Плазмидна подготовка с помощта на ултразвук

Ултразвукът е надеждна техника за фрагментиране на плазмидна ДНК. Прецизно контролираната амплитуда, режимът на пулсация и контролът на температурата са най-важните характеристики на ултразвуковия апарат за неувреждаща плазмидна фрагментация. Освен това използването на определени агенти помага за предпазване от разграждане на плазмидите. Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за контролирана плазмидна фрагментация от единични флакони, едновременно ултразвук на множество проби, както и на многолункови плаки. Научете повече за успешната ултразвукова плазмидна фрагментация!

Плазмидно срязване с помощта на ултразвук

Когато ДНК пробите са подложени на ултразвукови вълни, ултразвуково генерираните вибрации създават акустична кавитация в течността, която срязва или разрушава ДНК молекули с високо молекулно тегло чрез механични сили. Соникацията е най-широко използваният метод за експерименти с насипно срязване на ДНК, включително приложения, като хроматинова имунопреципитация (ChIP), за която малките размери на фрагментите са от решаващо значение за получаване на висока разделителна способност. (срв. Tseng et al., 2012)
Плазмидната ДНК (пДНК) е специфична форма на ДНК, характеризираща се с пръстеновидната си форма и се среща при бактерии и някои еукариоти.
Супернавитата пДНК е желаната форма на плазмидна ДНК, тъй като показва най-добри резултати в процеси надолу по веригата като автоматизирано секвениране и трансфекция. Ултразвукът е подходящ за успешно фрагментиране на пДНК, включително супернавита пДНК.
Thompson et al. (2008) демонстрират, че плазмидната ултразвук, за която е известно, че фрагментира супернавита ДНК, е ефективен начин за подобряване на дължината на четене на последователността phred20 до степен, че те не се различават значително от контролния шаблон на Beckman Coulter или ензимно линеаризираните плазмиди.

Използване на плазмидни вектори

Плазмидите често се използват като инструменти за клониране, прехвърляне и манипулиране на гени. Когато плазмидите се използват експериментално за тези цели, те се наричат вектори. ДНК фрагменти или гени могат да бъдат вмъкнати в плазмиден вектор, създавайки така наречения рекомбинантен плазмид. Плазмидните вектори се използват като превозни средства за задвижване на рекомбинантна ДНК в клетката гостоприемник и са ключов компонент на молекулярното клониране.
“Невирусните вектори се изследват широко за потенциалното им използване в генната терапия за лечение на различни сложни заболявания. Невирусните вектори предпазват плазмидната ДНК от физическо, химично и ензимно разграждане и доставят молекулата на ДНК до целевото място. Например, катионни липозоми, хитозан и други положително заредени наночастици образуват комплекси с плазмидна ДНК чрез електростатични взаимодействия. Въпреки това, лесно образуваните катионни липозоми/плазмидни ДНК комплекси са относително големи (т.е. 300–400 nm) и хетерогенни по природа, което ги прави трудни за използване във фармацевтични приложения. Големите и хетерогенни плазмидни ДНК/липозоми, плазмидните ДНК/аерозоли и плазмидните ДНК/пептидни комплекси могат да бъдат намалени до по-малки и хомогенни частици с помощта на ултразвук.” (Sarker et al., 2019)
Ярък пример за използването на плазмидни вектори е CRISPR-Cas9. Системата CRISPR-Cas9 обикновено се доставя в клетките като един голям плазмид или множество по-малки плазмиди, които кодират целева последователност, CRISPR водач и Cas9.

Ултразвукова подготовка на заредени с ДНК PLGA наночастици чрез наноутаждение

Jo et al. (2020) използват поли(млечно-когликолова киселина) (PLGA), за да образуват носител на наночастици за доставяне на модел на плазмид CRISPR-Cas9 в първични макрофаги, получени от костен мозък. За наноутаицирането на PLGA наночастици са използвани PLGA с две различни крайни групи (естерни и аминови групи) с цел положително заредените аминови крайни капачки да увеличат ефективността на капсулиране и натоварването поради зарядовите взаимодействия между него и отрицателно заредения гръбнак на ДНК. В 50 ml полипропиленова конична центрофужна тръба 100 mg Pluronic F127 се разтваря в 20 ml автоклавна DI вода чрез вихрово смесване, последвано от 30 минути нежна ултразвукова вана (виж CupHorn). Добавя се автоклавна магнитна бъркалка и разтворът се разбърква при 600 оборота в минута за 30 минути, докато се правят другите разтвори. Пластмасови лабораторни съдове са използвани вместо стъклени съдове, за да се сведе до минимум неспецифичната адсорбция на ДНК. Разтвори на PLGA, разтворени в DMF (44,48 mg/ml) и TIPS пентацен, разтворен в THF (0,667 mg/ml), са направени отделно. PLGA беше оставен в покой да се намокри в DMF за 30 минути, преди да бъде ултразвук за 30 минути.

