Плазмид подготовка с помощта на ултразвук

Ultrasonication е надеждна техника за фрагментиране на плазмид ДНК. Точно контролируемата амплитуда, режимът на пулсация и контролът на температурата са най-важните характеристики на ултразвуков двигател за невредната разпокъсаност на плазмидите. Освен това, използването на определени агенти помагат да се предпази от разграждане на плазмид. Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за контролирана разпокъсаността на плазмидите от единични флакони, едновременно ултразвук на множество проби, както и много кладенец плочи. Научете повече за успешната ултразвукова фрагментация на плазмид!

Искане на информация




Забележете нашите Правила за поверителност,


Ултразвукова ДНК фрагментация е надеждна и ефективна техника, често използвана в Следващо поколение последователност (NGS)

The UIP400MTP позволява прецизно контролирана ултразвукова работа на много кладенец плочи. Едно от приложенията на UIP400MTP е разпокъсаността на плазмидната ДНК, за да се получат фрагменти с конкретно насочена дължина.

Плазмид срязване с помощта на ultrasonication

Когато ДНК пробите са подложени на ултразвукови вълни, ултразвуково генерираните вибрации създават акустична кавитация в течността, която срязва или разбива ДНК молекули с високо молекулно тегло чрез механични сили. Sonication е най-широко използваният метод за насипни ДНК срязване експерименти, включително приложения, като Хроматин Имунопреципитация (ChIP), за които малки фрагмент размери са абсолютно от решаващо значение за получаване на висока разделителна способност. (срв. Tseng et al., 2012)
Плазмидната ДНК (pDNA) е специфична форма на ДНК, характеризираща се със своята форма на пръстен и се намира в бактерии и някои еукариоти.
Supercoiled pDNA е желаната форма на плазмид ДНК, тъй като показва най-добри резултати в процеси надолу-поток като автоматизирано последователност и трансфекция. Ultrasonication е подходящ за фрагментиране на pDNA, включително супернапрегната pDNA, успешно.
Thompson et al. (2008) демонстрира, че плазмидната ултразвукова обработка, за която е известно, че фрагментира свръхокованата ДНК, е ефективен начин за подобряване на последователността phred20 прочетете дължини до степен, че те не са значително различни от контролния шаблон на Бекман Колтър или ензимно линеаризирани плазмиди.

Предимства на ултразвуковата ДНК фрагментация

  • Прецизно управляеми
  • Възпроизводими резултати
  • Регулируеми до целевите дължини на ДНК фрагмента
  • контрол на температурата
  • Мащабируем до всеки размер на извадката
Видеото показва ултразвуковата система за подготовка на проби UIP400MTP, която позволява надеждната подготовка на пробата на всички стандартни много кладенец плочи с помощта на ултразвук с висока интензивност. Типичните приложения на UIP400MTP включват клетъчен лизис, ДНК, РНК, и хроматин срязване, както и екстракция на протеини.

Ултразвуков апарат UIP400MTP за многопластова ултразвукова обработка

Употреба на плазмидни вектори

Плазмидите често се използват като инструменти за клонинг, прехвърляне, и манипулиране на гени. Когато плазмидите се използват експериментално за тези цели, те се наричат вектори. ДНК фрагменти или гени могат да бъдат вкарани в плазмид вектор, създавайки така наречен рекомбинантен плазмид. Плазмидните вектори се използват като превозни средства за шофиране на рекомбинантна ДНК в приемна клетка и са ключов компонент на молекулярно клониране.
“Невирусните вектори се изследват екстензивно за потенциалната им употреба в генната терапия за лечение на различни усложнени заболявания. Невиррусните вектори предпазват плазмидната ДНК срещу физическо, химично, и ензимно разграждане и доставят ДНК молекулата на целевото място. Например, кациационните липозоми, хитозанът и други положително заредени наночастици образуват комплекси с плазмидна ДНК чрез електростатични взаимодействия. Въпреки това, лесно образуваните кационни липозоми/плазмидни ДНК комплекси са сравнително големи (т.е., 300 – 400 nm) и разнородни в природата, които ги правят трудни за използване във фармацевтичните приложения. Големите и разнородни плазмид ДНК / липозоми, плазмид ДНК / аерозоли, и плазмид ДНК / пептиди комплекси могат да бъдат намалени до по-малки, и хомогенни частици с помощта на ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Виден пример за използването на плазмидни вектори е CRISPR–Cas9. Системата CRISPR–Cas9 обикновено се доставя на клетките като единичен голям плазмид или множество по-малки плазмиди, които кодират целева последователност, ръководство CRISPR и Cas9.

