Клетъчен лизис на BL21 клетки чрез ултразвук
BL21 клетки са щам на E. coli, който се използва широко в изследователски лаборатории, биотехнологии и промишлено производство поради способността им да изразят високоефективни протеини. Ултразвуково разрушаване на клетките, лизис и екстракция на протеин е общият метод за изолиране и събиране на целевите протеини от клетъчния интериор на BL21 клетки. Ultrasonication разрушава напълно клетката и освобождава всички затрупвани протеини, което прави 100% от протеина наличен.
BL21 клетки за протеин експресия
BL21 клетка е химически компетентен E. coli бактериален щам, подходящ за трансформация и протеин израз високо ниво с помощта на T7 RNA полимеразна-IPTG индукция система. BL21 клетките позволяват високоефективна протеинова експресия на всеки ген, който е под контрола на Т7 промотор. Щамът E. coli BL21(DE3) е Т7 РНК полимеразна протеинова основа производствен щам, в комбинация с T7 промотор-базирани експресни вектори и се прилага широко в лабораториите и индустрията за производство на рекомбинантни протеини. В BL21(DE3), експресията на генния кодифициране на рекомбинантния протеин се транскрибира чрез хромозомно кодирана T7 РНК полимераза (T7 РНКП), която преписва осем пъти по-бързо от конвенционалната РНКРНР. Това прави щама BL21 (DE3) високо ефективен и превръща в една от най-предпочитаните протеин експресионни клетъчни системи.
Протокол за ултразвукова лизис и екстракция на протеини от BL21 клетки
Клетъчният лизис на BL21 клетките се извършва предимно чрез ултразвук в комбинация с натриев лауроил саркозинат (известен също като sarkosyl) като лизис буфер. Предимствата на ултразвуковото разрушаване на клетките и екстракцията на протеини лежат в надеждността, възпроизводимостта, както и простото, безопасно и бързо функциониране на ултразвуковите апарати. Протоколът по-долу дава стъпка по стъпка посока за ултразвуков BL21 клетъчен лизис:
- За да се отстранят протеините на чапедон, BL21 бактериални пелети са ресуспендирани в 50 мл ледено студен натриев Tris-EDTA (STE) буфер (състоящ се от 10 mM Tris-HCL, рН 8.0, 1 тМ EDTA, 150 тМ NaCl допълнена със 100 mM PMSF).
- Добавят се 500 μg лизозим (10 mg/ ml) и клетките се инкубират върху леда за 15 минути.
- След това се добавят 500 ул на DTT и 7 ml саркозил (10% (w/v), съставени в ste буфер).
- От съществено значение е да се поддържат всички буфери за пречистване на леда и да се поддържат пробите върху леда през цялото време. Всички стъпки за пречистване трябва да се извършват в студената стая, ако е възможно.
- За ултразвуков лизис и екстракция на протеин пробите се извършват с ултразвук в Многосемплиране на татуатор за 4 x 30 сек при 100% амплитуда с интервал от 2 минути между всяка звукова обработка. Като алтернатива, ултразвуков хомогенизатор тип сонда с микрона върха, например, Uf200 ः т с S26d2 (3 х 30 сек, 2 мин. пауза между ултразвукови цикли, 80% амплитуда) може да се използва.
- За по-нататъшни стъпки за пречистване пробите трябва да се съхраняват в лед или алтернативно да се съхраняват при -80 °C до по-нататъшна обработка.
Ултразвуков клетъчен разрушител UP200St с микронатоп S26d2 за лизис и екстракция на протеин
Ултразвукова лизис под Контрол на температурата на прескочите
Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури инициират термично индуцирано разграждане на протеина в пробите.
Както всички техники за механично приготвяне на проба, ултразвукът създава топлина. Въпреки това, температурата на пробите може да бъде добре контролирана, когато се използва VialTweeter. Представяме ви различни опции за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте с VialTweeter и VialPress за анализ.
