Ultrasonication е надеждна техника за фрагментиране на плазмид ДНК. Точно контролируемата амплитуда, режимът на пулсация и контролът на температурата са най-важните характеристики на ултразвуков двигател за невредната разпокъсаност на плазмидите. Освен това, използването на определени агенти помагат да се предпази от разграждане на плазмид. Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за контролирана разпокъсаността на плазмидите от единични флакони, едновременно ултразвук на множество проби, както и много кладенец плочи. Научете повече за успешната ултразвукова фрагментация на плазмид!

Плазмид срязване с помощта на ultrasonication

Когато ДНК пробите са подложени на ултразвукови вълни, ултразвуково генерираните вибрации създават акустична кавитация в течността, която срязва или разбива ДНК молекули с високо молекулно тегло чрез механични сили. Sonication е най-широко използваният метод за насипни ДНК срязване експерименти, включително приложения, като Хроматин Имунопреципитация (ChIP), за които малки фрагмент размери са абсолютно от решаващо значение за получаване на висока разделителна способност. (срв. Tseng et al., 2012)
Плазмидната ДНК (pDNA) е специфична форма на ДНК, характеризираща се със своята форма на пръстен и се намира в бактерии и някои еукариоти.
Supercoiled pDNA е желаната форма на плазмид ДНК, тъй като показва най-добри резултати в процеси надолу-поток като автоматизирано последователност и трансфекция. Ultrasonication е подходящ за фрагментиране на pDNA, включително супернапрегната pDNA, успешно.
Thompson et al. (2008) демонстрира, че плазмидната ултразвукова обработка, за която е известно, че фрагментира свръхокованата ДНК, е ефективен начин за подобряване на последователността phred20 прочетете дължини до степен, че те не са значително различни от контролния шаблон на Бекман Колтър или ензимно линеаризирани плазмиди.

Употреба на плазмидни вектори

Плазмидите често се използват като инструменти за клонинг, прехвърляне, и манипулиране на гени. Когато плазмидите се използват експериментално за тези цели, те се наричат вектори. ДНК фрагменти или гени могат да бъдат вкарани в плазмид вектор, създавайки така наречен рекомбинантен плазмид. Плазмидните вектори се използват като превозни средства за шофиране на рекомбинантна ДНК в приемна клетка и са ключов компонент на молекулярно клониране.
“Невирусните вектори се изследват екстензивно за потенциалната им употреба в генната терапия за лечение на различни усложнени заболявания. Невиррусните вектори предпазват плазмидната ДНК срещу физическо, химично, и ензимно разграждане и доставят ДНК молекулата на целевото място. Например, кациационните липозоми, хитозанът и други положително заредени наночастици образуват комплекси с плазмидна ДНК чрез електростатични взаимодействия. Въпреки това, лесно образуваните кационни липозоми/плазмидни ДНК комплекси са сравнително големи (т.е., 300 – 400 nm) и разнородни в природата, които ги правят трудни за използване във фармацевтичните приложения. Големите и разнородни плазмид ДНК / липозоми, плазмид ДНК / аерозоли, и плазмид ДНК / пептиди комплекси могат да бъдат намалени до по-малки, и хомогенни частици с помощта на ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Виден пример за използването на плазмидни вектори е CRISPR–Cas9. Системата CRISPR–Cas9 обикновено се доставя на клетките като единичен голям плазмид или множество по-малки плазмиди, които кодират целева последователност, ръководство CRISPR и Cas9.

Ултразвукова подготовка на ДНК заредени PLGA Наночастици чрез Нанопреципитация

Jo et al. (2020) използва поли(млечно-ко-гликолова киселина) (PLGA), за да се образува носител на наночастици за доставка на модел CRISPR–Cas9 плазмид в първични костно-мозък получени макрофаги. За нанореципитация на PLGA наночастици, PLGA с две различни крайни групи (естер и амин групи) са използвани с целта, че положително заредените крайни капачки на амин повишават ефективността на капсулиацията и натоварването поради взаимодействията на заряда между него и отрицателно заредения гръбнак на ДНК. В 50 mL полипропиленова конична центрофужна тръба 100 mg Pluronic F127 е разтворена в 20 mL автоклавирани DI вода чрез смесване на вихъра, последвано от 30 min нежна ултразвукова обработка с помощта на ултразвукова вана (виж КъпХорн). Добавен е автоклавиран магнитен разбъркващ бар и разтворът е смесен при 600 RPM за 30 мин, докато другите разтвори са направени. Пластмасовият лабораторен софтуер е използван вместо стъклария навсякъде, за да се сведе до минимум неспецифичната адсорбция на ДНК. Разтворите на PLGA, разтворени в DMF (44,48 mg/ ml) и TIPS пентацен, разтворени в THF (0,667 mg/ml), са направени отделно. PLGA е оставена квесцентно да се намокри в DMF за 30 мин, преди да бъде ултразвукова за 30 мин. (за пълен протокол виж Jo et al., 2020)

Плазмидна ДНК защита по време на Ултразвук

ДНК включително плазмиди и супернавити плазмиди са силно чувствителни разграждане. Всички налични методи за фрагментиране са известни с определени недостатъци. Ултразвуковата ДНК фрагментация е един от предпочитаните методи, тъй като контролираната ултразвукова обработка в комбинация със защитни мерки позволява да се намали срязването- и топлината- предизвикано увреждане на ДНК нишките.
Освен ниските настройки на амплитудата, пулсационния режим и температурния контрол по време на ултразвуково срязване на ДНК, използването на определени агенти показа значителен защитен ефект срещу разграждането на ДНК. Например, различни полимери, пептиди, и липиди защитават плазмидната ДНК по време на ултразвук.