Ултразвукова подготовка на ДНК заредени PLGA Наночастици чрез Нанопреципитация

Jo et al. (2020) използва поли(млечно-ко-гликолова киселина) (PLGA), за да се образува носител на наночастици за доставка на модел CRISPR–Cas9 плазмид в първични костно-мозък получени макрофаги. За нанореципитация на PLGA наночастици, PLGA с две различни крайни групи (естер и амин групи) са използвани с целта, че положително заредените крайни капачки на амин повишават ефективността на капсулиацията и натоварването поради взаимодействията на заряда между него и отрицателно заредения гръбнак на ДНК. В 50 mL полипропиленова конична центрофужна тръба 100 mg Pluronic F127 е разтворена в 20 mL автоклавирани DI вода чрез смесване на вихъра, последвано от 30 min нежна ултразвукова обработка с помощта на ултразвукова вана (виж КъпХорн). Добавен е автоклавиран магнитен разбъркващ бар и разтворът е смесен при 600 RPM за 30 мин, докато другите разтвори са направени. Пластмасовият лабораторен софтуер е използван вместо стъклария навсякъде, за да се сведе до минимум неспецифичната адсорбция на ДНК. Разтворите на PLGA, разтворени в DMF (44,48 mg/ ml) и TIPS пентацен, разтворени в THF (0,667 mg/ml), са направени отделно. PLGA е оставена квесцентно да се намокри в DMF за 30 мин, преди да бъде ултразвукова за 30 мин. (за пълен протокол виж Jo et al., 2020)

Свързани приложения:

  • Извличане на ДНК
  • Капсулиация на ДНК
  • Дисперсия на ДНК с покритие от наночастици
  • Доставка на плазмидна ДНК в клетките
UP200St TD_CupHorn за непряко ултразвуково изследване на пробите

UP200St CupHorn за непряка ултразвукова обработка на проби, например за извличане и фрагментиране на ДНК.

Искане на информация




Забележете нашите Правила за поверителност,


Плазмидна ДНК защита по време на Ултразвук

ДНК включително плазмиди и супернавити плазмиди са силно чувствителни разграждане. Всички налични методи за фрагментиране са известни с определени недостатъци. Ултразвуковата ДНК фрагментация е един от предпочитаните методи, тъй като контролираната ултразвукова обработка в комбинация със защитни мерки позволява да се намали срязването- и топлината- предизвикано увреждане на ДНК нишките.
Освен ниските настройки на амплитудата, пулсационния режим и температурния контрол по време на ултразвуково срязване на ДНК, използването на определени агенти показа значителен защитен ефект срещу разграждането на ДНК. Например, различни полимери, пептиди, и липиди защитават плазмидната ДНК по време на ултразвук.

Йонните течности могат да предпазят плазмидната ДНК срещу щети по време на ултразвук.

Стабилността на плазмид ДНК, и плазмид ДНК / IL нанокомплекси срещу ултразвуков стрес на срязване е изследван с помощта на агароза гел електрофореза assay. Както плазмидната ДНК, така и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси бяха подложени на ултразвуков стрес на срязване за различни времеви точки. Плазмидната ДНК беше изложена на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, и 40 минути. Въпреки това, плазмидната ДНК / IL нанокомплекси бяха изложени на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, и 120 минути.
(проучване и картина: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) демонстрира, че когато плазмидната ДНК / йонна течност (pDNA / IL) наноструктури са били подложени на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, и 120 мин и комплексно с предлагания в търговската мрежа канционен генен агент за доставка липофектамин, процентът на флуоресцентните положителни клетки е 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, съответно 65%, и 50%(вж. графиката по-долу). Процентът на флуоресцентните положителни клетки се е увеличил, когато наноструктурите са били подложени на ултразвуков стрес на срязване за 10, и 20 мин, и след това намалява бавно.