Защита на плазмидната ДНК по време на съниране

ДНК, включително плазмиди и супернавити плазмиди, е силно чувствителна деградация. Всички налични методи за фрагментация са известни с определени недостатъци. Ултразвуковата фрагментация на ДНК е един от предпочитаните методи, тъй като контролираната ултразвук в комбинация със защитни мерки позволява да се намали увреждането на ДНК веригите, предизвикано от срязване и топлина.
Освен настройки на ниска амплитуда, режим на пулсация и контрол на температурата по време на ултразвуково срязване на ДНК, използването на определени агенти показва значителен защитен ефект срещу разграждането на ДНК. Например, различни полимери, пептиди и липиди защитават плазмидната ДНК по време на ултразвук.

Стабилността на плазмидната ДНК и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси срещу ултразвуково напрежение на срязване е изследвана с помощта на електрофореза на агарозен гел. Както плазмидната ДНК, така и плазмидните ДНК/IL нанокомплекси са подложени на ултразвуково напрежение на срязване за различни времеви точки. Плазмидната ДНК е изложена на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30 и 40 минути. Въпреки това, плазмидните ДНК/IL нанокомплекси са били изложени на ултразвуков стрес на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минути.
(проучване и снимка: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) демонстрира, че когато наноструктурите на плазмидната ДНК / йонна течност (pDNA/IL) са подложени на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минути и са комплексирани с наличния в търговската мрежа агент за доставка на катионни гени липофектамин, процентът на флуоресцентните положителни клетки е 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, съответно 65% и 50% (виж графиката по-долу). Процентът на флуоресцентните положителни клетки се увеличава, когато наноструктурите са подложени на ултразвуково напрежение на срязване в продължение на 10 и 20 минути и след това бавно намалява.

Влияние на йонна течност [Bmim][PF6] върху доставката на плазмидна ДНК до COS7 клетките. Плазмидните ДНК/IL (йонна течност) нанокомплекси са подложени на ултразвуков стрес на срязване до 120 минути и се комплексират с LA, преди да бъдат доставени в COS7 клетки. Данните показват средния брой (%) на GFP положителните HeLa клетки, преброени в 10 различни микроскопични полета и експериментът е проведен няколко пъти в три различни дни. (Проучване и графика: ©Sarker et al., 2019)

Ултразвуков лизат

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис
Започнете с обогатена проба от клетки, която е приготвена чрез метод на клетъчно разделяне (напр. имуномагнитно разделяне на клетки, флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране (FACS), центрофугиране с градиент на плътността, изолиране на клетки с имунна плътност).
Клетъчните проби трябва да показват обем на лизисен буфер, който е подходящ за експерименталната цел и ултразвуков сигнал тип сонда.
Хипотоничните буфери са предпочитани, тъй като подобряват ултразвуковия клетъчен лизис. Важно е добавките и концентрацията на сол да се използват по подходящ начин.
Изберете вашето устройство за ултразвуков лизис: За индиректно ултразвуково ултразвуково излъчване на флакони се препоръчват VialTweeter или CupHorn. За многоямкови плочи UIP400MTP е идеалният ултразвуков уред. А класическата сонда, ултразвуков хомогенизатор като UP100H или UP200Ht с микронакрайник са най-подходящи.
Протокол за ултразвук тип сонда: Поставете ултразвуковата сонда в обема на пробата в епруветка за микроцентрофуга и ултразвук за около 10 секунди. В зависимост от пробата от ДНК, ултразвукът може да се повтори още един или два пъти. Необходимата входяща ултразвукова енергия (Ws/ml) зависи от вискозитета на пробата и вида на ДНК. Охлаждането чрез ледена баня и режим на пулсация на ултразвука помага да се предотврати термичното разграждане на пробата.
След ултразвуков лизис пробата се центрофугира, за да се отделят остатъците от пелети (съдържащи нелизирани клетки, ядра и нелизирани органели)
Ако пробата не бъде незабавно обработена допълнително, тя може да се съхранява при подходяща температура, за да се запази нейната жизнеспособност.

Ултразвукови апарати за фрагментация на ДНК

Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови платформи за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), индиректни решения за ултразвук за едновременна подготовка на проби от множество епруветки или многолункови плочи (напр. 96-ямкови плочи, микротитърни плаки), сонореактори и ултразвукови куперни. Всички платформи за срязване на ДНК се захранват от честото-настроени, високопроизводителни ултразвукови процесори, които са прецизно контролируеми и осигуряват възпроизводими резултати.

Ултразвукови процесори за всякакъв брой и размер на пробата

С ултразвуковите апарати на Hielscher VialTweeter (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки/многоямкови плаки) става лесно възможно да се намали времето за обработка на пробата благодарение на интензивна и прецизно контролирана ултразвукова обработка, като същевременно се получи желаното разпределение на размера на ДНК фрагмента и добива. Ултразвуковата фрагментация на ДНК прави стъпките за подготовка на плазмидите ефективни, надеждни и мащабируеми. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до множество проби чрез прилагане на постоянни ултразвукови параметри.
Ултразвуковите сонди с един до пет пръста са идеални за приготвяне на по-малки проби. Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher се предлагат с различни нива на мощност, така че можете да изберете идеалния ултразвуков разрушител за вашето приложение, свързано с ДНК.