Протокол за инактивиране на коронавирус SARS-CoV-2 със звук

Hielscher VialTweeter е уникален ултразвуков модул за подготовка на няколко проби, който се използва за инактивиране на коронавируса SARS-COV-2. VialTweeter позволява да се приготвят до 10 флакона за проби едновременно и по този начин е идеалната единица за масова обработка на проби.

Инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 с VialTweeter

След отстраняване на фиксатора, монослоевете се промиват три пъти с фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS), преди да се изстъргват клетките в 1 ml MEM/5% FBS и се озвучават (3 × 10 секунди включени, 10 секунди изключени при 100% мощност и амплитуда) с помощта на ултразвуковия процесор Hielscher UP200St с VialTweeter привързаност. Супернатантите се избистрят чрез центрофугиране при 3000 × g за 10 минути. 

Прочетете пълния протокол тук за инактивирането на коронавируса SARS-CoV-2 от Welch et al. (2020) по-долу:

Клетки и вируси

Vero E6 клетки (Vero C1008; ATCC CRL-1586) са култивирани в модифицирана минимална основна среда (MEM) на Eagle, допълнена с 10% (v/v) фетален телешки серум (FCS). Използваният вирус е щам на SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, изолиран от PHE от първия пациентски клъстер в Обединеното кралство на 29.01.2020 г. Този вирус е получен при проход 1 и се използва за инактивиращи изследвания при проход 2 или 3.
За реактиви и химикали, използвани за инактивиране на SARS-CoV-2, както и за отстраняване на цитотоксичността на реагента, моля, вижте научния доклад на Welch et al. (2020).

Инактивиране на вируси чрез почистващи препарати – Протокол за инактивиране на коронавирус на SARS-CoV-2 от Welch et al. 2020 г.

Инактивиране на SARS-CoV-2

За търговски продукти, вирусни препарати (течност за тъканни култури, титри от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ PFU/ml) се третират в три екземпляра с реактиви в концентрации и за време на контакт, препоръчани в инструкциите за употреба на производителя, когато има такива, или за концентрации и времена, специално поискани от лабораториите за изпитване. Когато производителят е посочил диапазон от концентрации, се изпитва най-ниското съотношение между продукта и пробата (т.е. най-ниската препоръчителна концентрация на изпитвания продукт). Реагентите за транспортиране на пробите се изпитват, като се използва съотношение един обем течност за тъканна култура към десет обема реагент, освен ако производителят не е посочил обемно съотношение на течността на пробата към реагента. Детергентите, фиксаторите и разтворителите са тествани в посочените концентрации за посочените времена. Всички стъпки на инактивиране са извършени при стайна температура на околната среда (18 – 25°C). За тестване на алтернативни типове проби вирусът се вкарва в посочената матрица на пробата в съотношение 1:9, след което се третира с тестови реагенти, както е посочено по-горе. Всички експерименти включват трикомпонентни контролни проби с еквивалентен обем PBS вместо тестовия реагент. Веднага след необходимото време за контакт, 1 ml третирана проба е обработена с помощта на подходящо подбраната филтрираща матрица. Отстраняването на реагента за изпитване за инактивиране се извършва в по-голям формат на въртяща се колона с помощта на Pierce 4mL Detergent Removal Spin Column (Thermo Fisher) или чрез пълнене на празни центрофужни колони Pierce с капацитет 10 ml (Thermo Fisher) с SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR или Sephadex LH-20, за да се получат 4 ml опаковани мъниста/смола. За пречистване с помощта на филтри Amicon, 2 × проби от 500 μl се пречистват с помощта на два центробежни филтъра по описания по-горе метод, след което се обединяват заедно. За формалдехид и формалдехид с отстраняване на глутаралдехид е използван един филтър с обем на пробата от 1× 500 μl, ресуспендиран след обработка в 500 μl PBS и добавен към 400 ul MEM/5% FBS. За инактивиране на заразени монослоеве, 12,5 см² колби от клетки Vero E6 (2,5 × 10⁶ клетки/колба в 2,5 ml MEM/5% FBS) са заразени при MOI 0,001 и са инкубирани при 37°C/5% CO₂ за 24 часа. Супернатантът се отстранява и клетките се фиксират с помощта на 5 ml формалдехид или формалдехид и глутаралдехид при стайна температура за 15 или 60 минути. Фиксаторът беше отстранен и монослоевете бяха измити три пъти с PBS, преди да се изстържат клетките в 1 ml MEM/5% FBS и да се озвучават (3 × 10 секунди включени, 10 секунди изключени при 100% мощност и амплитуда) с помощта на UP200St с приставка VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатантите се избистрят чрез центрофугиране при 3000 × g за 10 минути.

Подробности за реагента, използван за инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 с ултразвуковия VialTweeter съгласно протокола на Welch et al. 2020

Пълният протокол, включително използването на високоговорителя за високи честоти на Hielscher, можете да намерите тук:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Усъвършенствани ултразвукови дисмембранори и клетъчни разрушители

Ултразвуковият ултразвуков апарат VialTweeter е само едно от многото ултразвукови решения за подготовка на проби в биологични, биохимични и клинични лаборатории. Hielscher Ultrasonics предлага идеалния ултразвуков дисмембранор за вашето приложение, например клетъчен лизис, клетъчна екстракция, хомогенизиране на тъкани, разтваряне на лизат, разтваряне, дегазиране на проби и др.
Уведомете ни колко проби трябва да обработвате на час и ден, дали предпочитате директна или индиректна ултразвукова обработка и каква е целта на ултразвуковата обработка на проби. Ще ви препоръчаме най-подходящия ултразвуков апарат за ежедневната ви работа!
Цифровите ултразвукови процесори на Hielscher Ultrasonics са оборудвани с интелигентен софтуер, автоматичен запис на данни, лесни опции за предварителна настройка за контрол на температурата, продължителност на ултразвука, цикъл/импулсен режим, както и осветление на пробите и дистанционно управление на браузъра. Стремим се да направим нашите ултразвукови устройства възможно най-интелигентни, така че вашите изследвания и работа да станат възможно най-удобни и успешни.
Щракнете тук, за да намерите още приложения, включително протоколи за ултразвукова подготовка на проби с VialTweeter!