Протокол за инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 чрез ултразвукова обработка

Hielscher VialTweeter е уникално ултразвуково устройство за подготовка на множество проби, което се използва за инактивиране на коронавируса SARS-COV-2. VialTweeter позволява едновременна подготовка на до 10 флакона с проби и поради това е идеалното устройство за масова обработка на проби.

Инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 с VialTweeter

След отстраняване на фиксатора монослоевете бяха промити три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), след което клетките бяха отделени чрез остъргване в 1mL MEM/5% FBS и подложени на ултразвукова обработка (3 × 10 секунди включване, 10 секунди изключване при 100% мощност и амплитуда) с ултразвуковия процесор на Hielscher UP200St с VialTweeter като приставка. Супернатантите бяха избистрени чрез центрофугиране при 3000 × g за 10 минути. Прочетете по-долу пълния протокол за инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 на Welch et al. (2020):

Клетки и вирус

Клетки Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) бяха култивирани в модифицирана минимална есенциална среда на Eagle (MEM), допълнена с 10% (v/v) фетален телешки серум (FCS). Използваният вирус беше щамът SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, изолиран от PHE от първата група свързани случаи на пациенти в Обединеното кралство на 29/01/2020. Този вирус беше получен при пасаж 1 и използван за изследвания на инактивирането при пасаж 2 или 3.
За реагентите и химикалите, използвани за инактивиране на SARS-CoV-2, както и за отстраняването на цитотоксичността на реагентите, вижте научния доклад на Welch et al. (2020).

Инактивиране на вируса чрез детергенти – протокол за инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 на Welch et al. 2020

Инактивиране на SARS-CoV-2


За търговските продукти вирусните препарати (течност от тъканна култура, с титри в диапазона от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ PFU/ml) бяха третирани в три повторения с реагенти при концентрации и времена на контакт, препоръчани в инструкциите за употреба на производителя, когато такива бяха налични, или при концентрации и времена, изрично заявени от изпитващите лаборатории. Когато производителят посочваше диапазон от концентрации, беше изпитвано най-ниското съотношение на продукта към пробата (т.е. най-ниската препоръчана концентрация на изпитвания продукт). Реагентите в епруветките за транспортиране на проби бяха изпитвани при съотношение един обем течност от тъканна култура към десет обема реагент, освен ако производителят не беше посочил обемно съотношение на течността на пробата към реагента. Детергентите, фиксаторите и разтворителите бяха изпитвани при посочените концентрации за посочените времена. Всички етапи на инактивиране бяха извършени при стайна температура (18 – 25°C). За изпитване на алтернативни видове проби вирусът беше добавен към посочената матрица на пробата в съотношение 1:9, след което пробите бяха третирани с изпитваните реагенти, както е описано по-горе. Всички експерименти включваха контролни проби в три повторения, подложени на симулирано третиране с еквивалентен обем PBS вместо изпитвания реагент. Непосредствено след изтичане на необходимото време на контакт 1mL от третираната проба беше обработен с подходящо избраната филтрационна матрица. Отстраняването на реагентите за изпитване на инактивирането беше извършено в по-голям формат на центрофужна колона с помощта на Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) или чрез запълване на празни центрофужни колони Pierce с вместимост 10mL (Thermo Fisher) със SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR или Sephadex LH-20 до получаване на 4mL уплътнени микросфери/смола. За пречистване с филтри Amicon проби с обем 2 × 500μl бяха пречистени с два центрофужни филтъра по описания по-рано метод, след което бяха обединени. За отстраняване на формалдехид и на формалдехид с глутаралдехид беше използван един филтър с обем на пробата 1× 500μl, като след обработката пробата беше ресуспендирана в 500μl PBS и добавена към 400ul MEM/5% FBS. За инактивиране на инфектирани монослоеве колби с площ 12,5 cm² с клетки Vero E6 (2,5 × 10⁶ клетки/колба в 2,5mL MEM/5% FBS) бяха инфектирани при MOI 0,001 и инкубирани при 37°C/5% CO₂ за 24 часа. Супернатантът беше отстранен, а клетките бяха фиксирани с 5mL формалдехид или формалдехид и глутаралдехид при стайна температура за 15 или 60 минути. Фиксаторът беше отстранен и монослоевете бяха промити три пъти с PBS, след което клетките бяха отделени чрез остъргване в 1mL MEM/5% FBS и подложени на ултразвукова обработка (3 × 10 секунди включване, 10 секунди изключване при 100% мощност и амплитуда) с UP200St с приставка VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатантите бяха избистрени чрез центрофугиране при 3000 × g за 10 минути.


Подробности за реагента, използван за инактивиране на коронавируса SARS-CoV-2 с ултразвуковия VialTweeter съгласно протокола на Welch et al. 2020

Пълният протокол, включително използването на Hielscher VialTweeter, можете да намерите тук:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Усъвършенствани ултразвукови дезинтегратори и устройства за разрушаване на клетките

Ултразвуковото устройство VialTweeter за обработка на множество проби е само едно от многото ултразвукови решения за подготовка на проби в биологични, биохимични и клинични лаборатории. Hielscher Ultrasonics предлага идеалния ултразвуков дезинтегратор за вашето приложение, например клетъчен лизис, клетъчна екстракция, хомогенизиране на тъкани, солюбилизиране на лизат, разтваряне, дегазиране на проби и др.
Уведомете ни колко проби трябва да обработвате на час и на ден, дали предпочитате директна или индиректна ултразвукова обработка и каква е целта на ултразвуковата обработка на пробите. Ще ви препоръчаме най-подходящото ултразвуково устройство за ежедневната ви работа!
Цифровите ултразвукови процесори на Hielscher Ultrasonics са оборудвани с интелигентен софтуер, автоматично записване на данни, лесни възможности за предварително задаване на настройки за контрол на температурата, продължителност на ултразвуковата обработка, цикличен/импулсен режим, както и осветяване на пробите и дистанционно управление чрез браузър. Стремим се да направим нашите ултразвукови устройства възможно най-интелигентни, така че вашите изследвания и ежедневна работа да бъдат възможно най-удобни и успешни.
Щракнете тук, за да намерите още приложения, включително протоколи за ултразвукова подготовка на проби с VialTweeter!