- Мониторинг на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и термокана за включване. Включете температурния датчик в UP200St и поставете върха на температурния сензор в една от епруветките за проби. Чрез цифров цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St определен температурен диапазон за вашата проба ултразвук. Ултразвукът автоматично ще спре, когато се достигне максималната температура и се спира, докато температурата на пробата достигне до по-ниската стойност на зададената температура ∆. Тогава ултразвукът започва автоматично отново. Тази интелигентна функция предотвратява предизвиканото от топлината разграждане.
- Блокът VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блок VialTweeter (само сонотрода без преобразувател!) в хладилника или фризера предварително охлаждане на титанов блок помага да се отложи повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба може да бъде предварително охладена.
- Използвайте сух лед, за да се охлади по време на ултразвук. Използвайте плитка поднос, пълна със сух лед, и поставете VialTweeter на леда, така че топлината бързо да може да се разсее.
Клиентите по целия свят използват VialTweeter и VialPress за ежедневната си подготовка на пробите в биологични, биохимични, медицински и клинични лаборатории. Интелигентният софтуер и контрол на температурата на процесора UP200St, температурата се контролира надеждно и се избягва разпадване на топлината. Ултразвукова подготовка на пробата с VialTweeter и VialPress осигурява високо надеждни и възпроизводими резултати!
Намерете оптималния ултразвуков разрушител за вашето приложение Lysis
Hielscher Ultrasonics е дългогодишен опитен производител на високопроизводителни ултразвукови разрушители и хомогенизатори за лаборатории, пейка-отгоре и промишлени мащаб системи. Вашият размер на бактериалната клетъчна култура, вашата цел за изследване или производство и обемът на клетката за обработка на час или ден са основни фактори за намиране на правилния ултразвуков клетъчен разрушител за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременното ултразвуково използване на мулти-проби (до 10 флакона с VialTweeter) и масови проби (т.е., микротистерни плочи / ELISA плочи с UIP400MTP), както и класическия тип сонда лаборатория ultrasonicator с различни нива на мощност от 50 до 400 вата за напълно промишлени ултразвукови процесори с до 16,000 вата на единица за смущения в търговските клетки и екстракция на протеин в голямо производство. Всички Hielscher ultrasonicators са построени за 24 / 7 / 365 работа при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично протоколиране на данни, което прави ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лабораторни и производствени съоръжения.
Нека знаем, какви клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате биологичните проби. Ние ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков клетъчен разрушител за вашите изисквания за процеса.
Таблицата по-долу ви дава индикация за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи от компактни ръчни хомогенизатори и MultiSample Ultrasonicators до промишлени ултразвукови процесори за търговски приложения:
| Партида том | Дебит | Препоръчителни Devices |
|---|---|---|
| 96-ямнекови / микротвърди плочи | п.а. | 1000000000000000000000 |
| 10 флакона à 0,5 до 1,5ml | п.а. | VialTweeter в UP200St |
| 0от 01 до 250mL | от 5 до 100ml/min | UP50H |
| 0от 0.01 до 500mL | 10 до 200 ml / мин | UP100H |
| 10 до 2000mL | 20 до 400 ml / мин | Uf200 ः т, UP400St |
| 00,1 до 20L | 00,2 до 4 л / мин | UIP2000hdT |
| 10 до 100L | 2 до 10 л / мин | UIP4000hdT |
| п.а. | 10 до 100 L / мин | UIP16000 |
| п.а. | по-голям | струпване на UIP16000 |
Свържете се с нас! / Попитай ни!
UIP400MTP плоча соникатор за разрушаване на клетки с висока производителност в плочи с 96 гнезда
ултрасоникатор Uf200 ः т с 2mm микротип S26d2 за ултразвук на малки проби
Прочетете повече за това как можете да използвате вашия ултразвуков хомогенизатор на тъкани за ефективно и надеждно приготвяне на буферни разтвори!