Ултразвукова фрагментация на плазмидната ДНК

Влияние на йонна течност [Bmim][PF6] върху доставката на плазмид ДНК на COS7 клетки. Плазмид ДНК /IL (йонна течност) нанокомплекси бяха подложени на ултразвуков стрес на срязване до 120 минути и сложни с LA преди доставяне в COS7 клетки. Данните показват средния брой (%) на GFP положителните HeLa клетки, преброени в 10 различни микроскопични полета и експериментът е извършен няколко пъти в три различни дни. (Проучване и графика: ©Sarker et al., 2019)

Плазмид ДНК може да бъде защитен добавяне на агент преди ултразвукова фрагментация.

Плазмид ДНК може да бъде защитен добавяне на агент преди ултразвукова фрагментация: Sonication индуцирана разграждане на гола pDNA (A) и на pDNA, формулирани с 1,5 mM На CaCl2 и 20 % (v / v) т-бутанол (B)
Пробите са били с ултразвук със сонда 20W за до 120s, както е посочено на върха на всяка лента. Лейн Н съответства на маркера Хиперландер I ™️. OC и SC плазмидните ленти са посочени.
(проучване и снимки: ©Wu et al., 2009)

Ултразвукова лизатна подготовка

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис
Ultrasonicator UP200Ht с микротип S26d2 за ултразвуково лизиране на биологични пробиЗапочнете с обогатена проба от клетки, която е приготвена чрез метод за разделяне на клетките (напр., имуномагнитно клетъчно разделяне, сортиране на клетки, активирани с флуоресценция (FACS), центрофугиране на градиента на плътността, изолиране на имунодензитетни клетки).
Клетъчните проби трябва да показват обем на лизис буфер, който е подходящ за експериментална цел и ултразвуков апарат тип сонда.
Хипотонични буфери са предпочитани, тъй като те засилват ултразвуковата клетъчна лизис. Важно е добавките и концентрацията на сол да се използват по подходящ начин.
Изберете вашето ултразвуково устройство за лизиране: За непряка ултразвукова обработка на флакони се препоръчва VialTweeter или CupHorn. За мултиуел-плочи UIP400MTP е идеалният ултразвуков мотор. И класическа ултразвукова обработка тип сонда, ултразвуков хомогенизатор като UP100H или UP200Ht с микро-връх са най-подходящи.
Протокол за ултразвук от тип сонда: Поставете ултразвуковата сонда в обема на пробата в микроцентрофужна тръба и ултразвукова за приблизително 10 секунди. В зависимост от ДНК пробата, ултразвукът може да се повтори още един или два пъти. Необходимият ултразвуков енергиен вход (Ws / mL) зависи от вискозитета на пробата и ДНК типа. Охлаждането чрез ледена баня и режим на пулсация на ултразвука помага да се предотврати, че пробата е термично влошена.
След ултразвуков лизис пробата се центрофугира до отделяне на отломки от пелети (съдържащи нелизирани клетки, ядра и нелизирани органели)
Ако пробата не бъде незабавно обработена по-нататък, тя може да се съхранява при подходяща температура, за да се запази нейната жизнеспособност.

Ултразвукови уреди за фрагментиране на ДНК

Hielscher Ultrasonics предлага различни платформи, базирани на ултразвук за ДНК, РНК, и хроматин фрагментация. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), решения за непряка ултразвукова обработка за едновременната проба подготовка на множество тръби или много кладенец плочи (напр., 96-кладенец плочи, микротитър плочи), сонореактори, и ултразвукови cuphorns. Всички платформи за ДНК срязване се захранват от честотно настроени, високопроизводителни ултразвукови процесори, които са прецизно контролируеми и дават възпроизводими резултати.

Ултразвукови процесори за всеки примерен номер и размер

С многопробните ultrasonicators VialTweeter на Hielscher (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки / мултиуел плочи) става Лесно е възможно да се намали времето за обработка на пробите поради интензивна и прецизно контролируема ултразвукова обработка, докато се получи желаното разпределение и добив на размер на фрагмента от ДНК. Ултразвуковата ДНК фрагментация прави стъпките за приготвяне на плазмид ефективни, надеждни и мащабируеми. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до многобройни проби чрез прилагане на постоянни ултразвукови параметри.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ултразвуковата единица за приготвяне на няколко проби VialTweeter позволява едновременното ултразвукиране до 10 флакона. С устройството за захващане VialPress, до 4 допълнителни тръби могат да бъдат притиснати към предната част за интензивна ултразвукова обработка.

