Клетъчен лизис на BL21 клетки чрез ултразвук
BL21 клетките са щам на E. coli, който се използва широко в изследователски лаборатории, биотехнологии и промишлено производство поради способността им да експресират протеини с висока ефективност. Ултразвуковото разрушаване на клетките, лизисът и екстракцията на протеини е често срещаният метод за изолиране и събиране на целевите протеини от клетъчната вътрешност на BL21 клетките. Ултразвукът разрушава клетката напълно и освобождава всички уловени протеини, което прави 100% от протеина достъпен.
BL21 клетки за експресия на протеини
BL21 клетката е химически компетентен бактериален щам на E. coli, подходящ за трансформация и високо ниво на протеинова експресия с помощта на индукционна система T7 RNA полимераза-IPTG. BL21 клетките позволяват високоефективна протеинова експресия на всеки ген, който е под контрола на Т7 промотор. Щамът на E. coli BL21 (DE3) е щам за производство на протеини на базата на Т7 РНК полимераза, комбиниран с вектори на експресия, базирани на промотор на Т7 и се прилага широко в лабораториите и индустрията за производство на рекомбинантни протеини. В BL21(DE3) експресията на гена, кодиращ рекомбинантния протеин, се транскрибира от хромозомно кодираната Т7 РНК полимераза (T7 RNAP), която се транскрибира осем пъти по-бързо от конвенционалната E. coli RNAP. Това прави щама BL21(DE3) високоефективен и го превръща в една от най-предпочитаните клетъчни системи за експресия на протеини.
Протокол за ултразвуков лизис и екстракция на протеини от BL21 клетки
Клетъчният лизис на BL21 клетки се извършва най-вече с помощта на ултразвук в комбинация с натриев лауроил саркозинат (известен също като саркозил) като лизис буфер. Предимствата на ултразвуковото клетъчно разрушаване и екстракцията на протеини се крият в надеждността, възпроизводимостта, както и лесната, безопасна и бърза работа на ултразвукоразточните. Протоколът по-долу дава стъпка по стъпка насока за ултразвуков BL21 клетъчен лизис:
- За да се отстранят шапероновите протеини, бактериалните пелети BL21 са ресуспендирани в 50 ml ледено студен натриев трис-EDTA (STE) буфер (състоящ се от 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, допълнени със 100 mM PMSF).
- Добавят се 500 ul лизозим (10 mg/ml) и клетките се инкубират върху лед за 15 минути.
- След това се добавят 500 ul DTT и 7 ml саркозил (10% (w/v), съставени в STE буфер).
- От съществено значение е всички буфери за пречистване да се поддържат ледено студени и пробите да се поддържат на лед през цялото време. Всички стъпки за пречистване трябва да се извършват в хладилното помещение, ако е възможно.
- За ултразвуков лизис и екстракция на протеини, пробите се ултразвукират в Ултразвуков ултразвук VialTweeter MultiSample за 4 x 30 сек при 100% амплитуда с интервал от 2 минути между всяко ултразвук. Алтернативно, ултразвуков хомогенизатор тип сонда с микронакрайник, напр. UP200Ht с S26d2 (3 x 30 сек, 2 мин. пауза между ултразвуковите цикли, 80% амплитуда).
- За по-нататъшни етапи на пречистване пробите трябва да се съхраняват върху лед или алтернативно да се съхраняват при -80°C до по-нататъшна обработка.
Ултразвуков клетъчен разрушител UP200St с микронакрайник S26d2 за лизис и екстракция на протеини
Ултразвуков лизис под контрол на температурата
Прецизният и надежден контрол на температурата е от решаващо значение при работа с биологични проби. Високите температури инициират термично индуцирано разграждане на протеини в пробите.
Както всички механични техники за подготовка на проби, ултразвукът създава топлина. Температурата на пробите обаче може да се контролира добре, когато използвате VialTweeter. Представяме ви различни опции за наблюдение и контрол на температурата на вашите проби, докато ги подготвяте с VialTweeter и VialPress за анализ.
