Подготовка на ултразвукова проба за ELISA тестове

Анализи като ELISA се използват широко за ин витро диагностика, откриване на протеини, свързани със заболяването, и контрол на качеството (напр. наблюдение на хранителни алергени). Ултразвуковата подготовка на проби е бърза, надеждна и възпроизводима техника за лизиране на клетки и изолиране на вътреклетъчни протеини, ДНК, РНК и органели. Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за удобно приготвяне на единични проби, множество флакони, както и за микротитърни плаки и 96-ямкови плаки.

ЕЛИСА – Ензимно-свързан имуносорбентен анализ

ELISA означава ензимно-свързан имуносорбентен анализ и е широко използвана техника за биохимичен анализ от категорията на тестовете за свързване на лиганди. При ELISA течна проба се добавя върху неподвижна твърда фаза със специални свързващи свойства. Обикновено неподвижната твърда фаза се нанася като покритие върху кладенец или ELISA плоча. След това последователно се добавят, инкубират и измиват различни течни реагенти, така че накрая да настъпи оптична промяна (напр. развитие на цвета от продукта на ензимна реакция) в крайната течност в кладенеца. Оптичната промяна позволява да се измери количеството на аналита чрез така нареченото количествено “четене". За количественото отчитане се използва спектрофотометър, флуорометър или луминометър за откриване и измерване на интензитета на предаваната светлина. Чувствителността на откриване се влияе от усилването на сигнала по време на аналитичните реакции. Тъй като ензимните реакции са добре проучени и надеждни процеси на амплификация, за създаване на сигнала се използват ензими. Ензимите са свързани с реагентите за откриване във фиксирани пропорции, за да се позволи точно количествено определяне, което обяснява и името "ензимно-свързан" имуносорбентен анализ.
Тъй като ELISA тестовете се извършват в микротитърни плаки / 96-ямкови плаки, това е известно като метода на анализа на базата на плаки и се използва например в клинична ин витро диагностика, изследвания, разработване на лекарства и т.н. за откриване и количествено определяне на антитела, пептиди, протеини и хормони.
Техниката ELISA често се използва като диагностичен инструмент в медицината, биотехнологиите, растителната патология и също така е важно измерване за контрол на качеството в множество индустрии.

Подготовка на ултразвукова проба преди ELISA

Преди да може да се извърши ELISA анализът, пробите изискват етапи на подготовка като клетъчен лизис и екстракция на вътреклетъчни протеини, ДНК, РНК и др. Предимството на ултразвуковия клетъчен лизис и изолирането на протеини е неговата висока ефективност, надеждност и възпроизводимост. Всички тези фактори са важни за получаване на висококачествени резултати от диагностиката и изследванията

Протокол за ултразвукова клетъчна лиза преди ELISA

• За клетъчни култури: Преди ултразвуковия клетъчен лизис се центрофугират клетките за 5 минути при 270 x g в микроцентрофуга. Супернатанта се отстранява чрез аспирация и клетките се ресуспендират в 30 – 100 μL RIPA буфер. След това инкубирайте клетъчната пелета върху лед за 30 минути.
• Сега клетъчната проба е готова за ултразвуков лизис:
  Използвайте ултразвуков звук тип сонда (напр. UP200Ht със сонда S26d2) или ултразвуково устройство за множество проби (напр. VialTweeter за едновременно ултразвуково озвучаване на до 10 флакона или UIP400MPT за микротитърни плаки / 96-ямкови плаки) в зависимост от количеството проби, които трябва да подготвите.
  За ултразвук тип сонда на една проба, поставете клетките в 1,5 ml микроцентрофужни епруветки.
• Предварително задайте вашата ултразвукова продължителност, обща входяща енергия, режим на цикъл и/или температурни граници в цифровото меню на ултразвукоговорителя. Това гарантира високонадеждна ултразвук и повторяемост.
• Поставете сонотрода и включете ултразвуковото устройство. Внимателно преместете микровърха на ултразвуковата сонда през пробата, за да излъчите пробата равномерно.
  За повечето клетки ултразвуковият лизис ще бъде завършен след 2 -4 цикъла по 10 секунди ултразвук.
• След ултразвук отстранете сонотрода от пробата. Пробите трябва да се инкубират върху лед в продължение на 5 минути. След това центрофугата при 10 000 x g за 20 минути, за да гранулирате отломките. Прехвърлете супернатантите в нова епруветка за микроцентрофуга. Етикетирайте аналитите и съхранявайте при -20°C.
• Ултразвуковият сонотрод може да се почисти, като се избърше правилно със спирт или ултразвук в чаша, пълна със спирт, например 70% етанол. Всички ултразвукови сонди, изработени от титан, са автоклавиращи.