Стабилността на плазмид ДНК, и плазмид ДНК / IL нанокомплекси срещу ултразвуков стрес на срязване е изследван с помощта на агароза гел електрофореза assay. Както плазмидната ДНК, така и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси бяха подложени на ултразвуков стрес на срязване за различни времеви точки. Плазмидната ДНК беше изложена на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, и 40 минути. Въпреки това, плазмидната ДНК / IL нанокомплекси бяха изложени на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, и 120 минути.
(проучване и картина: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) демонстрира, че когато плазмидната ДНК / йонна течност (pDNA / IL) наноструктури са били подложени на ултразвуков стрес на срязване за 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, и 120 мин и комплексно с предлагания в търговската мрежа канционен генен агент за доставка липофектамин, процентът на флуоресцентните положителни клетки е 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, съответно 65%, и 50%(вж. графиката по-долу). Процентът на флуоресцентните положителни клетки се е увеличил, когато наноструктурите са били подложени на ултразвуков стрес на срязване за 10, и 20 мин, и след това намалява бавно.

Влияние на йонна течност [Bmim][PF6] върху доставката на плазмид ДНК на COS7 клетки. Плазмид ДНК /IL (йонна течност) нанокомплекси бяха подложени на ултразвуков стрес на срязване до 120 минути и сложни с LA преди доставяне в COS7 клетки. Данните показват средния брой (%) на GFP положителните HeLa клетки, преброени в 10 различни микроскопични полета и експериментът е извършен няколко пъти в три различни дни. (Проучване и графика: ©Sarker et al., 2019)

Ултразвукова лизатна подготовка

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис
Започнете с обогатена проба от клетки, която е приготвена чрез метод за разделяне на клетките (напр., имуномагнитно клетъчно разделяне, сортиране на клетки, активирани с флуоресценция (FACS), центрофугиране на градиента на плътността, изолиране на имунодензитетни клетки).
Клетъчните проби трябва да показват обем на лизис буфер, който е подходящ за експериментална цел и ултразвуков апарат тип сонда.
Хипотонични буфери са предпочитани, тъй като те засилват ултразвуковата клетъчна лизис. Важно е добавките и концентрацията на сол да се използват по подходящ начин.
Изберете вашето ултразвуково устройство за лизиране: За непряка ултразвукова обработка на флакони се препоръчва VialTweeter или CupHorn. За мултиуел-плочи UIP400MTP е идеалният ултразвуков мотор. И класическа ултразвукова обработка тип сонда, ултразвуков хомогенизатор като UP100H или UP200Ht с микро-връх са най-подходящи.
Протокол за ултразвук от тип сонда: Поставете ултразвуковата сонда в обема на пробата в микроцентрофужна тръба и ултразвукова за приблизително 10 секунди. В зависимост от ДНК пробата, ултразвукът може да се повтори още един или два пъти. Необходимият ултразвуков енергиен вход (Ws / mL) зависи от вискозитета на пробата и ДНК типа. Охлаждането чрез ледена баня и режим на пулсация на ултразвука помага да се предотврати, че пробата е термично влошена.
След ултразвуков лизис пробата се центрофугира до отделяне на отломки от пелети (съдържащи нелизирани клетки, ядра и нелизирани органели)
Ако пробата не бъде незабавно обработена по-нататък, тя може да се съхранява при подходяща температура, за да се запази нейната жизнеспособност.

Ултразвукови уреди за фрагментиране на ДНК

Hielscher Ultrasonics предлага различни платформи, базирани на ултразвук за ДНК, РНК, и хроматин фрагментация. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), решения за непряка ултразвукова обработка за едновременната проба подготовка на множество тръби или много кладенец плочи (напр., 96-кладенец плочи, микротитър плочи), сонореактори, и ултразвукови cuphorns. Всички платформи за ДНК срязване се захранват от честотно настроени, високопроизводителни ултразвукови процесори, които са прецизно контролируеми и дават възпроизводими резултати.

Ултразвукови процесори за всеки примерен номер и размер

С многопробните ultrasonicators VialTweeter на Hielscher (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки / мултиуел плочи) става Лесно е възможно да се намали времето за обработка на пробите поради интензивна и прецизно контролируема ултразвукова обработка, докато се получи желаното разпределение и добив на размер на фрагмента от ДНК. Ултразвуковата ДНК фрагментация прави стъпките за приготвяне на плазмид ефективни, надеждни и мащабируеми. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до многобройни проби чрез прилагане на постоянни ултразвукови параметри.
Ултразвуковите уреди на сондата с един до пет пръста са идеални за приготвяне на по-малки номера на пробите. Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher са на разположение с различни нива на мощност, така че да можете да изберете идеалния ултразвуков нарушители за вашето приложение, свързано с ДНК.