- Следене на температурата на пробата: Ултразвуковият процесор UP200St, който задвижва VialTweeter, е оборудван с интелигентен софтуер и сензор за температура, който може да се включи. Включете температурния сензор в UP200St и поставете върха на температурния сензор в една от епруветките за проби. Чрез цифров цветен сензорен дисплей можете да зададете в менюто на UP200St специфичен температурен диапазон за ултразвука на вашата проба. Ултразвуковият уред автоматично ще спре при достигане на максималната температура и ще направи пауза, докато температурата на пробата спадне до по-ниската стойност на зададената температурна ∆. След това ултразвукът започва автоматично отново. Тази интелигентна функция предотвратява разграждането, предизвикано от топлина.
- Блокът VialTweeter може да бъде предварително охладен. Поставете блока VialTweeter (само сонотрода без преобразувателя!) в хладилника или фризера, за да охладите предварително титаниевия блок помага за отлагане на повишаването на температурата в пробата. Ако е възможно, самата проба също може да бъде предварително охладена.
- Използвайте сух лед за охлаждане по време на ултразвук. Използвайте плитка тава, пълна със сух лед, и поставете флакона за високи честоти върху леда, така че топлината да може бързо да се разсее.
Клиентите по целия свят използват VialTweeter и VialPress за ежедневната си работа по подготовка на проби в биологични, биохимични, медицински и клинични лаборатории. Интелигентният софтуер и контролът на температурата на процесора UP200St, температурата се контролира надеждно и се избягва разграждането на пробата, предизвикано от топлина. Ултразвуковата подготовка на проби с VialTweeter и VialPress осигурява изключително надеждни и възпроизводими резултати!
Намерете оптималния ултразвуков разрушител за вашето приложение за лизис
Hielscher Ultrasonics е дългогодишен производител на високоефективни ултразвукови клетъчни разрушители и хомогенизатори за лаборатории, настолни и индустриални системи. Размерът на вашата бактериална клетъчна култура, вашата изследователска или производствена цел и обемът на клетката за обработка на час или ден са основни фактори за намиране на правилния ултразвуков клетъчен разрушител за вашето приложение.
Hielscher Ultrasonics предлага различни решения за едновременно ултразвуково обеззвукване на множество проби (до 10 флакона с VialTweeter) и масови проби (т.е. микротитърни плаки / ELISA плаки с UIP400MTP), както и класическия лабораторен ултразвуков ултразвуков ултразвук тип сонда с различни нива на мощност от 50 до 400 вата до напълно индустриални ултразвукови процесори с до 16 000 вата на единица за търговско разрушаване на клетките и екстракция на протеини в големи производства. Всички ултразвукови апарати Hielscher са създадени за работа 24/7/365 при пълно натоварване. Здравината и надеждността са основни характеристики на нашите ултразвукови устройства.
Всички цифрови ултразвукови хомогенизатори са оборудвани с интелигентен софтуер, цветен сензорен дисплей и автоматично протоколиране на данни, които превръщат ултразвуковото устройство в удобен работен инструмент в лабораторни и производствени помещения.
Кажете ни какви клетки, какъв обем, с каква честота и с каква цел трябва да обработвате биологичните си проби. Ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков разрушител на клетки за вашите изисквания на процеса.
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови системи от компактни ръчни хомогенизатори и ултразвукови ултразвукови процесори MultiSample до индустриални ултразвукови процесори за търговски приложения:
| Обем на партидата | Дебит | Препоръчителни устройства |
|---|---|---|
| 96-ямкови / микротитърни плаки | Н.А. | UIP400MTP |
| 10 флакона à 0,5 до 1,5 ml | Н.А. | VialTweeter на UP200St |
| 0.01 до 250 мл | 5 до 100 мл/мин | UP50H |
| 0.01 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | UP100H |
| 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 до 20L | 0.2 до 4 л/мин | UIP2000hdT |
| 10 до 100L | 2 до 10 л/мин | UIP4000hdT |
| Н.А. | 10 до 100 л/мин | UIP16000 |
| Н.А. | Голям | Клъстер от UIP16000 |
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
UIP400MTP плоча sonicator за разрушаване на клетки с висока производителност в 96-ямкови пластини
ултразвук UP200Ht с 2 мм микронакрайник S26d2 за ултразвук на малки проби
Прочетете повече за това как можете да използвате вашия ултразвуков хомогенизатор за тъкани за ефективно и надеждно приготвяне на буферни разтвори!