прецизен контрол на процеса

Hielscher ultrasonicators могат да бъдат дистанционно контролирани чрез управление на браузъра. Параметрите на ултразвук могат да бъдат наблюдавани и регулирани именно към изискванията за процеса.Точно контролируемите настройки за ултразвук са от решаващо значение, тъй като изчерпателното сонификация може да унищожи ДНК, РНК и хроматин, но неадекватните ултразвукови срязване водят до твърде дълги ДНК и хроматин фрагменти. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher могат лесно да бъдат настроени на прецизен параметър ултразвук. Специфичните настройки за ултразвук могат да бъдат записани и като програмирана настройка за бързо повторение на същата процедура.
Всички ултразвук автоматично се протоколират и съхраняват като CSV файл на вградена SD-карта. Това дава възможност за точна документация на извършените опити и дава възможност да се преразгледа sonication тече лесно.
Чрез дистанционното управление на браузъра всички цифрови ултразвукови апарати могат да бъдат управлявани и наблюдавани чрез всеки стандартен браузър. Не се изисква инсталиране на допълнителен софтуер, тъй като LAN връзката е много проста настройка plug-n-play.

Най-висока удобност за потребителя по време на ултразвукова ДНК подготовка

Всички ultrasonicators Hielscher са предназначени да доставят ултразвук с висока производителност, докато в същото време винаги са много удобни за потребителя и лесни за работа. Всички настройки са добре структурирани в ясно меню, до което лесно може да се стигне чрез цветен сензорен дисплей или дистанционно управление на браузъра. Интелигентният софтуер с програмируеми настройки и автоматично записване на данни осигурява оптимални настройки за ултразвук за надеждни и възпроизводими резултати. Чистият и лесен за използване интерфейс на менюто превръщат ultrasonicators Hielscher в удобни за потребителя и ефективни устройства.
Таблицата по-долу ви дава индикация за приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати за клетъчен лизис и фрагментация на ДНК:

Партида том Дебит Препоръчителни Devices
много кладенец плочи n/a 1000000000000000000000
флакони, малка бехерова бира n/a Ултразвуков cuphorn
до 10 флакона n/a VialTweeter
1 до 500mL 10 до 200 ml / мин UP100H
10 до 2000mL 20 до 400 ml / мин Uf200 ः т, UP400St

Свържете се с нас! / Попитай ни!

Поискайте повече информация

Моля, използвайте формата по-долу, за да заявите допълнителна информация за ултразвуковите хомогенизатори за извличане и разпокъсаността на ДНК, протоколите за приложение и цените. Ще се радваме да обсъдим вашия процес с вас и да ви предложим ултразвукова система, изпълняваща вашите изисквания!









Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,




Литература / Препратки

Факти заслужава да се знае

Какво представляват Плазмидите?
Плазмидът е малка кръгова ДНК молекула, която е физически отделена от хромозомната ДНК и се възпроизвежда самостоятелно. Плазмидите често са свързани с гени, които допринасят за оцеляването на организъм и придават специфични предимства, например антибиотична резистентност. Плазмидите най-често се срещат като малки кръгови, двойно блокирани ДНК молекули в бактериите; обаче, плазмидите понякога присъстват в археите и еукариотните организми. Плазмидите са важни инструменти в молекулярната биология, генетика, биохимия, и науката за живота. Известни като вектори в генното инженерство, плазмидите се използват за репликатиране или изразяване на определени гени. Целенасоченото променяне на вектор се нарича векторен дизайн.

GFP анализ в изследване на клетки
Зеленият флуоресцентен протеин (GFP) е универсален биологичен маркер за наблюдение на физиологичните процеси, визуализиране на протеинова локализация и откриване на трансгенен израз in vivo. GFP може да бъде развълнуван от лазерната линия 488 nm и оптимално се открива при 510 nm.


Ултразвук с висока производителност! Продуктовата гама на Hielscher обхваща пълния спектър от компактния ултразвуков апарат на лабораторията над пейка-топ единици до пълноиндустриални ултразвукови системи.

Hielscher Ultrasonics произвежда високопроизводителни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да се промишлени размери.