Ултразвукова подготовка на проби за ELISA анализи

Анализи като ELISA се използват широко за инвитро диагностика, откриване на белтъци, свързани със заболявания, и контрол на качеството (напр. наблюдение на хранителни алергени). Ултразвуковата подготовка на проби е бърз, надежден и възпроизводим метод за лизиране на клетки и изолиране на вътреклетъчни белтъци, ДНК, РНК и органели. Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за удобна подготовка на единични проби, множество флакони, както и микротитърни плаки и плаки с 96 ямки.

ELISA – ензимно-свързан имуносорбентен анализ

ELISA означава ензимно-свързан имуносорбентен анализ и е широко използван метод за биохимичен анализ от категорията на анализите за свързване на лиганди. При ELISA течна проба се добавя върху неподвижна твърда фаза със специални свързващи свойства. Обикновено неподвижната твърда фаза се нанася като покритие върху плака с ямки или ELISA плака. След това последователно се добавят различни течни реагенти, извършват се инкубиране и промиване, така че накрая в крайната течност в ямката настъпва оптична промяна (напр. развитие на цвят от продукта на ензимна реакция). Оптичната промяна позволява да се измери количеството на аналита чрез така нареченото количествено „отчитане“. За количественото отчитане се използва спектрофотометър, флуориметър или луминометър за откриване и измерване на интензитета на преминалата светлина. Чувствителността на откриването се влияе от усилването на сигнала по време на аналитичните реакции. Тъй като ензимните реакции са добре проучени и представляват надеждни процеси на усилване, за създаване на сигнала се използват ензими. Ензимите са свързани с реагентите за откриване в фиксирани съотношения, за да се осигури точно количествено определяне, което обяснява и наименованието „ензимно-свързан“ имуносорбентен анализ.
Тъй като ELISA анализите се извършват в микротитърни плаки / плаки с 96 ямки, методът е известен като аналитична техника, базирана на плаки, и се използва напр. в клиничната инвитро диагностика, научните изследвания, разработването на лекарства и др. за откриване и количествено определяне на антитела, пептиди, белтъци и хормони.
Методът ELISA често се използва като диагностичен инструмент в медицината, биотехнологиите и фитопатологията и също така е важен метод за измерване при контрола на качеството в множество отрасли.

Ултразвукова подготовка на проби преди ELISA

Преди да може да се извърши ELISA анализът, пробите изискват подготвителни стъпки като клетъчен лизис и екстракция на вътреклетъчни белтъци, ДНК, РНК и др. Предимството на ултразвуковия клетъчен лизис и изолирането на белтъци е високата им ефективност, надеждност и възпроизводимост. Всички тези фактори са важни за получаването на висококачествени диагностични и научноизследователски резултати

Протокол за ултразвуков клетъчен лизис преди ELISA

• За клетъчни култури: Преди ултразвуковия клетъчен лизис центрофугирайте клетките за 5 mins при 270 x g в микроцентрофуга. Отстранете супернатанта чрез аспирация и ресуспендирайте клетките в 30 – 100 μL RIPA буфер. След това инкубирайте клетъчната утайка върху лед за 30 min.
• Сега клетъчната проба е готова за ултразвуков лизис:
  Използвайте ултразвуков уред със сонда (напр. UP200Ht със сонда S26d2) или ултразвуков уред за множество проби (напр. VialTweeter за едновременна ултразвукова обработка на до 10 флакона или UIP400MPT за микротитърни плаки / плаки с 96 ямки) в зависимост от броя проби, които трябва да подготвите.
  За ултразвукова обработка със сонда на единична проба поставете клетките в микроцентрофужни епруветки с обем 1,5 mL.
• Задайте предварително продължителността на ултразвуковата обработка, общата внесена енергия, цикличния режим и/или температурните граници в цифровото меню на ултразвуковия уред. Това осигурява висока надеждност на ултразвуковата обработка и повторяемост.
• Въведете сонотрода в пробата и включете ултразвуковия уред. Внимателно движете микровърха на ултразвуковата сонда през пробата, за да я обработите равномерно с ултразвук.
  За повечето клетки ултразвуковият лизис ще бъде завършен след 2 – 4 цикъла на ултразвукова обработка по 10 sec.
• След ултразвуковата обработка извадете сонотрода от пробата. Пробите трябва да се инкубират върху лед за 5 min. След това центрофугирайте при 10 000 x g за 20 min, за да утаите клетъчните остатъци. Прехвърлете супернатантите в нова микроцентрофужна епруветка. Етикетирайте аналитите и ги съхранявайте при -20°C.
• Ултразвуковият сонотрод може да се почиства чрез старателно избърсване със спирт или чрез ултразвукова обработка в лабораторна чаша, пълна със спирт, напр. 70% етанол. Всички ултразвукови сонди, изработени от титан, могат да се автоклавират.