• Изплакнете тъканта с ледено студен PBS (0,01M, pH=7,4), за да отстраните добре излишната кръв от хемолиза.
• Претеглете тъканта (бъбрек, сърце, бял дроб, далак и т.н.) и я мацерирайте на малки парченца, които се хомогенизират в PBS. Необходимият обем на PBS е свързан с теглото на тъканта. Като правило, 1 g тъкан изисква приблизително 9 ml PBS. Препоръчително е да добавите някакъв протеазен инхибитор към PBS. (RIPA или хипотоничен лизисен буфер, съдържащ протеаза и фосфатазен инхибиторен коктейл, може да се използва алтернативно.)
• В зависимост от размера на тъканта, кратко вихрово лечение (приблизително 1-2 минути за 15 сек. импулса) може да бъде полезно за предварителна обработка на тъканта.
• Монтирайте микронакрайник, например S26d2, към вашия ултразвуков уред. Поставете епруветката за проба с тъканта в ледена баня.
• Соникирайте пробата с вашия ултразвуков уред, например UP200St (80% амплитуда) за 1 минута в импулсен режим (15 секунди включено, 15 секунди пауза). Съхранявайте пробата в ледената баня.
• След това хомогенатите се центрофугират за получаване на специфични пулове (цитозолни, ядрени, митохондриални или лизозомни), за да се обогати протеинът за анализ. Чрез центрофугиране на пробата в продължение на 5 минути при 5000×g се извлича супернатантът.

Надежден контрол на температурата по време на уникиране

Температурата е решаващ фактор, влияещ върху процеса, който е особено важен за третирането на биологични проби, например за предотвратяване на термичното разграждане на протеините. Както всички механични техники за подготовка на проби, ултразвукът създава топлина. Температурата на пробите обаче може да се контролира добре, когато се използват ултразвуковите устройства на Hielscher. Представяме ви различни опции за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте с ултразвуков уред тип сонда или VialTweeter предварително аналитично.

1. Следене на температурата на пробата: Всички цифрови ултразвукови процесори на Hielscher са оборудвани с интелигентен софтуер и сензор за температура, който може да се включи. Включете температурния сензор в ултразвуковото устройство (напр. UP200Ht, UP200St, ФлаконВисокоговорител за високи честоти, UIP400MTP) и поставете върха на температурния датчик в една от епруветките за проби. Чрез цифров цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на ултразвуковия процесор определен температурен диапазон за ултразвуковата проба. Ултразвуковият уред автоматично ще спре при достигане на максималната температура и ще направи пауза, докато температурата на пробата спадне до по-ниската стойност на зададената температурна ∆. След това ултразвукът започва автоматично отново. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, предизвикано от топлина.
2. Що се отнася до ултразвуковия VialTweeter, титаниевият блок, който държи епруветките за проби, може да бъде предварително охладен. Поставете блока VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилника или фризера, за да охладите предварително титаниевия блок помага за отлагане на повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да бъде предварително охладена.
3. Използвайте ледена баня или сух лед, за да се охладите по време на ултразвук. Поставете пробната тръба (и) по време на ултразвук в ледена баня. За VialTweeter използвайте плитка тава, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter върху сухия лед, така че топлината да може бързо да се разсее.

Клиентите по целия свят използват ултразвуковите апарати Hielscher, както и ултразвуковите уреди VialTweeter и UIP400MTP за ежедневната си работа по подготовка на проби в биологични, биохимични, медицински и клинични лаборатории. Интелигентният софтуер и контролът на температурата на процесорите Hielscher, температурата се контролира надеждно и се избягва разграждането на пробите, предизвикано от топлина. Ултразвуковата подготовка на проби с ултразвукови разтвори на Hielscher осигурява изключително надеждни и възпроизводими резултати!