Факти, които си струва да знаете
Бактерии Escherichia Coli
Escherichia coli е бактериален тип, който не образува спори, грам-отрицателен и се характеризира с формата си на права пръчка. Бактериите E.coli присъстват в околната среда, храните и червата на хората и животните. E. coli обикновено е подвижна чрез използване на перитрихозни флагели, но има и неподвижни видове. E.coli са така наречените факултативно анаеробни хемоорганотрофни организми, което означава, че са способни както на дихателен, така и на ферментативен метаболизъм. Повечето видове E.coli са доброкачествени и изпълняват полезни функции в организма, например потискат растежа на вредни бактериални видове, синтезират витамини и др.
Бактериалните клетки на Escherichia coli от така наречения тип В са специална категория щамове на E.coli, които се използват широко в изследванията за изследване на механизми като чувствителност към бактериофаги или системи за рестрикция-модификация. Освен това бактериите E.coli са ценени като надежден работен кон за експресия на протеини в лабораториите за биотехнологии и науки за живота. Например, E.coli се използват за синтез на съединения като протеини и олигозахариди в промишлен мащаб. Поради специфични характеристики като дефицит на протеаза, ниско производство на ацетат при високо ниво на глюкоза и повишена пропускливост, В-клетките на E. coli са най-често използваните клетки гостоприемници за производството на генетично модифицирани протеини.
Рекомбинантен протеин
Рекомбинантните протеини (rProt) придобиват значително значение в различни отрасли, включително в химическото производство, фармацевтичната, козметичната, хуманната и животинската медицина, селското стопанство, хранително-вкусовата промишленост и промишлеността за третиране на отпадъци.
Производството на рекомбинантен протеин изисква използването на експресионна система. Като експресиращи клетъчни системи за производство на рекомбинантна ДНК могат да се използват както прокариотни, така и еукариотни клетки. Докато бактериалните клетки са най-широко използвани за експресия на протеини поради фактори като ниска цена, лесна мащабируемост и прости условия на средата, бозайниците, дрождите, водораслите, насекомите и безклетъчните системи са утвърдени алтернативи. Типът на протеина, функционалната активност, както и необходимият добив на експресиран протеин влияят върху избора на клетъчната система, използвана за експресия на протеини.
За да се експресира рекомбинантен протеин, определена клетка трябва да бъде трансфектирана с ДНК вектор, съдържащ шаблона на рекомбинантна ДНК. След това клетките, трансфектирани с шаблона, се култивират. Като следствие от клетъчния механизъм, клетките транскрибират и превеждат протеина, който представлява интерес, като по този начин произвеждат целевия протеин.
Тъй като експресираните протеини са уловени в клетъчния матрикс, клетката трябва да бъде лизирана (разрушена и разбита), за да се освободи протеините. В последваща стъпка на пречистване протеинът се отделя и пречиства.
Първият рекомбинантен протеин, използван в лечението, е рекомбинантен човешки инсулин през 1982 г. Днес в световен мащаб се произвеждат повече от 170 вида рекомбинантен протеин за медицинско лечение. Често използваните рекомбинантни протеини, използвани в медицината, са например рекомбинантни хормони, интерферони, интерлевкини, растежни фактори, фактори на туморна некроза, фактори на кръвосъсирване, тромболитични лекарства и ензими за лечение на основни заболявания като диабет, джудже, инфаркт на миокарда, застойна сърдечна недостатъчност, церебрална апоплексия, множествена склероза, неутропения, тромбоцитопения, анемия, хепатит, ревматоиден артрит, астма, болест на Крон и терапии за рак. (срв. Фук В. Фам, в Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Литература / Препратки
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Ултразвуков уред VialTweeter за едновременно ултразвукоизвличане на 10 проби, например за разрушаване на BL21 клетки
Високоефективна ултразвук! Продуктовата гама на Hielscher обхваща пълния спектър от компактен лабораторен ултразвуков апарат до настолни ултразвукови системи до напълно индустриални ултразвукови системи.