Протокол за инактивиране с ултразвук SARS-CoV-2

Hielscher VialTweeter е уникална ултразвукова мулти-проба единица за подготовка, която се използва за инактивиране на коронавируса SARS-COV-2. VialTweeter позволява да се подготвят до 10 флакона за проби едновременно и по този начин е идеална единица за обработка на масова проба.

Инактивиране на SARS-CoV-2 корнавира с

След отстраняване на фиксатив, монослойните се измиват три пъти с физиологичен разтвор с фосфатен буфер (PBS) преди изстъргването на клетките в 1 mL MEM / 5% FBS и се шлайфат с ултразвук (3 × 10 секунди, 10 секунди off при 100% мощност и амплитуда) с помощта на ултразвуковия процесор Hielscher UP200St с ФлаконТуитер Закрепване. Супернатантите се избистрят чрез центрофугиране при 3000 × g в продължение на 10 минути. 

Прочетете пълния протокол тук за инактивирането на КОРОНАВИРУСа на SARS-CoV-2 от Welch et al. (2020) по-долу:

Клетки и вируси

Vero E6 клетки (Vero C1008; ATCC CRL- 1586) са култивирани в модифициран Орел минималната основна среда (MEM) допълнени с 10% (v / v) серум на прасеца на плода (FCS). Използваният вирус е SARS-CoV-2 щам hCOV-19/England/2/2020, изолиран от PHE от първия пациентски клъстер във Великобритания на 29/01/2020. Този вирус е получен в преминаване 1 и се използва за проучвания на инактивацията при пасаж 2 или 3.
За реактиви и химикали, използвани за инактивиране на SARS-CoV-2, както и отстраняването на цитотоксичността на реагента, моля вижте научния доклад на Welch et al. (2020).

Инактивиране на вируси от детергенти – Протокол за инактивиране на коронавирусите от Уелч и др.

ИНАБКТ-CoV-2

За търговските продукти, препарати от вируси (тъканна култура, титри, вариращи от 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ PFU/ml) са били третирани в три екземпляра с реагенти в концентрации и за време на контакт, препоръчани в инструкциите на производителя за употреба, когато са налични, или за концентрации и времена, специално поискани от изпитвателните лаборатории. Когато производителят е посочил диапазон от концентрации, най-ниското съотношение на продукта към пробата е било тествано (т.е. най-ниската препоръчителна концентрация на продукта за тестване). Реактивите за конвент на пробите са тествани, като се използва съотношение от един обем тъканна течност от култура към десет обема реактив, освен ако съотношението на обема на течността за пробата към реактива не е уточнено от производителя. В посочените концентрации за посочените времена са изследвани препарати, фиксати и разтворители. Всички инактивационни стъпки са извършени при стайна температура (18 – 25°C). За тестване на алтернативни видове проби вирусът е вкаран в посочената матрица при съотношение 1:9, след което се обработва с тестови реагенти, както е посочено по-горе. Всички експерименти включват проби от макета, третирани с три екземпляра, с еквивалентен обем PBS вместо реактива за тестване. Непосредствено след необходимото време за контакт, 1 ml от третираната проба се обработва с помощта на подходящо избраната матрица за филтриране. Отстраняването на реагент за изпитване на инактивиране се извършва в по-голям формат на колоната за завъртане с помощта на Pierce 4mL перила за почистване на детергенти (термо рибар), или чрез пълнене на празни проби 10mL центрофугирани колони (Термо Рибар) с SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR или Sephadex LH-20 да даде 4mL опаковани мъниста / смола. За пречистване с помощта на филтри Amicon 2 × 500 μl проби се пречистват с помощта на два центробежни филтъра по описания по-горе метод, след което се обединят. За формалдехид и формалдехид с отстраняване на глутаралдехид, един филтър е бил използван с 1× 500μl проба обем, resuspended след обработка в 500μl PBS, и добавя към 400ul MEM/ 5% FBS. За инактивиране на инфектирани монослойни, 12,5 см² колби на vero E6 (2,5 × 10⁶ 2,5 ml MEM/5% FBS) са инфектирани при МВР 0,001 и инкубират при 37°C/5% CO₂ 24 часа. Supernatant е отстранен, и клетки фиксирани с помощта на 5mL формалдехид, или формалдехид и глутаралдехид при стайна температура в продължение на 15 или 60 мин. Фиксативът се отстранява и монопласти се измиват три пъти с PBS преди да остъргват клетките в 1mL MEM / 5% FBS и с ултразвук (3 × 10 секунди, 10 секунди за изключване при 100% мощност и амплитуда) с помощта на UP200St с прикачен файл VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатантите се избистрят чрез центрофугиране при 3000 × g в продължение на 10 минути.

Подробности за реактива, използван за инактивиране на SARS-CoV-2 с ултразвуков VialTweeter съгласно протокола от Welch et al. 2020

Пълният протокол, включително използването на Hielscher VialTweeter може да се намери тук:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Сложни ултразвукови Dismembrators и клетъчни разрушители

Многократният ултразвуков ултразвукОвуеър е само един от многото ултразвукови решения за подготовка на проби в биологични, биохимични и клинични лаборатории. Hielscher Ultrasonics предлага идеален ултразвуков dismembrator за вашето приложение, например клетъчен лизис, клетъчна екстракция, тъкан хомогенизиране, разтворимост на лизат, разтваряне, дегазация на пробата и т.н.
Кажете ни колко проби трябва да обработвате на час и ден, ако предпочитате директна или индиректна обработка и каква е целта на ултразвуковата обработка на пробите. Ще ви препоръчаме най-подходящата ултразвукова единица за ежедневната ви работа!
Hielscher Ultrasonics' цифрови ултразвукови процесори са оборудвани с интелигентен софтуер, автоматично записване на данни, лесни опции за настройка на температурата, продължителност на ултразвук, режим цикъл / импулс, както и проба осветление и дистанционно управление на браузъра. Ние се стремим да направим нашите ултразвукови устройства възможно най-умни, така че вашите изследвания и работа рутинна да стане възможно най-удобно и успешно.
Кликнете тук, за да намерите повече приложения, включително протоколи за ултразвукова подготовка на пробата с VialTweeter!