Лизис на клетки BL21 чрез ултразвукова обработка

Клетките BL21 са щам на E. coli, който се използва широко в изследователски лаборатории, биотехнологиите и промишленото производство поради способността им да експресират протеини с висока ефективност. Ултразвуковото разрушаване на клетките, лизисът и извличането на протеини са обичайният метод за изолиране и събиране на целевите протеини от вътрешността на клетките BL21. Ултразвуковата обработка разрушава клетката напълно и освобождава всички задържани в нея протеини, като прави 100% от протеина достъпен.

Клетки BL21 за експресия на протеини

BL21 е химически компетентен бактериален щам на E. coli, подходящ за трансформация и експресия на протеини на високо ниво чрез система за индукция T7 РНК полимераза–IPTG. Клетките BL21 позволяват високоефективна експресия на протеини от всеки ген, който е под контрола на T7 промотор. Щамът на E. coli BL21(DE3) е щам за производство на протеини, базиран на T7 РНК полимераза, който се комбинира с експресионни вектори, базирани на T7 промотор, и се използва широко в лабораториите и промишлеността за производство на рекомбинантни протеини. В BL21(DE3) експресията на гена, кодиращ рекомбинантния протеин, се транскрибира от хромозомно кодираната T7 РНК полимераза (T7 RNAP), която транскрибира осем пъти по-бързо от конвенционалната RNAP на E. coli. Това прави щама BL21(DE3) високоефективен и го превръща в една от най-предпочитаните клетъчни системи за експресия на протеини.

Протокол за ултразвуков лизис и извличане на протеини от клетки BL21

Лизисът на клетки BL21 се извършва предимно чрез ултразвукова обработка в комбинация с натриев лауроилсаркозинат (известен също като саркозил) като лизисен буфер. Предимствата на ултразвуковото разрушаване на клетките и извличане на протеини се състоят в надеждността, възпроизводимостта, както и в простата, безопасна и бърза работа с ултразвуковите апарати. Протоколът по-долу дава указания стъпка по стъпка за ултразвуков лизис на клетки BL21:

• За отстраняване на шаперонните протеини бактериалните пелети BL21 бяха ресуспендирани в 50 ml ледено студен буфер Sodium Tris-EDTA (STE) (състоящ се от 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl с добавени 100 mM PMSF).
• След това се добавят 500 ul лизозим (10 mg/ ml) и клетките се инкубират върху лед за 15 min.
• След това се добавят 500 ul DTT и 7 ml саркозил (10% (w/v), приготвен в STE буфер).
• От съществено значение е всички буфери за пречистване да се поддържат ледено студени, а пробите да се държат върху лед през цялото време. Всички етапи на пречистване трябва да се извършват в хладилна стая, ако е възможно.



• За ултразвуков лизис и извличане на протеини пробите се обработват с ултразвук в ултразвуковия апарат за множество проби VialTweeter за 4 x 30 sec при 100% амплитуда с интервал от 2 min между отделните ултразвукови обработки. Като алтернатива може да се използва ултразвуков хомогенизатор със сонда и микронакрайник, например UP200Ht със S26d2 (3 x 30 sec, пауза от 2 min. между ултразвуковите цикли, 80% амплитуда).
• За следващите етапи на пречистване пробите трябва да се държат върху лед или, като алтернатива, да се съхраняват при -80°C до по-нататъшната обработка.

Ултразвуков лизис с прецизен контрол на температурата

Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури предизвикват термично разграждане на протеините в пробите.
Както всички механични техники за подготовка на проби, ултразвуковата обработка генерира топлина. Въпреки това температурата на пробите може да се контролира добре при използване на VialTweeter. Представяме ви различни възможности за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте за анализ с VialTweeter и VialPress.

1. Наблюдение на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и температурен сензор с възможност за включване. Свържете температурния сензор към UP200St и поставете върха му в една от епруветките с проби. Чрез цифровия цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St конкретен температурен диапазон за ултразвуковата обработка на вашата проба. Ултразвуковият апарат ще спре автоматично при достигане на максималната температура и ще остане в пауза, докато температурата на пробата спадне до долната стойност на зададената температура ∆. След това ултразвуковата обработка започва отново автоматично. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, предизвикано от топлина.
2. Блокът VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блока VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилник или фризер, за да охладите предварително титановия блок и да забавите повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да бъде предварително охладена.
3. Използвайте сух лед за охлаждане по време на ултразвуковата обработка. Използвайте плитка тава, напълнена със сух лед, и поставете VialTweeter върху леда, така че топлината да може бързо да се отвежда.

Клиенти по целия свят използват VialTweeter и VialPress за ежедневната си работа по подготовка на проби в биологични, биохимични, медицински и клинични лаборатории. Благодарение на интелигентния софтуер и контрола на температурата на процесора UP200St температурата се контролира надеждно и се избягва разграждането на пробите, предизвикано от топлина. Ултразвуковата подготовка на проби с VialTweeter и VialPress осигурява високонадеждни и възпроизводими резултати!
 

Намерете оптималния ултразвуков апарат за разрушаване на клетки за вашето приложение за лизис

Hielscher Ultrasonics е производител с дългогодишен опит в областта на високопроизводителните ултразвукови апарати за разрушаване на клетки и хомогенизатори за лаборатории, настолни системи и системи с промишлен мащаб. Размерът на вашата бактериална клетъчна култура, вашата изследователска или производствена цел и обемът клетки за обработка на час или ден са съществени фактори за намиране на подходящия ултразвуков апарат за разрушаване на клетки за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременна ултразвукова обработка на множество проби (до 10 флакона с VialTweeter) и голям брой проби (т.е. микротитърни плаки / ELISA плаки с UIP400MTP), както и класическия лабораторен ултразвуков апарат със сонда с различни нива на мощност от 50 до 400 вата до изцяло промишлени ултразвукови процесори с до 16 000 вата на устройство за разрушаване на клетки и извличане на протеини в голямо производство за търговски цели. Всички ултразвукови апарати Hielscher са конструирани за работа 24/7/365 при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично регистриране на данни, които превръщат ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лабораториите и производствените съоръжения.
Уведомете ни какъв вид клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате вашите биологични проби. Ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков апарат за разрушаване на клетки според изискванията на вашия процес.

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови системи – от компактни ръчни хомогенизатори и ултразвукови апарати за множество проби до промишлени ултразвукови процесори за търговски приложения:

Литература / Източници

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.