Факти заслужава да се знае
Бактериите Ешерихия Коли
Escherichia coli е вид бактерии, който е не-образуване на спори, Грам-отрицателни и се характеризира с формата на прав прът. E.coli бактерии присъстват в околната среда, храни, и червата на хора и животни. E. coli обикновено е мотил с помощта на перитрични флагела, но има и немобилни видове, също. E.coli са така наречените факултативно анаеробни chemoorganotroph организми, което означава, че те са способни както на респираторен, така и ферментативен метаболизъм. Повечето видове E.coli са доброкачествени и изпълняват полезни функции в организма, например потискане на растежа на вредни бактериални видове, синтезиране на витамини и др.
Бактериалната клетка на Escherichia coli от така наречения тип В е специална категория щамове на E.coli, които се използват широко в изследванията за изследване на механизми като чувствителност на бактериофаг или системи за промяна на ограниченията. Освен това, бактериите на E.coli се оценяват като надеждни работни кон за протеинов експресион в биотехнологии и лаборатории за науки за живота. Например, E.coli се използват за синтезиране съединения като протеини и олигозахариди в промишлен мащаб. Поради специфични характеристики като протеазния дефицит, ниското производство на ацетат при високо ниво на глюкоза и повишена пропускливост, E. coli B клетки са той най-често използваните клетки гостоприемници за производството на генетично инженерни протеини.
Рекомбинантен протеин
Рекомбинантните протеини (rProt) придобиват голямо значение в многобройните отрасли, включително в химическата промишленост, фармацевтичната, козметичната, човешката и животинската медицина, селското стопанство, храните, както и в преработката на отпадъци.
Производството на рекомбинантен протеин изисква използването на система за изразяване. Като експресиващо клетъчни системи за производство на рекомбинантна ДНК, могат да се използват прокариотни и еукариотни клетки. Въпреки че бактериалните клетки са най-широко използвани за протеиновото изразяване поради фактори като ниска цена, лесна мащабируемост и прости медийни условия, се създават алтернативи на бозайници, дрожди, водорасли, насекоми и клетъчни системи. Типът протеин, функционалната активност, както и необходимият добив на изразен протеин влияят върху избора на клетъчната система, използвана за изразяване на протеин.
За да се изрази рекомбинантен протеин, дадена клетка трябва да бъде трансфекцинирана с ДНК вектор, съдържащ образеца на рекомбинантна ДНК. След това се култивират клетките, които се преразкачен с шаблона. Вследствие на клетъчния механизъм клетките преписват и превеждат протеина на интереси, като по този начин произвеждат целевия протеин.
Тъй като изразените протеини са заклет в клетъчната матрица, клетката трябва да бъде лизирана (разхлабена и счупена), за да се освободят протеините. В последващ етап на пречистване протеинът се отделя и пречистен.
Първият рекомбинантен протеин, използван при лечението, е рекомбинантен човешки инсулин през 1982 г. Днес повече от 170 вида рекомбинантен протеин се произвеждат в световен мащаб за медицинско лечение. Често използваните рекомбинантни протеини, използвани в медицината, са например рекомбинантни интерлевкини, растежни фактори, тумор некрозис фактори, фактори на кръвосъсирването, тромболитични лекарства, и ензими за лечение на основни заболявания като диабет, dwarfism, миокарден инфаркт, застойна сърдечна недостатъчност, церебрална апоплексия, множествена склероза, неутропения, тромбоцитопения, анемия, хепатит, ревматоиден артрит, астма, болест на Крон, и рак на терапии. (с.Фук В. Pham, в Omics Technologies и био-инженерство, 2018)
Литература / Препратки
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter соникатор за едновременна обработка с ултразвук на 10 проби, например за разрушаване на BL21 клетки
Високоефективни ултразвук! Продуктовата гама на Hielscher покрива пълния спектър от компактния лабораторен ултразвуков ултразвук над пейка-топ единици до пълно-промишлени ултразвукови системи.