК, чрез нанопреципитация

Jo et al. (2020) използват поли(млечна-ко-гликолова киселина) (PLGA), за да образуват наночастичен носител за доставяне на моделен плазмид CRISPR–Cas9 в първични макрофаги, получени от костен мозък. За нанопреципитацията на PLGA наночастици е използвана PLGA с два различни вида крайни групи (естерни и аминни групи), с цел положително заредените крайни аминни групи да повишат ефективността на капсулиране и натоварването поради взаимодействията между техните заряди и отрицателно заредения скелет на ДНК. В полипропиленова конична центрофужна епруветка с обем 50 mL са разтворени 100 mg Pluronic F127 в 20 mL автоклавирана дейонизирана вода чрез вортексно смесване, последвано от 30 min щадяща ултразвукова обработка в ултразвукова вана (вж. CupHorn). Добавена е автоклавирана магнитна бъркалка и разтворът е разбъркван при 600 RPM в продължение на 30 min, докато се приготвят останалите разтвори. През цялото време са използвани пластмасови вместо стъклени лабораторни съдове, за да се сведе до минимум неспецифичната адсорбция на ДНК. Поотделно са приготвени разтвори на PLGA в DMF (44,48 mg/ ml) и на TIPS пентацен в THF (0,667 mg/ml). PLGA е оставена в покой да се омокри в DMF за 30 min, преди да бъде подложена на ултразвукова обработка за 30 min. (за пълния протокол вж. Jo et al., 2020)

Защита на плазмидната ДНК по време на ултразвукова обработка

ДНК, включително плазмидите и суперспирализираните плазмиди, е силно чувствителна към разграждане. Всички налични методи за фрагментиране са известни с определени недостатъци. Ултразвуковото фрагментиране на ДНК е един от предпочитаните методи, тъй като контролираната ултразвукова обработка в съчетание със защитни мерки позволява да се намалят уврежданията на ДНК веригите, предизвикани от срязване и топлина.
Освен настройките за ниска амплитуда, импулсния режим и контрола на температурата по време на ултразвуково срязване на ДНК, използването на определени агенти показва значителен защитен ефект срещу разграждането на ДНК. Например различни полимери, пептиди и липиди защитават плазмидната ДНК по време на ултразвукова обработка.

Стабилността на плазмидната ДНК и нанокомплексите плазмидна ДНК/IL спрямо ултразвуково напрежение на срязване е изследвана чрез електрофореза в агарозен гел. Както плазмидната ДНК, така и нанокомплексите плазмидна ДНК/IL са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за различни периоди от време. Плазмидната ДНК е изложена на ултразвуково напрежение на срязване за 0, 10, 20, 30 и 40 минути. Нанокомплексите плазмидна ДНК/IL обаче са изложени на ултразвуково напрежение на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минути.
(изследване и изображение: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) показват, че когато наноструктурите плазмидна ДНК / йонна течност (pDNA/IL) са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 min и са образувани комплекси с предлагания на пазара катионен агент за доставяне на гени липофектамин, процентът на флуоресцентно положителните клетки е съответно 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% и 50% (вж. графиката по-долу). Процентът на флуоресцентно положителните клетки се увеличава, когато наноструктурите са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за 10 и 20 min, след което бавно намалява.

Влияние на йонната течност [Bmim][PF6] върху доставянето на плазмидна ДНК в клетки COS7. Нанокомплексите плазмидна ДНК/IL (йонна течност) са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за до 120 минути и са образувани комплекси с LA преди доставянето им в клетки COS7. Данните показват средния брой (%) GFP-положителни клетки HeLa, преброени в 10 различни микроскопски зрителни полета, като експериментът е проведен многократно в три различни дни. (Изследване и графика: ©Sarker et al., 2019)

Ултразвукова подготовка на лизат

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис
Започнете с обогатена клетъчна проба, подготвена чрез метод за разделяне на клетки (например имуномагнитно разделяне на клетки, флуоресцентно активирано сортиране на клетки (FACS), центрофугиране в градиент на плътността, имуноплътностно изолиране на клетки).
Клетъчните проби трябва да съдържат обем лизисен буфер, подходящ за експерименталната цел и за ултразвуковия апарат със сонда.
Предпочитат се хипотонични буфери, тъй като те усилват ултразвуковия клетъчен лизис. Важно е добавките и концентрацията на солите да се използват по подходящ начин.
Изберете устройството си за ултразвуков лизис: за индиректна ултразвукова обработка на флакони се препоръчват VialTweeter или CupHorn. За многоямкови плаки UIP400MTP е идеалният ултразвуков апарат. А за класическа ултразвукова обработка със сонда най-подходящи са ултразвукови хомогенизатори като UP100H или UP200Ht с микровръх.
Протокол за ултразвукова обработка със сонда: Поставете сондата на ултразвуковия апарат в обема на пробата в микроцентрофужна епруветка и извършете ултразвукова обработка за приблизително 10 секунди. В зависимост от ДНК пробата ултразвуковата обработка може да се повтори още един или два пъти. Необходимата вложена ултразвукова енергия (Ws/mL) зависи от вискозитета на пробата и типа ДНК. Охлаждането с ледена баня и импулсният режим на ултразвуковия апарат помагат да се предотврати термичното разграждане на пробата.
След ултразвуковия лизис пробата се центрофугира, за да се отделят остатъците в утайката (съдържащи нелизирани клетки, ядра и нелизирани органели)
Ако пробата не бъде обработена допълнително веднага, тя може да се може да се съхранява при подходяща температура, за да се запази жизнеспособността ѝ.

Ултразвукови апарати за фрагментиране на ДНК

Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови платформи за фрагментиране на ДНК, РНК и хроматин. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), решения за индиректна ултразвукова обработка за едновременна подготовка на проби в множество епруветки или многоямкови плаки (например 96-ямкови плаки, микротитърни плаки), сонореактори и ултразвукови чашкови сонотроди CupHorn. Всички платформи за срязване на ДНК се задвижват от високопроизводителни ултразвукови процесори с настроена честота, които позволяват прецизен контрол и осигуряват възпроизводими резултати.

Ултразвукови процесори за всякакъв брой и размер на пробите

С ултразвуковите апарати на Hielscher за обработка на множество проби VialTweeter (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки/ многоямкови плаки) времето за обработка на пробите може лесно да се намали благодарение на интензивната и прецизно контролируема ултразвукова обработка, като същевременно се получават желаното разпределение по размер на ДНК фрагментите и желаният добив. Ултразвуковото фрагментиране на ДНК прави етапите на подготовка на плазмиди ефективни, надеждни и мащабируеми. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до многобройни проби чрез прилагане на постоянни ултразвукови параметри.
Ултразвуковите апарати със сонди с един до пет пръста са идеални за подготовката на по-малък брой проби. Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher се предлагат с различни нива на мощност, така че можете да изберете идеалния ултразвуков апарат за разрушаване за вашето приложение, свързано с ДНК.