• Промийте тъканта с ледено студен PBS (0,01M, pH=7,4), за да отстраните старателно излишната хемолизирана кръв.
• Претеглете тъканта (бъбрек, сърце, бял дроб, далак и др.) и я раздробете на малки парчета, които се хомогенизират в PBS. Необходимият обем PBS е свързан с масата на тъканта. Като практическо правило за 1g тъкан са необходими приблизително 9mL PBS. Препоръчва се към PBS да се добави протеазен инхибитор. (Като алтернатива може да се използва RIPA или хипотоничен лизисен буфер, съдържащ смес от протеазни и фосфатазни инхибитори.)
• В зависимост от размера на тъканта кратка обработка с вортекс (приблизително 1–2 min. на импулси по 15 sec.) може да бъде полезна за предварителната ѝ обработка.
• Монтирайте микровръх, напр. S26d2, към ултразвуковия си уред. Поставете епруветката с тъканната проба в ледена баня.
• Обработете пробата с ултразвуковия си уред, напр. UP200St (80% амплитуда), за 1 min. в импулсен режим (15sec работа, 15sec пауза). Дръжте пробата в ледената баня.
• След това хомогенатите се центрофугират, за да се получат специфични фракции (цитозолни, ядрени, митохондриални или лизозомни) с цел обогатяване на белтъка за анализ. Чрез центрофугиране на пробата за 5 минути при 5000×g се получава супернатантът.

Надежден контрол на температурата по време на ултразвукова обработка

Температурата е решаващ фактор, влияещ върху процеса, който е особено важен при обработката на биологични проби, напр. за предотвратяване на термичното разграждане на белтъци. Както всички механични методи за подготовка на проби, ултразвуковата обработка генерира топлина. Въпреки това температурата на пробите може да се контролира добре при използване на уредите на Hielscher Ultrasonics. Представяме ви различни възможности за наблюдение и контрол на температурата на пробите при преданалитичната им подготовка с ултразвуков уред със сонда или с VialTweeter.

1. Наблюдение на температурата на пробата: Всички цифрови ултразвукови процесори на Hielscher са оборудвани с интелигентен софтуер и температурен сензор, който може да се включва към уреда. Свържете температурния сензор към ултразвуковия уред (напр. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ултразвуковия уред за плаки с множество ямки UIP400MTP) и въведете върха на температурния сензор в една от епруветките с проби. Чрез цифровия цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на ултразвуковия процесор конкретен температурен диапазон за ултразвуковата обработка на пробата. Ултразвуковият уред автоматично ще спре при достигане на максималната температура и ще остане в пауза, докато температурата на пробата спадне до долната стойност на зададената температура ∆. След това ултразвуковата обработка автоматично започва отново. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, предизвикано от топлина.
2. При ултразвуковия уред за множество проби VialTweeter титановият блок, който държи епруветките с проби, може да се охлади предварително. Поставете блока на VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилник или фризер, за да охладите предварително титановия блок и така да отложите повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да се охлади предварително.
3. Използвайте ледена баня или сух лед за охлаждане по време на ултразвуковата обработка. Поставете епруветката или епруветките с проби в ледена баня по време на ултразвуковата обработка. За VialTweeter използвайте плитка тава, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter върху сухия лед, така че топлината да може бързо да се разсейва.

Клиенти по целия свят използват ултразвуковите уреди със сонда на Hielscher, както и уредите за ултразвукова обработка на множество проби VialTweeter и UIP400MTP за ежедневната си работа по подготовка на проби в биологични, биохимични, медицински и клинични лаборатории. Благодарение на интелигентния софтуер и температурния контрол на процесорите на Hielscher температурата се контролира надеждно и се избягва разграждането на пробите, предизвикано от топлина. Ултразвуковата подготовка на проби с ултразвуковите решения на Hielscher осигурява изключително надеждни и възпроизводими резултати!
Прочетете повече за ултразвуковата обработка с висок капацитет за обработка на проби чрез ултразвуковия уред за плаки с множество ямки UIP400MTP за анализи!